Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Bu çalışmalar Alternatif Araştırma ve Geliştirme Vakfı (107.588), Ulusal Sağlık Enstitüsü (1U54CA136465-04S1) ve Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Programı (201B-0141) hibe, kısmen finanse edildi. Biz Dr teşekkür ederim. Cömert bağış için Andrew Wilber ve R. Scott McIvor onların <pkt2 lubig=""> transponson ve pKa / hUbiC-SB11 transposaz plazmidler. Biz minnetle John Tamaresis, Ph.D. kabul istatistiksel yöntemler tavsiye için, Timothy Brown flow sitometri gerçekleştirmek için, göçler tahliller tavsiye için Georgette Henrich, Nancy Bellagamba için THR örneklerinin koleksiyonu kolaylaştırılması. </pkt2>

Femur başları Stanford Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Ortopedi Bölümü&#39;nde seçmeli THR ameliyatı geçiren hastaların toplanmıştır. Tüm dokular Stanford Üniversitesi Araştırma Uyum Ofisi düzenlemelerine uygun olarak de tanımlanan örneklerin olarak toplanmıştır. 1. Bir Meme Kanseri Hücre Hattı (ler) seçilmesi <ol><li> Elde edilir ya da bir lusiferaz-GFP raportör yapısı ile, istenen göğüs kanseri hücre çizgisi (ler) transfekte. Aşağıdaki deneyler, uyku güzellik transpozon plazmid pKT2 / LuBiG ile transfeksiyon ile MDA-MB-231 ve MCF-7 göğüs kanseri hücre çizgileri ateşböceği lusiferaz dengeli bir şekilde ifadesi için tasarlanmış (Fluc) ve gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) kullanılarak gerçekleştirilmiştir transposaz plazmit pK / hUbiC-SB11 45,46. Not: Transfekte edilmiş hücre çizgileri MDA-MB-231-Fluc-EGFP ve MCF-7-Fluc EGFP olarak adlandırılır. </li></ol> 2. Ayırma Doku FFemoral Heads ragments <ol><li> THR ameliyatları sonrası, fizyolojik tuzlu su ile dolu bir steril kap içinde atılır femur başı toplar. Laboratuvara numune aktarın ve cerrahi 1-3 saat içinde işleme. Not: işlemede bir gecikme varsa, 4 ° C&#39;de örneği yerleştirin. </li><li> Deneyin her türü için aşağıda belirtilen şekilde steril eldiven, cerrahi rongeur, forseps, beher% 70 izopropanol ile aletleri, ve doku kültürü gemiler durulama: laminer akış doku kültürü kaputu emici mat aşağıdaki öğeleri yerleştirerek bir çalışma alanı hazırlayın . </li><li> Bir steril cerrahi eldiven giyen, bir yandan yuvarlak femur başını tutun femur maruz üst şaft istenen boyutta (~ 2-5 mm) trabeküler kemik parçaları ayıklamak için, diğer elinde rongeur kullanmak için. Kültür kabı içine kemik parçaları transfer (örneğin, 6-, 12, ya da doku kültürü plakası, veya geçiş bölmesi 24-çukurlu), proliferasyon türüne bağlı olarak, sütunonization veya göç deneyi, adım 3, 4 veya 5&#39;te tarif edildiği gibi. NOT: Her özel proliferasyon, kolonizasyon veya göç deneyi için ilk adımları tamamlandıktan sonra yukarıda tarif edildiği gibi kemik dokusu parçaları hasat edilmesi. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, parçalar, boyut aralığında değişecektir. Fragmanları önce ya da standart amacıyla deneyler sonra tartılır edilebilir. </li></ol> Kemik Fragments bitişiğinde 3. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri BLI kullanma Meme Hücre Proliferasyonunu Tedbir <ol><li> Önceki deneyden 2 x 10 5 meme kanseri hücre / 50 ul ihtiva eden bir süspansiyon hazırlamak ve kültürde kemik parçaları hareketsiz tutmak için kemik mumu fişleri hazırlayın. 3 parçaya P200 mikropipet ucu kesin ve kemik mumu küçük (~ 35 mg) adet kesmek için bir &quot;çerez kesici&quot; bir şekilde büyük parçanın dar ucunu kullanın. Petri kabı içine kemik balmumu fişlerini çıkarmak için küçük parçanın geniş ucunu kullanındepolama için. </li><li> Her kuyunun 00:00 pozisyonunda kemik balmumu bir parça koyun ve yavaşça bir steril eldivenli işaret parmağı ile bastırın. </li><li> Pipet, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğun merkezinde, DMEM,% 10 FBS + Pen-strep 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 50 ul. (Alternatif olarak, arzu edildiği takdirde dağınık bir biçimde tohum hücreleri.) Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li><li> Her deney kuyu için kemik mumu 1 parça üzerine 1 kemik parçasını yerleştirin ve sabitlemek için ronjur ile hafif basınç uygulayın. Alt üç kuyu sadece kontroller olarak kemik mumu ihtiva ederken, belirli bir THR örnekten şekilde 3 kemik parçaları ilk üç kuyular yerleştirilir üç nüsha olarak deneyleri. </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, yumuşak ve yavaş meme hücreleri veya kemik parçaları yerinden ayrılmasını önlemek üzere, her bir yan DMEM% 10 FBS, 5 ml sağlar. 