Name: development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines
Uploaded: 2017-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
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SCP2 細胞株を提供するため Yibin Kang とクリスティアーノ ヴァーナ編集者の支援のために感謝したいと思います。

ヒト破骨細胞は、研究に参加する書面による同意を得た健康なドナーの PBMCs から区別されました。1964 のヘルシンキ宣言に敷設された倫理基準に従ってローカル倫理委員会で承認された研究プロトコル。
 1。 破骨細胞分化 注: EDTA で健康的な人間のドナーから末梢血やバフィー コートを収集します。末梢血 20 mL 未満の場合は使用しないでください。彼らは豊富な単核細胞を持っているので、バフィー コートが適しています。滅菌のティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行します。
<ol><li>希釈 EDTA 血中リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 と 1:1。よく再中断します</li>。
	リンパ球分離メディア <li>層 (PBS の血: リンパ球分離メディア、2:1) 50 mL チューブに。
	<ol><li>50 mL のチューブに PBS で希釈した血液の 30 mL のピペットします</li>。
		<li>50 mL チューブの底に 15 mL のリンパ球分離培地を優しくアンダーレイします</li>。
	</ol></li> <li>757 × g で室温 (ブレーキなし) で 10 分間遠心します</li>。
	<li>単核細胞を収集: <ol><li>攪拌なし 5 mL ピペット末梢単核球の白い層を収集し、新しい 50 mL のチューブに配置します</li>。
		<li>希釈 20 mL の PBS で収集した PBMCs</li>。
	</ol></li> <li>、PBMCs の洗浄: <ol><li>225 x g で室温で 5 分間遠心します</li>。
		<li>は、チューブを反転して上澄みを廃棄します。もう一度繰り返します</li>。
	</ol></li> <li>赤血球溶解: 注: 細胞ペレットが赤の場合は赤血球溶解緩衝液で細胞を治療 (材料の表 を参照してください)。
	<ol><li>氷の 50 mL のチューブを入れて</li>
		<li>5 mL の赤血球細胞溶解バッファーを追加します</li>。
		<li>は、赤血球溶解を完了する 3-5 分を待ちます。時間は赤血球汚染の程度に応じて異なります</li>。
		<li>20 mL の PBS の追加によって反作用を停止します</li>。
		室温で 5 分間 225 x <li>遠心 g。チューブを反転して上清を破棄します 。
		注: オプション: RBC 換散を実行する場合洗浄、PBMCs とおり</li>。
	</ol></li> <li>洗浄 PBMCs: <ol><li>部屋の温度で 5 分間 225 x g で 20 mL の PBS の遠心分離機を追加します</li>。
		<li>チューブを反転して上清を破棄します</li>。
	</ol></li> <li>完全な α MEM (1% グルタミン (初期濃度 100 X) と 10% 牛胎児血清を添加した) 内のセルを再停止します</li>。
	<li>は、ノイバウアー室を持つセルをカウントします。
	<ol><li>氷酢酸でサンプル 1: 100 希釈し、希釈の 10 μ L を使用してセルをカウントする</li>。
		<li>の少なくとも 2 倍にカウントし、セルの合計の平均数を収集取得する複製の平均を計算します</li>。
	</ol></li> <li>細胞をプレート: <ol><li>cm 2 あたり 750,000 PBMCs の濃度で細胞をプレートします</li>。
		<li>は 37 ° c 5% CO 2 の大気中でインキュベーターでめっきされたセルを格納します 。
		注: デザイン MCSF または RANKL GFs。 覚えている少なくとも 3 技術でそれぞれの条件を実行することがなく通常の完全な α-MEM で扱われている細胞である否定的なコントロールを含むように実験をレプリケートします。少なくとも 3 生物の複製を実行します</li>。
	</ol></li> <li>GFs を添加した培地を変更: <ol><li>細胞播種後約 3 時間を待ってから、破片、未接続の細胞および赤血球を破棄するピペット (200-1,000 μ L) でメディアを削除します 。
		注: する細胞の剥離を避けるために媒体を変更するときは注意してください</li>。
		<li>新しいの完全な α の MEM が 20 ng/ml の MCSF の補足を追加 (500 μ L/ウェル). 
		注: ときに癌細胞と共培養、種子がん細胞 PBMC 播種後日</li>。
	</ol></li> <li>メディアの変更をすべての 2-3 日 (α-MEM 20 ng/ml の MCSF の補足): <ol><li>200-1,000 μ L ピペットで培地を除去</li>。
		<li>200-1,000 μ L ピペットで追加新しい培</li>。
