Bu çalışma, Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsünün (R21DC010806&#39;dan CAM ve JCS&#39;ye ve R01DC011285&#39;den CAM&#39;e) hibeleriyle desteklendi.

Bu protokol için 6 ve 30 aylıkken erkek Fischer 344-Brown Norveç sıçanları kullanın. Sıçanlar Ulusal Yaşlanma Enstitüsü&#39;nden kemirgen koloni elde edildi. Bu çalışma için sıçanlar kullandık, çünkü sıçan larenksinin yapısı, havayolu koruması ve türe özgü seslendirme işlevini yerine getiren işlevsel olarak insandakine benzerdi. Bu çalışma, PHS İnsan Gücü Bakımı ve Laboratuar Hayvanları Kullanımı, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Rehberi ve Hayvan Refahı Yasası (7 USC ve ark.); Hayvan kullanımı protokolü, Kentucky Üniversitesi&#39;nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Sıçan Anestezi <ol><li> Ketamin hidroklorür (dissosiyatif anestetik) ve ksilazin hidroklorür (sedatif ve analjezik) tamponlu salinde karıştırılarak anestezi hazırlayın. Nihai çözeltideki ketamin ve ksilazinin konsantrasyonları kg başına 100 mg / 8 mgVücut ağırlığı. </li><li> 25 G iğneli bir şırınga kullanarak intraperitoneal uygulama vasıtasıyla anestezi fareye enjekte edilir. </li><li> Parmağın ayak parmağını veya ayağı forsepsle tutarak sıçanın yeterince anestezi edildiğini belirleyin. Eğer sıçan sıkışmaya tepki vermezse, ameliyat başlayabilir. Sıçan ayak parmaklarına refleks veya kasılmalar ile tepki verirse, 1-2 dakika bekleyin ve sıkma testini tekrarlayın. Sıçan tekrar tepki gösteriyorsa, sıçanı yeni bir hayvanla değiştirin ve adım 1.2&#39;den başlayarak işlemi yineleyin. </li><li> Sıçanın hareketsiz kaldıktan sonra sıçan gözlerine oftalmik merhem uygulayın, böylece kornealar kurumaz. </li></ol> 2. Osmotik Pompa İmplantasyonu <ol><li> Sıçanın ventralini aseptik cerrahi alana yerleştirin. Bir preanestetik ilaç olarak meloksikam uygulayın. 25 G&#39;lik bir iğneli bir şırınga kullanarak intraperitoneal olarak 1-4 mg / kg vücut ağırlığı dozunda uygulayın. </li><li> Yaklaşık birimi kaldırmak için makas kullanınBoynunun arkasından 1 &quot;x 1&quot; kare kürk ve omuzlar arasında yaklaşık 1 &quot;kaudal alan olabildiğince cildin yakınına tıraş edin. </li><li> Dezenfekte etanol (70%) ile sırt ve boynu ıslatın. </li><li> Tıraştan sonra, boyun dorsal boyasını, alkolle bitirme iyod-alkol art arda 3 fırça ile fırçalayın. </li><li> Sıçanın vücut ısısını, 34 ° C&#39;ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirerek koruyun. </li><li> Aseptik olarak hazırlanmış ozmotik pompaları ya sistemik NTF4 tedavisi için 50 μL NTF4 veya tuzlu su ile doldurun ( Şekil 1 ). <ol><li> Deriden yaklaşık 2 cm genişliğinde yatay bir kesi yapmak için bir neşter kullanın, sadece kafa parçalarının arasından skapula arasında boşluk bırakın. Hemostatların ucunu yerleştirirken insizyonun arka kenarını bir elinizle forsepsle kaldırın ve posteri insizyona yavaşça itin. </li><li> Hemostatların ucu yaklaşık 2 cm sonraKesiye giden yolda, hemostatların üzerindeki kolları açın, insizyon bölgesine subkutan içi boş bir &quot;cep&quot; oluşturacak şekilde ipuçlarını genişletin. Bu, pompa için yerleştirme bölgesi olacaktır. </li></ol></li><li> NTF4&#39;ün herhangi bir etkileşimini ve cebin kesilme bölgesinin iyileşmesini en aza indirgemek için, pompa dağıtım portalı ucunu yerleştirdikten sonra yönlendirin. </li><li> 7-14 gün boyunca 50 μL NTF4 salin verin. 7 günlük grup, toplam 47.04 mg doz için 6.72 mg / gün NTF4 aldı. 14 günlük grup, 94.08 mg NTF4 25 toplam dozu için 6.72 mg / gün aldı. </li><li> Pompa yerleşimi için yapılan kesi kapatmak için 5-0 naylon dikiş ipliği, hemostatlar ve forseps kullanın. </li><li> Anesteziden kurtulduklarından sıçanları en az 30 dakika izleyin. İzlemenin tamamlanması için kriterler, hayvanın faal hale gelmesi, kafesin etrafında hareket edilmesi, içme suyunun alınması ve damat tutumu gibi diğer normal faaliyetlerin başlatılmasıdır. </li><li> Günlük hayvanları izleyinCerrahi alan iyileşmesi, normal yem ve su tüketimi ve idrar / dışkılardan geçme ve stres, ağrı veya diğer ameliyat sonrası komplikasyonların herhangi bir anormal davranış belirtileri gözlenerek ilk hafta için. </li><li> Eğer fare ağrı ya da sıkıntılı görünüyorsa, ağrıdan kurtulmak için her 24 saatte bir 5 mg / kg