37 plaka koyun76, 20-24 saat süre ile C doku kültürü kuluçka makinesine kondu. </li><li> Biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek için (BLI) inkübatör plaka çıkarın ve her bir oyuğa (300 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için) lusiferin substratı ilave edin. Görüntü aşağıdaki parametreleri kullanarak bir IVIS Görüntüleme Platformu&#39;nda hemen plaka: 1 f-stop, küçük binning, 1 sn pozlama süresi, seviye D sinyal her yoğunluğunu sıra ortalama parlaklık (fotonlar / saniye / kare santimetre / Tedbir steradyan). </li><li> Tüm deney ve kontrol kuyuları için ortalama parlaklık ölçmek için İlgi (ROI) Bölgeleri tanımlamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Bir Excel sayfası İhracat ortalama parlaklık değerleri istatistik gerçekleştirmek ve grafikler oluşturmak için. </li></ol> Kemik Fragments üstüne Doğrudan Tohumlu 4. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri Kolonizasyon ve Hücre sayısı Eğitim için <ol><li> 24-çukurlu doku kültürü plakasının boş kuyu doğrudan kemik parçaları yerleştirmek (1 fragmanı / çukur) için forseps kullanır. </li><li> Ölmekdoğrudan her bir kemik parçasından en 1 x 03-06 Ekim meme kanseri hücreleri içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık ette. Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun. Yavaşça parçası tamamen ortam içine, her bir sıra bu yan içine 1-2 mi DMEM,% 10 FBS ekleyin. 20-24 saat süreyle 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, her bir çukura 1 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir taze 24-yuvalı plaka her bir kemik dokusu fragmanı aktarmak için forseps kullanır. BLI gerçekleştirmek için, adımları 3,6-3,7 yukarıdaki izleyin. Buna ek olarak, parçalar, bir floresans mikroskobu kullanılarak izlenebilir ya da aşama 6&#39;da tarif edildiği gibi, meme kanseri hücresi sayısı ve özelliklerinin analizi için iliği popülasyonu elde etmek için yıkanır olabilir. </li><li> BL, pipet floresan bifosfonat etiketleme çözümü 5 ul (ön aşağıdaki floresan mikroskobu ile kalitatif değerlendirme için sağlam parçaları hazırlamak içinKemik parçalarının mineralize spikülleri etiketlemek için, her bir oyuğa) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre düşüktü. Bir 24 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka inkübe edin. </li><li> Floresan bifosfonat etiketleme çözeltisi içinde kültür 24 saat sonra, görüntü GFP (485 nm) ve bisfosfonat etiketin (680 nm) için yapılandırılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak fenol kırmızısı içermeyen ortam ve görünümü içeren bir doku kültür plakalarına fragmanları aktarmak için forseps kullanır. </li></ol> 5. Kemik Doku Fragments ve kültürlü Kemik Parçası süpematantlan için Meme Kanseri Hücreleri Göç Ölçme <ol><li> Kemik doku kültürü süpernatant doğru göç. Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 süpernatantlar oluşturmak için kullanılır. Her deney için, göç kemik süpernatanlan vs kontrol ortamını yalnızca içeren üç kuyu içeren üç kuyu boyunca karşılaştırılır. <ol><li> Kemik tis oluşturunoyuk başına 2.2 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir 12 gözlü bir levhanın gözleri içine kemik parçalarının yerleştirilmesi ile süpernatantlar dava. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde kültürü. 24 saat sonra ortam çekin ve 2.2 ml taze DMEM,% 10 FBS ile değiştirin. DMEM-10% FBS aynı şekilde içeren sağlıgı kontrol kuyuları. NOT: düşük operasyon sonucu meydana gelen doku travmasının yanıt olarak salgılanan faktörler kaldırmak için 24 saat sonra değiştirildi. Kemik dokusu üzerinde yüzer durumda kısımlar oluşturulacak için sadece meme kanseri hücre göçü FBS katkıları için kontrol edilmesi için dahil edilir FBS içeren ortam içeren ortam, kuyu FBS ihtiva eden. </li><li> 48 saat sonra, bir alıcı plakanın oyukları içinde her bir süpernatan / kontrol ortamı ve pipet 0.9 ml toplar. ekler sonra bu kuyulara alınacaktır. Uçlar, tohumlama sırasında doku kültürü kuluçka makinesi içinde alıcı plaka inkübe edin. Not: Kalan supernatant (~ buharlaştırmadan sonra 1 mi) secretome fiili analizi için toplanabilirrs eğer 44 istenilen. </li><li> Transwell tohum için, standart bir boş 24 oyuklu doku kültürü plakası içine yerleştirin. Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, her bir ek üst, iç zar yüzeyi üzerine DMEM% 10 FBS içinde, 1 x 10 5 meme kanseri hücreleri ihtiva eden Pipet 350 ul hücre süspansiyonu. Eki teşvik etmek için 45 dakika süreyle 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde tohumlanır ekler ihtiva eden 24 oyuklu plaka koyun. </li><li> Hücreler ekler taşıyabilir sonra, imalatçının talimatlarına göre alıcı plaka ekler aktarmak için forseps kullanır. Açı eklemek zarında ve iyi yüzer madde alıcı arasındaki kabarcık oluşumunu önlemek için de alıcı içine yerleştirerek her ekleme. 