	</ol></li> <li>セルは, 播種後 6-7 日追加 20 ng/mL の RANKL の完全な α-MCSF + MEM</li>。
	<li>媒体を変更 (完全な α-MEM + MCSF + RANKL) ごとに 2-3 日間: <ol><li>200-1,000 μ L ピペットで培地を除去</li>。
		<li>は、200-1,000 μ L ピペットで新しい媒体を追加します。分化誘導細胞播種後 14 日間を停止します</li>。
		<li>破棄中、PBS で 2 回洗浄します</li>。
	</ol></li> <li>パラホルムアルデヒドとセルを修正: <ol><li>乾燥するセルのままにします</li>。
		<li>4% パラホルムアルデヒドを追加 (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>室温で 20 分間加温します</li>。
	</ol></li> <li>パラホルムアルデヒドを破棄し、500 μ L の PBS で 2 回洗って 。
	注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;手袋、マスク、メガネを着用してください</li>。
	<li>乾燥するセルを許可します</li>。
	<li>トラップの実行染色メーカーによると &#39; の指示 (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>カウント倍率 10 X で顕微鏡の下で手動で破骨細胞様細胞NA 0.30 。
	注: 破骨細胞様細胞は少なくとも 4 核トラップ + polycarion 細胞として定義されます</li>。
</ol> 2。がん細胞培養 注: SCP2 17、トリプル ネガティブ人間由来 osteotropic 細胞株など乳房腺癌細胞株の種類で実験することができます乳房癌細胞株 (MDA MB 231) とホルモン受容体陽性細胞ライン MCF7。
<ol><li>75 cm 2 フラスコで単分子膜として、細胞の培養します。
	<ol><li>75 cm 2 フラスコでシード 1,000,000 がん細胞</li>。
		<li>1% グルタミンと 10% 牛胎児血清 5% CO 2 の大気中の完全な α-MEM 培の 37 ° C でセルを格納します</li>。
	</ol></li> <li>約 90% の confluency にセルをデタッチ: <ol><li>培地を除去、PBS で洗浄、PBS でトリプシン 1 X 2-3 mL を追加します</li>。
		<li>細胞 37 で 3-5 分の間孵化させなさい ° C</li>
		<li>酵素反応を停止する完全な媒体の 8 mL を追加する 10 mL のピペットで 75 cm 2 フラスコから戸建細胞を収集します</li>。
		<li>225 x g で 5 分間遠心分離</li>
	</ol></li> <li>癌細胞を洗う: <ol><li>10 mL の PBS を追加します</li>。
		<li>600 x g で 5 分間遠心分離</li>
	</ol></li> <li>· ノイバウアー室を持つがん細胞を数えます。
	<ol><li>癌細胞を少なくとも 2 回カウントし、セルの合計の平均数を収集取得する複製の平均を計算します</li>。
	</ol></li></ol> 3。直接癌細胞の共培養破骨細胞への単球を受けて分化 nd <ol><li>挿入 (孔径 0.4 μ m) の癌細胞を播く: <ol><li>cm 2 あたり 4,000 細胞の濃度でがん細胞を播く</li>。
		<li>37 ° C、5% CO 2 インキュベートします 。
		メモ: シードがん細胞 0.4 μ m 挿入で共培養実験の PBMC 播種後日</li>。
	</ol></li> <li>セルが従うように 24 h 待つ</li>。
	<li>場所シード培養 (プロトコルのセクション 1.10 参照) を開始する単核の文化に文化を挿入します</li>。
	<li>は、完全な α-MEM と 2-3 日毎、メディアを変更します。
	<ol><li>200-1,000 μ L ピペットで培地を除去</li>。
		<li>新鮮な追加 500 μ L 中です 。
		注: 共培養の第一の目的は、癌細胞の osteoclastogenic の力を理解するは、したがって、GFs に追加されません α MEM。共培養の実験、ne を含める(プロトコルの手順 1.10 でメモ参照) 通りのコントロールと破骨細胞の RANKL と MCSF (癌細胞なし) で区別されるの肯定的なコントロール。がん細胞の単核の細胞の上に配置しない挿入でシード、共培養のネガティブ コントロールとして使用されます</li>。
	</ol></li> <li>共培養を停止し、がん細胞を使用して、ダウン ストリーム分析: <ol><li>13 日 PBMC 播種後し, 癌細胞播種後 12 日は新しいプレートに挿入を配置します</li>。
		<li>下流解析が (議論 を参照) 実行される根拠に癌細胞培養を停止します</li>。
	</ol></li> <li>14 日破骨細胞分化を停止し、手順 1.15 で報告されたセルを修正します</li>。
	<li>トラップの実行染色直後または 14-30 日. 
	メモ: オプションの染色: クリック率、破骨細胞特異的マーカーを検出する追加染色トラップ + polycarion 細胞が破骨細胞であることを確認、する研究者を実行します。F-アクチン リングの検出は別破骨細胞特定染色試金 12 , 13 , 14</li>。
</ol>