subkutanöz karprofen enjeksiyonu yaptırınız. </li><li> Bir enfeksiyon var gibi görünüyorsa, yaranın iyileşmesini sağlamak için bir veterinerle görüşün. </li><li> Hangi deney grubuna girildiğine bağlı olarak, ipliğin tahriş olmasını önlemek için ameliyattan 7-10 gün sonra 5-0 naylon dikişini çıkarın. </li></ol> 3. Direkt Enjeksiyonluk Sıçan Anestezisi <ol><li> Prosedürden önceki gece fareden yemek yemeyin. Bu, endoskopu veya enjeksiyon iğnesini bloke edecek yiyecek bulunmamasını sağlar. </li><li> Sıçanları tartın ve acepromaz 1-2 mg / kg vücut ağırlığı hazırlayın. Kas içine enjekte edin (IM konumuSol tiroksinoid kas). </li><li> Sıçanı, indüksiyon kutusuna yerleştirin. İndüksiyon kutusunda% 5 izofluran ve 1 Ç 2 ile anestezi uygulayın. </li><li> Sıçanı,% 2 izofluran ve 600 mL O 2 içeren burun konisine taşıyın. </li><li> Parmağın ayak parmağını veya ayağı forsepsle tutarak sıçanın yeterince anestezi edildiğini belirleyin. Sıçan tutamağa tepki vermezse, enjeksiyon protokolü başlayabilir. Sıçan ayak parmaklarına refleks veya kasılmalar ile tepki verirse, 1-2 dakika bekleyin ve sıkma testini tekrarlayın. Sıçan tekrar tepki gösteriyorsa, sıçanı yeni bir hayvanla değiştirin ve adım 3.4&#39;ten başlayarak yinelemeyi tekrarlayın. </li></ol> 4. Doğrudan Enjeksiyon ve Görselleştirme <ol><li> Enjeksiyondan önce 30 dakika boyunca 25 ° C&#39;ye ayarlanmış bir H20 b banyosunda NTF4 veya salin içeren aseptik olarak hazırlanmış 50-μL dozajlar yerleştirin. </li><li> Sıçanı bir pleksiglas platformda sırtüstü yatırın ve yatırın ( Şekil 2 ). SusSıçanı platformun üst kısmında bulunan bir kılavuz tel vasıtasıyla ön üst kesici uçlarından geri duran duruşta tutun. </li><li> 1.9 mm, 30 ° sinüs endoskopuna 50 mm, 30 gauge, 100 μL şırınga takın ( Şekil 3 ). NOT: Şırınga düzeneği kanülü sıkıca endoskopun dış duvarına tutan bir alet yardımıyla bağlanır. Endoskop vokal kıvrımların görselleştirilmesine ve şırınganın rehberliğine intraoral olarak izin verir. Kanül ucunun konumu, ucun endoskopik görünümü ( Şekil 4 ) aracılığıyla tam ve açık şekilde görülebilmesini sağlamak için her hayvandan önce ayarlanır. </li><li> Dili uzatmak ve yana doğru hareket ettirmek için lastik uçlu bir forseps kullanın. Daha sonra, oral açıklığı korumak için plastik bir spekulum takın. Kesikleri uçları kopararak pürüzsüz cilalanarak, 1.5 ila 2 cm&#39;lik bir uzunluğa kesilen 5 mL&#39;lik bir plastik şırınga varilinden spekulum yapın. </li><li> Işıklardaki ışıkları kapatM ve endoskopa bir halojen ışık kaynağı takın. İşlemi kaydetmek için video kaydediciyi açın. </li><li> Sıçanın ağzına yerleştirildiğinde cam ucu üzerinde yoğuşma gelişimini en aza indirgemek için endoskopun distal ucunu ılık suya birkaç saniye batırın. </li><li> Monitörden gelen görsel geribildirimi kullanarak, iğne dikkatli bir şekilde sol ses katmanının alanına yönlendirilir. </li><li> Vokal katın tümüne erişmek için solüsyonun solunum döngüsünün inspirasyon fazıyla birlikte enjeksiyon zamanı. Solunumun inspiratuar fazı boyunca vokal kat tam olarak açığa çıkar. <ol><li> Ses kıvrımı tamamen görünür hale geldiğinde, iğneyi vokal katın beyaz medyal kenarının yan tarafında bulunan sol tiroarenoid içine yerleştirin. İğne yerinde iken enjektörü şırınganın depresyondan geçirin. </li></ol></li><li> Endoskop ve video oynatıcıdaki halojen ışık kaynağını kapatın ve ro&#39;yu geri çevirinIşıklar. </li><li> Sıçanı evdeki kafese geri getirin ve ısıtma yastığına yerleştirin. </li><li> Isı pedinden çıkarmadan önce sıçanın iyileşmesine izin verin. Kafesdeki yiyecek ve suyu değiştirin. </li><li> Enjeksiyondan sonra sıçanları 7 gün boyunca izleyin ve ardından öksüzleştirin. Kriyoteksiyon için larideleri çıkarın 24 . </li></ol> Sıçanların Euthanizasyonu <ol><li> Sıçanları, ketamin hidroklorür ve ksilazin hidroklorür (100 mg / 8 mg / kg vücut ağırlığı enjekte edilen intraperitoneal enjeksiyon) ile anestezi altına alınız. </li><li> Medial torakotomiyi takiben kanama önleme yöntemiyle euthanize olun. </li></ol>

<ol>