37 ° C&#39;lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 20 saat ekler ile alıcı plaka inkübe edin. NOT: insert membran ve iyi supernatan alıcı arasındaki kabarcıklar için alıcı plakasının alt tarafını kontrol edint. Kabarcıklar görülebilir iseniz, belirli ekler kaldırmak ve hiçbir kabarcıklar mevcut olana kadar iyice alıcı içine tekrar yerleştirin. </li><li> 20 saat kullanım forseps sonra alıcı plaka ekler kaldırmak için. Adımda prosedürler kullanılarak 3.6-3.7 görüntü içine göç ve alıcı plaka kuyuların dibine bağlı olan hücreleri BLI gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> Kemik doku parçaları doğru göç. Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 ayrı uçlar yerleştirilir ve 3 cam tanesi, kontroller olarak, 3 ayrı uçlar yerleştirilir. <ol><li> Her kuyuya 0.9 ml DMEM-10% FBS pipetleme alıcı plaka hazırlayın. Ekler hazırlanırken doku kültürü kuvöz içine yerleştirin. </li><li> Ekler tohum, bir kapağı olan plastik bir tüp mikrofuge&#39;ye kutusunun yüzeyinde onları ters çevirin. 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri d içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık Pipetirectly (ters ekler üzerinde yukarı baktığından) Her ekleme zarının dış, alt yüzeye. Kapaklı mikrofuge&#39;ye tüp kutusu açık kırık Kapak ve hücre eki teşvik etmek 45 dakika için 37 ° C doku inkübatör aktarın. </li><li> Doku kültürü kaputu mikrofuge&#39;ye tüp kutusunu aktarın ve sağ tarafı yukarı numaralı seribaşı ekler açmak ve alıcı plaka kuyu içine aktarmak için forseps kullanabilir. Her ekleme kabına Pipet 0.450 ml DMEM-% 10 FBS. Forseps kullanarak, her hazırlanmış ekleme fincan içine bir kemik dokusu fragmanı (~ 3 mm) aktarın. İsteğe bağlı olarak, ek bir kuyu cam boncuklar negatif kontrol olarak kullanılır. 20 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun. </li><li> Migrasyonun ölçülmesi için, oyuk başına 1 mi DMEM,% 10 FBS ihtiva eden bir standart 24 oyuklu doku kültürü plakası hazırlanır. Inkübatör alıcı plakasını çıkarın ve standart plaka ayrı kuyu içine her birinden eklemek kemik parçaları ve boncuk aktarmak için forseps kullanabilir. Lüsiferin eklealt-tabaka her oyuğa (300 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için) ve adım 3.6-3.7 prosedürleri kullanarak BLI gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Ek öncesi ve sonrası deneysel Analizleri <ol><li> Kızarmış iliği analizi. <ol><li> 50 ml konik tüp üst yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden içine bir kemik parçası aktarın. Kuvvetli bir şekilde konik bir tüp içinde kemik iliği hücreleri, bir süspansiyon elde etmek için, 10 ml PBS ile bir parçasını temizlemek için bir 25 G iğne ile 10 ml&#39;lik bir şırınga kullanın. Santrifüj hücre süspansiyonu 300 xg&#39;de 3 dakika, 21 ° C, süpernatan aspire ve PBS içinde pelet hücreleri ya da akış sitometrisi için istenen diğer bir çözüm yeniden süspanse edin. Not: Tekrar süspansiyona, miktarlar santrifüj ve uygulamadan sonra hücre peleti boyutuna bağlı olarak değişir. </li><li> Canlılık analizi için PBS ~ 75-300 ul hacim ticari olarak temin edilebilen fluorescenc kullanılarak uygun olan ve bu süspansiyonlar analiz edilebilire göre canlılığı testleri, imalatçının talimatlarına uygun olarak, geleneksel bir hemasitometre pipetlenir ve bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak sayılmıştır. </li><li> Akış sitometrik analizi için ya da GFP-pozitif göğüs kanseri hücrelerinin saptanması göre ayrılması,% 2 FBS, 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml PBS içinde hücre topağı tekrar süspansiyon ve 10 konsantrasyon 1 x 10 6 hücre / ml mM HEPES, öyle ki. </li></ol></li><li> H &amp; E Boyama ve İmmünhistokimya. <ol><li> Hematoksilin ve eosin (H &amp; E) boyama ve / veya immünohistokimya için fragmanları işlemek için, bir dizi 2 kalemle etiketlenmiş plastik kasetlerinde fragmanları yerleştirin ve 24 saat süre ile,% 10 tamponlu formalin ile dolu bir kap içinde daldırın. </li><li> Parafin gömme için proses dokular, kesit ve her fragmanında mineralli spikülleri hesabını bir Dekalsifikasyon aşamasını içerir rutin protokoller kullanılarak boyanan. </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