<ol>
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著者はある利益相反を開示します。

前臨床の in vitroモデルがん細胞と骨細胞間クロストーク機構の研究は、骨転移治療の新しい戦略を作成するためのメカニズムを識別するために必要です。ひと末梢血 (図 3) から破骨細胞形成の完全な人間の in vitroモデルを開発しました。方法論の最適化中に重要なポイントの数が特定し、解決されました。最初は、種子に単核細胞の量を懸念しています。顕微鏡の数によって得られる細胞の数は大まかな数量だけリンパ球と単球、後者が破骨細胞形成実験のための種子に標的細胞を区別することは困難です。リンパ球は、プラスチック基板に準拠していないためにこうして大半は媒体の最初の変更で除去された単球を識別することができました。細胞は、細胞分化、特に前破骨細胞が融合し、なるために接近する必要があります破骨細胞形成の第 2 フェーズの相互に対話できるようにするために不可欠である高密度で播種しました。成熟破骨細胞。これらは細胞の数が多いと大量の血を必要とするため、複数の実験条件がある場合、さらなる困難が発生します。PBMCsなどの高濃度を持っているバフィー コートを使用する 1 つの可能な解決策は、4 x 105-6 x 106単核細胞は通常に比べてより少ない 1 x 10 の5から収集した PBMCs 50 mL バフィー コート サンプルから収集されます、20 mL 採血します。
血液サンプルは、さまざまなボランティア活動から収集された破骨細胞形成アッセイの可変性のある程度があった。したがって、少なくとも 3-4 技術的複製と各分析を実行することが重要だった。生物の複製されたまた必要とし、さまざまな実験によって得られた値の平均値の計算に通常がない別の健常者が使用されたよう、我々。我々 は異なるテストの動向が同等であったし、原稿に含まれる健康なドナーの 1 つから 1 つの実験を選んだことを確認しました。
単球の癌細胞と分化を受けての共同培養前臨床モデルが含まれます。我々 が以前に示した癌細胞も培養破骨細胞形成12,13を維持できます。このシステムは薬をテストしたり、相互作用のメカニズムを調査する使用ことができますがん細胞と破骨細胞の両方でいくつかのダウン ストリーム解析を実行することが可能であります。実際には、がん細胞と細胞及び破骨細胞13をがんと両方に遺伝子式解析/ウエスタンしみ試金増殖アッセイを行うことが可能です。それがする方法から分泌されるタンパク質を理解に関心の異なる異なる条件で。本モデルはいくつかの利点、すなわち、それは文献で報告されたいくつかのモデルとは異なり、マウス細胞株には依存しない完全に人間モデル。モデルもかなり堅牢で、再現性のある、他の目的に使用することができます。たとえば、他のがん細胞は破骨細胞および研究の osteoclastogenic 力の差との共培養することができます。さらに、このシステムは骨の生物学や骨粗しょう症などの破骨細胞を介した病気の私達の理解を改善するために他の生理学的または病理学的メカニズムを評価する使用できます。他のサイトカインと細胞の種類は、実験の目的によって破骨細胞と共培養も可能です。
いくつかのダウン ストリーム分析は、このモデルで可能です。研究の設計段階で決めることが重要です井戸の適切な数がシードできるように、分析を行います。
破骨細胞と下流の試金:
(i) 遺伝子発現解析。計画総 RNA を抽出する破骨細胞の追加井戸トラップ評価するため井戸は RNA 抽出のためご利用いただけません。(ii) 西部のしみの分析。(iii) 破骨細胞表面積の定量化。破骨細胞のサイズ パラメーターは、破骨細胞の成熟と ImageJ などオープン ソース ソフトウェアを用いて定量化することができます。
癌細胞と下流の試金:
(MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイドのよう i) 拡散の試金。(ii) 遺伝子発現解析。(iii) 西部のしみの分析。
破骨細胞と癌細胞 (培養) 下流の試金:
がん細胞と破骨細胞は、同じ培養培地を共有して、ELISA の試金が特定のサイトカインや GFs などを努めて分泌分泌タンパク質との相互作用を学ぶことができます。
このモデルの開発は私たちのプロジェクトのために重大だった、さらに、近い将来にそれを改善していく計画。模擬骨を 3 D の石灰化コラーゲン足場の単球を区別するために主要な一歩前進になります。それにより骨吸収測定と破骨細胞の活動を直接評価することが可能になります。我々 のモデルが分離し、破骨細胞の in vitro の研究に研究者を有効にすると生理学的および病理学的処理に至る骨リモデリング骨転移を規制するために破骨細胞の多様な役割についての詳細を学ぶため続け、.