Mehra ark., Daha önce yüksek kaliteli dokuları ortaya ve metastatik süreci 47 çalışma, insan kemik örneklerinin kullanımını doğrularken, otopsi sırasında hasat metastatik prostat kanseri hastalarından alınan postmortem toplama ve kemik örneklerinin analizi tarif var. Burada, toplama, işleme ve meme hücre göçü, kolonizasyon ve çoğalmasını incelemek için kısa vadeli bir ko-kültür sisteminde THR cerrahi sonrası atılır femur başları elde edilen insan kemik doku parçaları kullanarak protokolleri tarif var. Yaklaşık 300.000 kalça protezi ameliyatları ABD (Amerikan Ortopedik Cerrahlar Akademisi, Orthoinfo.aaos.org) yılda yapılır, ve bu örneklerin genellikle atılır. Bu ameliyat için en sık endikasyonlar biri eklem ağrısı neden femur başını örten kıkırdak yüzeylerinin kademeli bozulmasına yol açar, kalça ekleminin osteoartrit olduğunu. Total kalça replacem sırasındaent cerrahisi üst femur küçük bir kısmı femur başı ile birlikte kaldırılır. Femur meme kanseri metastazı 48 ortak yer ve bu numuneler trabeküler kemik dokusu, metastatik meme hücre kolonizasyon siteyi içerirler. Kalça protezi geçmesi Hastaların çoğu, zirve meme kanseri insidansı yıllar braketleri bir yaş aralığı 50-80 yaşında. Böylece, bu dokular meme kanseri kemik metastatik niş çalışmak için değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu teknikler ile ilişkili çeşitli kritik adımlar ve düşünceler vardır. İlk olarak, kaliteli cerrahi ronguer karşısında, eldivenli el femur başını tutarken küçük trabeküler kemik parçaları ayıklamak için gereklidir. Onlar mineralli spikülleri içeren trabeküler doku çıkarmak için yeterince sağlam değil çünkü Forseps çalışmaz. Bu analizlerde diğer önemli husus göğüs hücre çizgisi işleme ve pasajlayarak, özellikle güney ilgilidirgöç deneyleri ile ilgili olarak likle. Trypsinization prosedürleri Uzun vadeli geçit ve / veya değişkenliği potansiyel deneylerde göçmen yanıtları değiştirerek, fazla / az inatçı hücre popülasyonlarının sıralı seçime neden olabilir. Başka bir konu, farklı yaş ve hastalık durumlarının hastalardan elde edilen cerrahi dokuların değişkenliği göz önüne alındığında, deney standardizasyonu ile ilgilidir. Bu adres için, biz bütün değişkenlerin üç kez test edildiği bir içi-denekli deneysel tasarım istihdam (örneğin, üç fragmanları / deneysel kuyuları vs üç fragmanları / kontrol kuyuları arasında) belirli bir hastanın cerrahi örnekten parçaları kullanarak. Değişkenler birden hastalardan alınan örnekler üzerinde bu tasarım kullanılarak test ve veri çoğaltır üzerinden ortalama için eşleştirilmiş T testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık için analiz ve / veya içinde-konular tek yönlü ANOVA çoğaltır üzerinden veri olabilir. Ve son olarak, bu yöntem bir birinci sınırlama viab kısa pencereeksplant kültür sırasında ility. Bizim ölçümler kemik iliği aspiratları 49 elde edilen canlılık ölçümleri doğrultusunda, toplama gününde% 90 ~ iliği canlılığı ortaya çıkardı. Mineralize bölmenin canlılığı ölçülen olmasına rağmen zaman içinde, ancak, biz gün 6 tarafından canlılığı dramatik kaybı ile, gün, iki ve üç kademeli bir düşüş gözlenir, nitel gözlemler canlılığı benzer bir düşüş olduğunu göstermektedir Şekil 4D&#39;de görüldüğü gibi, kemik-astar osteoblastlar ve osteosit. Bu deneylere dayanarak, biz 48 veya 72 saat boyunca yapılan kısa vadeli çalışmalar bizim kültür deneyler sınırlıdır. Ön deneyler (dahil değildir) canlılık iliği hücreleri sürdürmek için formüle piyasada mevcut medya kullanılarak geliştirilmiş olabileceğini belirtti. Ancak biz bu deneylerde iliği hücre popülasyonları karakterize değil, ve bilmiyorum seçilen gelen geliştirilmiş canlılığı sonuçlarıBelirli iliği hücre alt akıbet. sürdürmek ve bu eksplant canlılığı uzatmak için protokollerin geliştirilmesi, bu model sistemi ilerlemek için önemli olacaktır. Izlemek için kemik mikroçevresinin, 2) erişilebilirlik, insan kemik mikroortam oluşturan ilgili hücre tiplerini barındıran 1) bozulmamış 3 boyutlu dokuları: Bu model, kısa süreler ile sınırlı olmasına rağmen, diğer yöntemlere göre anahtar avantajları aşağıdaki özellikleri içerir ve müdahaleci dinamik etkileşimler, 3) çoğaltmak deneyler için numune başına parçalarının yüksek numaraları ve 4) düşük maliyetli hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında. Kemik, meme kanseri metastazı incelemek için deneyler tarif etmiş bulunmakla birlikte, bu örnekler ve yaklaşımlar hali hazırda prostat kanseri ve aynı zamanda diğer kemik patolojilerinin gibi diğer kemik arayıcı malignitelerin çalışma uzatılabilir. Biz böylece öncelikle atılan femur başlarını kullanmış olsa dadoku parçalarının urce, bu örnekleri de geleneksel genç gönüllülerden kemik iliği aspirasyon yoluyla toplanan insan kemik iliği, ek bir kaynak oluşturmaktadır. Biz biyolüminesans ve floresan için işlenmiş hücre çizgileri kullanılarak yaklaşımlar tarif ederken, bu hücre hatları ve / veya görüntüleme platformları mevcut değilse Son olarak, birçok prosedürde diğer hücreler ile birlikte kullanılmak üzere modifiye edilebilir.