骨は、病1,2,3の過程で骨転移を来した症例の 20-25% に前立腺、肺、乳癌などの癌の種類によって転移の一般的なサイトです。特に、乳がん患者の 70% は死4で骨転移の証拠を運ぶ。腫瘍と間質細胞癌の二次病変の相互作用は癌の進行に不可欠な。骨の微小乳がんから骨骨転移は、がん細胞、骨細胞、骨微小環境と発生病理学的悪循環の確立によって異なります。癌細胞は骨吸収5,6、7の増加、骨のバランスを混乱させます。
新しいマトリックスを入金で、骨芽細胞が新しい骨形成8担当に対し、正常および病的条件では、破骨細胞、骨吸収を担当のセルです。破骨細胞融合、成熟破骨細胞への分化に必要なプロセスを誘導するランク破骨細胞表面の受容体に結合する RANKL の発現を介して骨芽細胞による破骨細胞の活動が規制されています。破骨細胞形成の誘導には、骨吸収が増加します。多数の生体内で調査は大きく骨転移形成9,10,11の私達の理解を改善しています。乳癌細胞腫瘍と骨の微小環境では、破骨細胞形成を促進する破骨細胞機能を混乱させるし、骨吸収8。このシナリオではすべて分子間の相互作用が発生する癌細胞と破骨細胞が極めて重要です。すでに述べたように、骨転移のメカニズムは、 vivoマウス モデルに解明されてきた。ただし、すべて生体内で倫理委員会の動物実験の承認のための必要性に加えて、高いコストと時間のかかる方法を含む生体内で実験を実行するその他のいくつかの欠点があります。何人かの著者は、RAW246.79,10,11と呼ばれる前破骨細胞をマウスの線を使用して破骨細胞形成の生体内および生体外での前臨床モデルを組み合わせています。このモデルの欠点はセル前破骨細胞になることにコミットしているすでに、人間の起源ではないという事実に起因します。これらの理由から、トランスレーショナルリサーチ大幅体外骨癌細胞の相互作用を研究する完全ひと臨床モデルの可用性から寄与できます。
破骨細胞形成の in vitroひと末梢血サンプル12,13から始まってのメソッドを最適化されています。破骨細胞は単球は、末梢血サンプルの小さい程度に存在、してから派生します。単核球、最初で仕切られて赤血球と顆粒球全血中に存在 Ficoll 密度勾配;リンパ球とは異なり、プラスチック基板に付着する彼らの能力のおかげで彼らが選択されます。播種後 14 日間の細胞を培養しています。MCSF と RANKL は、GFs の単球がマクロファージと破骨細胞14,15に最初に区別するために必要です。RANKL は破骨細胞形成の後期段階の分化過程を誘導するために使用されるに対し、アッセイの全体の持続期間のため MCSF が必要です。分化の初期の段階で MCSF 単球増殖し、14,15を生き残ることができます。破骨細胞形成の 2 番目の部分の中に細胞が融合して破骨細胞、リングで F アクチンの分布特性を示し、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) やカルシトニン受容体などの特定のマーカーの表現として成熟(CTR)14,15. 本論文では 7 に 14 日から実験と MCSF と RANKL の組み合わせの最初の 7 日間の単球文化に MCSF を追加します。実験の終わりには、破骨細胞形成は下記のとおり、分化した細胞をカウントすることによって分析されます。
Gfs の区別するために誘発 monocyte 文化は、私たちの前臨床モデルの基礎を形成します。私たちは乳癌細胞の osteoclastogenic の力を理解する GFs なし共培養システムを最適化されています。メディアを追加することによって間接共培養モデルを開発した (80% α-最小必須培地 (α-MEM) エアコン 20% 中小収集乳癌細胞の文化から、セルを約 90% 合流分化12 を受けていた.馴化培地 (血清欠乏条件下では収集されません) は 24 時間後に収集され、新鮮な培地で 1:4 の割合で混合します。馴化培地には、負の制御に関して重要な破骨細胞の分化が誘導されます。しかし、な間接共培養を使用する場合、がん細胞と骨細胞間相互作用の情報が失われない、直接共培養を行うことで我々 のシステムを改善しました。0.4 μ M を挿入し、単核球がメッキされた井戸に配置しての癌細胞の種をまいた。このメソッドを使用すると、セルは同じ媒体を共有しから分泌されるタンパク質を交換します。こうしてがん細胞13による破骨細胞形成の完全に人間の臨床モデルを作りました。
このシステムは非常に汎用性と異なる研究目的、例えば、骨転移の薬の役割を調査し、薬理学的研究でに使用できます。私たちのモデルでは、有効性と骨標的療法および/またはがん細胞13の存在下で骨の微小環境における抗腫瘍薬の作用のメカニズムを研究することが可能になります。正しいコントロールを持つ実験の設計、すなわち、癌細胞と破骨細胞培養、個別にやすく薬剤活性の共培養の影響を理解します。この方法は、研究されている薬剤ターゲット癌細胞及び破骨細胞、例えば、エベロリムス両16時さらに興味深いものになります。このモデルは、がん細胞と骨細胞間の相互作用の新しい経路を識別するためにも使用できます。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Euroclone</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life-technologies</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life-technologies</td><td>ECS0180DPR</td><td></td></tr><tr><td>hMCSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Storage indications must be respected</td></tr><tr><td>hRANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>Storage indications must be respected</td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387 A</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte separation media</td><td>Biowest</td><td>L0560-100</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood cell lysing buffer</td><td>SIgma</td><td>11814389001&lt;br/&gt; ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>COD.&lt;br/&gt; ECB3052D</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-267</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3470-Clear</td><td>These inserts are for 24-well plates;&lt;br/&gt; 6.5 mm, 0.4 &amp;mu;M;&lt;br/&gt; pore size</td></tr></tbody></table>