tümör mikro yaygın meme kanseri ilerlemesi ve metastatik sırasında kanser hücresi davranış kritik belirleyicisi olarak kabul edilmektedir 1-3 yayıldı. Burada sunulan yöntemin amacı, insan kemik dokusundan, göğüs kanseri metastazı 4-6 en sık site mikro-içinde, meme kanseri hücrelerinin çalışma kolaylaştırmaktır. Kemik metastatik ilerlemesi 10,11 sorumlu hücreler ve salgılanan faktörler barındıran her ikisi de mineralize ve iliği bölümlerinin 7-9 oluşur. Yaygın in vivo fare modellerinde kullanılan rağmen metastatik sürecinin 12-15 sistemik çalışmalarını kolaylaştırmak, iskelet içinde hücre etkileşimleri gözlem ve doğrudan pertürbasyon için kolayca erişilebilir değildir. Eğitim ve fare kemik dokuları ve fare kemik iliği hücreleri kültür Model sistemleri daha iyi erişim sağlamak ve meme kanseri hücre m altında yatan birçok karışma ilgili anlayışlar ve mekanizmalar vermiştirMurin iskelet 16-22 etastasis. Ancak, çalışmalar kemik dokusu 23,24 için osteotropism ve türe özgü desenleri olabileceğini düşündürmektedir. Bu modeller, kemik muhtemel belirleyiciler hepsi doğal türe özgü kemik dokusu özelliklerindeki farklılıklardan, bağışıklık-eksikli fareler 11 değiştirilmiş kemik iliği popülasyonlardan elde edilen farklar, ve / veya deneylerinde kullanılan fareler nispeten genç yaş, yansıtabilir mikroçevresinin. In vitro olarak, tipik haliyle, kemik iliği türevli osteoblast veya tek katmanlar olarak kültür stromal hücreler olarak ya da genetik mühendisliği 3 boyutlu model sistemlerinde 25-35 içinde belirli kemik hücre tipleri üzerinde odaklanmıştır insan kemik eş kültürlerinde meme kanseri hücreleri incelemek için yaklaşımlar. 2-boyutlu hücre kültürü modelleri, in vitro dayanak oluşan kanser araştırmaları için yaklaşımlar var olsa da, uzun hücre davranışı temelde m değiştirilmiş olduğu kabul edilmiştirkültür sistemleri 18,36,37 onolayer. Bu matris ve kolajen gibi doğal malzemelerden oluşan iskele tabanlı modelleri dahil olmak üzere 3-boyutlu bir oturma dokuların karmaşıklığı taklit eden, işlenmiş mikroçevrelerde gelişmesine yol açmıştır ya da sentetik polimerler, doku gibi mikroçevrelerde oluşturmak için özel hücre tipleri ile tohumlandı 36-41. Engineered yaklaşımlar da kontrol ve mikroçevresinin 18,19,41-43 hormonal ortam çalışma biyoreaktör platformlarının kullanımı dahil ettik. Biomimetik modelleri ve biyoreaktörler kontrollü bir ortamda kompleks doku çevresinde birçok unsuru sağlar ve başarılı kemik 18,19,35,42,43 meme kanseri metastazı çalışma önceden uygulanmış olsa da, işlenmiş model sistemler, genel olarak yapılmasına olanak vermemektedir doğal kemik ortamında mevcut hücre tipleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin tam spektrum. Yakın zamana kadar, göğüs kanseriHücreler, insan kemik dokularının yerli, bozulmamış, 3-boyutlu mikroçevresinin içinde çalışılmamıştır. Biz son zamanlarda (THR) ameliyatı 44 örneklerinde total kalça protezi izole insan kemik doku parçaları kullanarak bir ko-kültür modelinin gelişmesini bildirdi. Bu örnekler hem kısa vadeli kültüründe mikro-metastazı altında yatan mekanizmaları incelemek için gerekli mineralizasyon ve kemik iliği bölmeleri liman. Önceki çalışmada, kemik parçaları 44 ile (MDA-MB-231-Fluc) ko-kültür lusiferaz sentezleyen meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını izlemek için biyoışıldama görüntüleme (BLI) kullanılarak kanıtını prensip oluşturmuştur. Burada insan kemik dokusu eksplantlarındaki yerli mikroçevresinin kapsamında meme kanseri hücre çoğalmasını, kolonizasyonu ve göç çalışmak için deneysel protokolleri ayrıntılı bulundular. İlk olarak meme ölçmek için kemik parçaları bitişik eş-kültürleme göğüs kanseri hücreleri için bir protokol mevcutBLI kullanarak hücre çoğalması. Bu bölümde, meme hücresi süspansiyonları, kemik mumu parçaları ile hareketsiz hale kemik parçaları, bitişik 6 oyuklu plakalar içinde hücre noktalar olarak tohumlanır. Kontrol kuyuları, kemik mumu, ama hiçbir kemik fragmanı içerirler. Hücre noktalar eklemek sonra, orta eklenmiş ve plaka BLI ile ölçülür biyolüminesens sinyal yoğunluğu (hücre sayısı ile ilişkili) sonra 24 saat için kültüre edilir. Bir sonraki adımda, kolonizasyonun ve çoğalmanın çalışma kemik parçalarının doğrudan ekilmiş ko-kültür göğüs kanseri hücreleri için yöntemler sunar. İşte meme hücre süspansiyonları kolonizasyonu ve hücre sayısını izlemek için zamanla BL ve floresan mikroskobu ile kültüründe izlenir kemik doku parçaları, doğrudan pipetlenir. Bu yöntemde, kemik iliği bölme akış sitometrisi ile kolonize göğüs kanseri hücrelerinin analizi için her zaman noktasında kemik parçaları temizlendi, ya da ilik canlılığı deneyleri edilebilir. Buna ek olarak, elimizdeki deMeme kanseri hücre göçü ölçmek için kâtip, iki farklı yaklaşım. İlk yöntemde adım kemik dokusu kültür yüzer doğru göç ölçülmesi için özetlenmiştir. Transwell iç üst yüzeyleri bir 8 um gözenek büyüklüğüne sahip membranlar eklemek üzerine (Şekil 1A &#39;da gösterildiği gibi), bu protokolde, göğüs kanseri hücreleri tohumlanır. Ekler daha sonra kemik dokusu süpernatan ya da kontrol ortamı içeren oyuklara sahip bir alıcı plaka içerisine yerleştirilmiştir. 20 saatlik bir bekletme sürecinden boyunca, meme kanseri hücrelerinin az sayıda aşağı bunlar BLI tespiti için eklemek alt doku kültür kuyu içine sokma zarları içinden yer değiştirmektedir. İkinci geçiş yöntemde meme kanseri hücreleri Transwell uç zarların alt dış yüzeyleri üzerine ekilir. Kemik dokusu parçaları uç bardak içine yerleştirilir ve göğüs kanseri hücreleri (Şekil 1 B &#39;de gösterildiği gibi), kemik parçaları kolonize zarlanndan taşınmalarısonra BLI kullanarak görüntülü.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Supplement all McCoy&#039;s&amp;nbsp; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&amp;nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Supplement media used for transfected cell lines.</td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &amp;mu;m pore size)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 70 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Bone wax</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Imaging Platform</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&amp;nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>Version 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Kemik meme kanseri metastazı en sık sitedir. Yaygın mikroçevresinin etkiler kanser hücresi davranışı kabul edilmesine rağmen, çok az insan kemik dokusunun doğal mikroçevresinin içinde meme kanseri hücre özellikleri ve davranışları hakkında bilinmektedir. Biz, izlemek ölçmek ve mikro-içinde insan meme kanseri hücrelerini modüle yaklaşımlar geliştirdik Total kalça protezi ameliyatları takip atılır femur başları izole kültür, insan kemik doku parçaları. Meme kanseri hücrelerini lusiferaz için tasarlanmış ve yeşil floresan protein (EGFP) ifade gelişmiş kullanarak, tekrarlanabilir sonra meme hücreleri floresan mikroskopi kullanılarak kemik parçaları içinde biyolüminesans görüntüleme kullanılarak göç ve çoğalması desenleri (BLI), parça hücre etkileşimleri ölçmek ve değerlendirmek mümkün Akış sitometrri ile kolonizasyon. Bu modelin temel avantajları şunlardır: 1) bir yerli, mimari sağlam doku microeilgili insan hücre tiplerini içerir ve hızlı nicel ve nitel izleme ve meme ve kemik hücre özellikleri, davranışları ve etkileşimleri pertürbasyon kolaylaştırır mikroçevresinin, 2) doğrudan erişim bütünlüklü. Birincil sınırlama, şu anda, kısa vadeli kültürüne çalışmanın pencere sınırlandırmaktadır doku parçalarının, sonlu canlılık olduğunu. Model sisteminin uygulamaları metastatik niş içinde meme kanseri ve diğer kemik arayan maligniteler temel biyoloji okuyan ve etkili bir kemik dokularında meme kanseri hücrelerini hedef tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bulunmaktadır.