development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines

腫瘍細胞と骨の微小環境における骨細胞間クロストークは骨転移形成のメカニズムを理解することが重要です。体外完全ひと臨床のモデル乳癌細胞と破骨細胞への分化を受けている単球の培養を行った。私たちは健康なドナーから末梢血液のサンプルから破骨細胞形成のモデルを最適化されています。末梢血単核球 (PBMCs) が最初に密度勾配遠心法で区切られ、高密度で播種、2 つの成長因子 (GFs) を追加することによって区別するために誘導: 核因子 κ B ligand (RANKL) とマクロファージの受容体活性化コロニー刺激因子(MCSF)。セルが 14 日間文化のまま固定し、下流の分析を行った。骨骨転移における骨にがん細胞の到着の効果の 1 つは破骨細胞形成の誘導です。我々 はこのように私たち GFs に対するがん細胞の分化のパワーを研究する乳癌細胞の共培養モデルを挑戦しました。がん細胞破骨細胞の相互作用を学ぶ簡単な方法は、乳房癌細胞培養から収集し、新鮮な媒体と混合馴化培地の使用に基づく間接共培養を行うことです。この混合物は、破骨細胞分化を誘導するために使用されます。我々 はまた直接培養がん細胞と単球の分化を受けて媒体を共有し、分泌された要因を交換する方法を最適化されています。これは、大幅に改善オリジナル間接共培養法で研究者は 2 つの細胞のタイプの相互作用を観察でき、がん細胞と破骨細胞の両方に対する下流を分析します。この方法により、骨転移微小環境と乳がん由来以外の種細胞への薬の効果を研究します。モデルは、骨粗しょう症や他の骨の条件など他の病気を研究するも使用できます。