Femoral Heads Doku Fragments Yalıtımlı Femur başları erkek ve Stanford Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Ortopedi Bölümü&#39;nde seçmeli total kalça protezi ameliyatı geçiren kadın hastalarda (yaş 44-90 yıl) eşit sayıda toplanmıştır. Her atılır femur başı mineralli spikülleri ve kemik iliği oluşan trabeküler kemik dokusu barındıran üst femur, küçük bir bölümünü içerir. Bu doku küçük parçalar elde etmek için cerrahi bir rongeur kullanılarak mil (Şekil 2A) ve cerrahi olarak açığa kesiti üzerinden erişilebilir. ekstre adet histoloji mineralli ve kemik iliği bileşenlerini ortaya, Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir. Şekil 2C&#39;de gösterildiği gibi, ekstre parçaların görünümü iliği adiposit içeriğine bağlı olarak, sarıdan kırmızıya kadar farklı hastalardan elde edilen femur başı, arasında değişmektedir. WE lusiferaz ve EGFP ekspresyonu için tasarlanmış, göğüs kanseri hücrelerinin dinamik etkileşimleri ölçmek için kısa süreli deneylerde bu kemik doku parçalarının kullanımını göstermektedir. Bitişik Kemik Fragments için ortak kültür Meme Kanseri Hücreleri Biyoparlaklık Görüntüleme kullanarak Meme Hücre Proliferasyonunu Tedbir BL ile göğüs hücresi çoğalmasını ölçmek için hareketsiz kılınmış kemik parçaları bitişik ko-kültür, MDA-MB-231-Fluc EGFP göğüs kanseri hücreleri için kültür levhası ayar Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. Kemik parçalarının olmaması Şekil 3C&#39;de gösterilmiştir vs 24 saat sonra plaka BLI mevcudiyetinde artmaktadır hücre çoğalmasını gösteren, 3 deney için BLI sinyal, Şekil 3B&#39;de gösterilen, ve. Kemik Fragments doğrudan Tohumlu ortak kültür Meme Kanseri Hücreleri Kolonizasyon ve Hücre sayısı Eğitim için MCF-7-Fluc EGFP c kolonizasyonuŞekil 4A&#39;da gösterilen 24 saat sonra BL ile ölçülen arşın azalan tohum ekme yoğunluğu kaynak ile ilişkili bir sinyal azalma gösteren kemik doku parçalarının doğrudan ekildi. Bir doğrudan-tohumlu parçası olarak minerallenmiş ve iliği bölümlerinin içinde, meme kanseri hücrelerinin kolonizasyonu ortaya çıkarmak için floresan mikroskobu ile görüntülenmiş olarak, floresan biphosophonate bir reaktif ile etiketlendikten sonra, Şekil 4B&#39;de 48 saat sonra gösterilir. Bu kolonizasyon modelleri de sitokeratin antikor (Şekil 4C ve 4D) ile immünohistokimyasal boyama sonrası deneysel işlenmiş doğrudan numaralı seribaşı parçalar halinde ortaya çıkar. Kemik Doku Fragments ve kültürlü Kemik Parçası süpematantlan için Meme Kanseri Hücreleri Göç Ölçme Kemik doku kültür yüzer doğru ve kemik parçaları halinde gözenekli göç membranlar boyunca MDA-231-Fluc-EGFP hücreleri Göç B ile tespit edilirŞekil 5&#39;te gösterildiği Ll gibi belirli bir THR numunenin üç fragmanlarından türetilmiş kültür süpernatanları karşı sağlam bir geçiş model kontrol ortamı genel kemik dokusu süpernatan içeren kuyu içine göç artış göstermektedir Şekil 5A, &#39;de gösterilmiştir. Tüm göç yolları olmasına rağmen kemik süpernatantlarından doğru bu sağlam, göçün en deneylerde kontrol ortamı doğru daha tipik büyüktür. Belirli bir THR örnek kemik fragmanlara Tipik geçiş deseni Şekil 5B &#39;de gösterilmiştir. Heyecanlanmış kabaklar analizi Buna ek olarak, kemik iliği hücreleri, kolonize fragmanlarından temizlenebilir olduğunu göstermektedir ve bu kızarmış göğüs kanseri hücreleri akış sitometrisi (Şekil 6B), BL (Şekil 6C), bu hücreler arasında tespit edilebilir, ve / veya floresan mikroskobu (Şekil 6D) . Ölçme Canlılık <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; iliği hücreleri de toplanmasından hemen sonra iliği hücre yaşama kabiliyetinin saptanması için fragmanlarından temizlendi ve deneyler sırasında farklı zaman noktalarında edilebilir. Toplandıktan hemen sonra, ve 24, 48, 72 saat ve DMEM% 10 FBS içinde kültür 6 gün, Şekil 7&#39;de gösterilmiştir sonra 4 THR örneklerden kemik dokusu fragmanlarından ilik hücreleri için tipik Yaşama kabiliyetleri. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52656/52656fig1.jpg" /> Şekil 1: göç deneyleri ayarlayın. &quot;İleri göç&quot; deney (A), alıcı plaka kuyuları daha önce üretilen kemik dokusu kültür süpernatanları ile doldurulur. DME% 10 FBS ihtiva eden uç bardak Transwell membran iç üst yüzeyleri üzerine ekilir meme kanseri hücrelerinin membran boyunca hareket eder ve BL ile tespiti için kuyu altına ekleyin. <stRong&gt; &quot;tersine göç&quot; deney (B), alıcı plaka kuyuları DME% 10 FBS içinde tutuldular ve kemik parçaları ile doldurulur da DME-% 10 FBS içeren uç bardak içine yerleştirilir. Meme kanseri hücreleri uç zarlarının dış alt yüzeyi üzerine ekilir ve BL taze levhalara aktarılır fragmanları kolonize membran ile yer değiştirmesidir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52656/52656fig2.jpg" /> Şekil 2: femur başları doku parçaları Yalıtımlı. (A) cerrahi rongeur kullanarak trabeküler kemik parçaları ayıklanıyor. (B) Histoloji femur dokusundan çekimden hemen sonra sabit parçanın mineralli (beyaz ok) ve kemik iliği (siyah ok) bölmeleri gösteren. (C) Trabekül kemik parçaları iki farklı çıkarılan kırmızı vs sarı kemik iliği içeriği varyasyon gösteren femur başları. <stRong&gt; (A) ve (B) izni 44 ile çoğaltılamaz. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52656/52656fig3.jpg" /> Şekil 3: biyoışıldama görüntüleme kullanılarak göğüs hücresi çoğalmasını ölçmek için kemik parçaları bitişik ortak kültür meme kanseri hücreleridir. (A), ko-kültür oklarla gösterildiği gibi hareketsiz kemik parçaları bitişik, MDA-MB-231-Fluc EGFP meme kanseri hücreleri için kültür plakası ayarı: hücre noktalar (mavi), kemik mumu (siyah), ve kemik parçası (kırmızı ). Kemik mumu konumu da siyah noktalı daire tarafından not edilir. plaka ortamında ilave edilmeden önce gösterilmiştir. ilk 3 kuyu 24 saatte plaka kemik mumu sadece. (B) BLI içeren kemik mumu ve alt üç kuyu gergin kemik parçaları içeriyor. MDA-MB-231-Fluc-EGFP hücreleri için BLI sinyallerin (C) Kantifikasyonu (yokluğunda vs varlığında (mor çubuklar) yeşil çubuklar büyüyen) Açıklandığı gibi THR kültür örneklerinin üç gelen parçalardan. Vs 3 kontrol kuyuları - Her THR numune için, barlar 3 fragmanı içeren genelinde ölçülen ortalama BLI değerleri temsil eder. Bu sonuç, kemik parçalarının yokluğunda genel mevcudiyetinde çoğalma yüksek düzeylerde gösterir. Hata çubukları, standart hatası (p &lt;0.01) göstermektedir. Izni 44 ile çoğaltılmıştır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52656/52656fig4.jpg" /> Şekil 4: kemik parçalarının doğrudan ekilmiş, meme kanseri hücrelerinin saptanması. 24 saat sonra BL ile tespit edildiği üzere kemik doku parçalarının doğrudan ekilmiş, MCF-7-Fluc EGFP hücrelerin (A) kolonizasyon, 48 saat sonra tohumlama ile. Doğrudan tohumlu fragmanını (B) azalan tohum ekme yoğunluğu kaynak ile ilişkili bir sinyal azalması ve göstererek floresan biphosophonate reaktifi ile 24 saat sonrası etiketleme. Floresan mikroskobu EGFP + meme kanseri hücrelerini olarak ortayaBirlikte olan bir mineralize spikül (yeşil ok) ve ilik bölmesi (beyaz oklar) adipoz hücreleri ile. Bu kolonizasyon modelleri de 72 ko-kültür (C) saat ve (D) Aşağıda bir AE1 / AE3 pan-sitokeratin antikoru ile immünohistokimyasal boyama için işlenmiş doğrudan numaralı seribaşı parçalar halinde ortaya çıkar. Ok işaretleri ile gösterilmiştir (C), sitokeratin-pozitif göğüs kanseri hücrelerinde, ilik bölmesi adipositlere bitişik gözlenir. (D) bir sitokeratin-pozitif göğüs kanseri hücresi, bir mineralize spikül bağlı görülmektedir. (C) ve (D) izni 44 yeniden birlikte. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52656/52656fig5.jpg" /> Şekil 5:. Kemik doku parçaları ve kültürlenmiş bir kemik parçası süpernatanları için göğüs kanseri hücrelerinin göçünü Ölçüm Geçiş MDA-MB-231Kemik doku kültür yüzer doğru ve BLI 24 saat sonra tespit kemik parçalarının içine gözenekli göç membranlar boyunca -fLuc-EGFP hücreleri. (A) BLI sinyal belirli bir THR türetilen kültür yüzer doğru göç kontrolü ortamı vs numune gelişmiş ifşa. (B ) tek THR örnekten 3 kemik fragmanlara, meme kanseri hücrelerinin göç modeli sergiler BLI sinyali. Kemik doku parçaları, beyaz noktalı çevreler tarafından ifade edilmektedir. Cam boncuklar ihtiva eden kontrol yuvaları alt gösterilir. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52656/52656fig6.jpg" /> Şekil 6:.. Boşaltılan iliklerin kolonize fragmanlarından temizlendi kabak MDA-MB-231fLUC EGFP hücrelerinin saptanması olmadan (solda), (A) parçalar ve BL ile tespit edildiği üzere (sağ), göğüs kanseri hücreleri kolonize (B) Analiz: f parçalarının (A)Düşük sitometri. EGFP-pozitif meme kanseri hücrelerinin BLI-pozitif fragmanı temizlendi iliği tespit, ama değil BLI-negatif fragmanı. Bir BL-pozitif fragmanı temizlendi iliği kültürü kaynaklanan meme kanseri hücre kolonilerinin (C) BLI algılama. kemik iliği hücrelerinin bir alanda MDA-MB-231fLUC-EFGP hücrelerini gösteren bir BL-pozitif fragmanı temizlendi iliği bölmesinin, (D) Floresan mikroskobu. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52656/52656fig7.jpg" /> Şekil 7:. Canlılığı Ölçüm canlılığı 4 THR izole doku parçalarından ilik hücrelerinin toplanması sonra hemen numune 24, 48, 72 saat ve DMEM% 10 FBS içinde kültür 6 gün. Orta 24 ve 72 saat sonra değiştirildi.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine.  Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir. 

Video: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Kanser Araştırmaları

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Tıp

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Hazırlama ve Analizler<em&gt; İn Vitro</em&gt; Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Biyomühendislik

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Biyoloji

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...