メソッドは、ひと末梢血単球から破骨細胞を簡単に区別するために最適化されました。単球培養は培養がん細胞、がん細胞が骨転移における破骨細胞形成を維持できる (前述の文献18) を確認します。がん細胞から分化した破骨細胞と、GFs は、図 1に示します。破骨細胞様細胞は 4 つ以上の核を持つ細胞をトラップ (紫セル) を汚すために肯定的です。破を定義するために使用する核の数の承認済みのカットオフは 318, しかし、我々 は 4 を使用して、誤検知のリスクを最小限に抑えることを決めた。
モデルは、がん細胞によって誘導される井戸の破骨細胞数は肯定的な制御 (図 2) で得られたようなので、その乳がん癌細胞持続的な破骨細胞形成を示しています。図 2 aのように、セルの数も区別される自発的にネガティブ コントロールで破骨細胞に。モデルの有用性を確認するために、システムは抗腫瘍薬12,13で挑戦しました。共培養条件と負のコントロール (クリック率-) のサンプルよりも肯定的な制御 (CTR +) サンプルでは、破骨細胞数が高かった。破骨細胞数が有意に減少共培養条件の肯定的なコントロール (クリック率 +) 薬 (エベロリムス) が存在しました。T 検定は統計分析に使用されました。セルはそれぞれ数えられた井戸。表面積破骨細胞は成熟の特徴である、ImageJ などオープン ソース ソフトウェアを使用して分析することができます。GFs から派生した破骨細胞は、癌細胞 (図 2 b) によるものよりも大きかった。抗腫瘍薬 (エベロリムス) による治療は、GFs の効果をオフになってください。モデルは、破骨細胞形成阻害薬の役割に関する有用な情報を提供しました。図 2は、薬の存在下で破骨細胞形成が減少したことを示しています。これらの結果は、共同文化による破骨細胞形成によって得られました。プロトコルのセクションで説明したように、クロストークや分析の薬のメカニズム解明のため数その他のダウン ストリームの解析を実行できます。図 3に示すモデルは非常に薬の癌細胞、特に、破骨細胞に及ぼす影響を研究する versatileand を使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56311/56311fig1.jpg"> 
図 1。破骨細胞形成アッセイ。14 日間の培養後染色します。クリック率-単球成長要因のない状態で培養CTR + 単球培養 RANKL と MCSF 成長因子;ココ、破骨細胞ががん細胞と血液細胞を共培養によって得られました。10 倍の倍率。破骨細胞様細胞トラップ (紫セル) に陽性であった、少なくとも 4 核の細胞はあった。各井戸のセルをカウントすることによって細胞の定量を行った条件ごとに 4 の複製を行ったし、平均を算出しました。スケール バーは、400 μ m です。(100 X) の下のパネルで画像ズーム 2 破骨細胞 (赤丸) の表面積を示しています。矢印は、破骨細胞の核を示します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56311/56311fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56311/56311fig2.jpg"> 
図 2。破骨細胞形成治療に及ぼすエベロリムス。(A)、薬剤の有無によると破骨細胞数条件ごとに 4 の複製を行った。クリック率-単球成長要因のない状態で培養CTR + 単球培養 RANKL と MCSF 成長因子;ココ、破骨細胞ががん細胞と血液細胞を共培養によって得られました。データは、平均 ± SE として表されます。意義は、t-テストによって評価されました。* p &#60; 0.05。(B) 破骨細胞の表面積を求めた ImageJ はオープン ソースのソフトウェアです。1 つの条件の少なくとも 50 破骨細胞を測定しました。クリック率-単球成長要因のない状態で培養CTR + 単球培養 RANKL と MCSF 成長因子;ココ、破骨細胞ががん細胞と血液細胞を共培養によって得られました。14 日間の抗腫瘍薬 (エベロリムス) の有無で培養後の細胞の (C) の画像。10 倍の倍率。スケール バーは、400 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56311/56311fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56311/56311fig3.jpg"> 
図 3。共培養モデル。方式モデルおよび可能な下流解析の将来のアプリケーションです。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56311/56311fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

このプロトコルでは、生体外で人間前臨床モデルの末梢血単球培養がん細胞破骨細胞の相互作用を模倣する乳房癌細胞から破骨細胞形成の開発について説明します。モデルは、骨転移形成の理解を深めると治療オプションの改善される可能性があります。

破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

development-human-preclinical-model-osteoclastogenesis-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.0K ビュー.  IRCCS. このプロトコルでは、生体外で人間前臨床モデルの末梢血単球培養がん細胞破骨細胞の相互作用を模倣する乳房癌細胞から破骨細胞形成の開発について説明します。モデルは、骨転移形成の理解を深めると治療オプションの改善される可能性があります。

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Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

がん研究

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

発生生物学

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

医学

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

モデル化学療法抵抗性白血病<em&gt;インビトロ</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

機能性破骨細胞のヒト末梢血CD14+ 単球との鑑別

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

免疫・感染学

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

生物学

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases (e.g., osteoporosis and bone cancer) and are therefore important objects of research. In vitro, their activity can be analyzed by the formation of resorption pits. In this protocol, we describe a simple pit assay method using calcium phosphate (CaP) coated cell culture plates, which can be easily visualized and quantified. Osteoclast precursors derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured on the coated plates in the presence of osteoclastogenic stimuli. After 9 days of incubation, osteoclasts were fixed and stained for fluorescence imaging while the CaP coating was counterstained by calcein. To quantify the resorbed area, the CaP coating on plates was stained with 5% AgNO3 and visualized by brightfield imaging. The resorption pit area was quantified using ImageJ.

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Here, we present a simple and effective assay procedure for resorption pit assays using calcium phosphate coated cell culture plates.

インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

要約

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