	<li>Trupe, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+and+consequences+of+eating+dependency+in+institutionalized+elderly.">Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly.</a> J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).</li><li>Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+the+voice+and+swallowing.">Aging of the voice and swallowing.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).</li><li>Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+on+the+effect+of+regulation+on+health+care+for+the+older+American:+a+tale+of+two+states.">A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states.</a> Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).</li><li>Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysphonia+in+the+elderly:diagnosis+and+management+of+age-related+voice+changes.">Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes.</a> South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).</li><li>Broniatowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+evaluation+and+treatment+of+patients+with+swallowing+disorders.">Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders.</a> Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).</li><li>Lundy, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration:+cause+and+implications.">Aspiration: cause and implications.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).</li><li>Schindler, J. S., Kelly, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swallowing+disorders+in+the+elderly.">Swallowing disorders in the elderly.</a> Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).</li><li>Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+neuromuscular+junctions+in+the+human+posterior+cricoarytenoid+muscles:+a+quantitative+study.">Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study.</a> Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).</li><li>Sinard, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+voice:+how+to+differentiate+disease+from+normal+changes.">The aging voice: how to differentiate disease from normal changes.</a> Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).</li><li>Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vocal+loudness+in+young+and+old+adults.">Control of vocal loudness in young and old adults.</a> J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>Lai, K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+signaling+of+new+players+at+the+neuromuscular+junction.">Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction.</a> J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+roles+in+neuronal+development+and+function.">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).</li><li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Trkb+mediated+signaling+induces+disassembly+of+postsynaptic+receptor+clusters+at+neuromuscular+junctions.">Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions.</a> Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).</li><li>Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+aged+vocal+folds:+first+human+case+treated+with+fibroblast+growth+factor.">Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor.</a> Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).</li><li>Branski, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+transforming+growth+factor-beta+1+on+human+vocal+fold+fibroblasts.">Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts.</a> Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).</li><li>Kishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exogenous+hepatocyte+growth+factor+on+vocal+fold+fibroblasts.">Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts.</a> Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).</li><li>Belluardo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+disassembly+and+muscle+fatigue+in+mice+lacking+neurotrophin-4.">Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4.</a> Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanisms+in+the+old+rat.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+initial+dosing+of+botulinum+toxin+in+treatment+of+adductor+spasmodic+dysphonia.">Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia.</a> Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).</li><li>Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cricothyroid+muscle+botulinum+toxin+injection+to+improve+airway+for+bilateral+recurrent+laryngeal+nerve+paralysis,+A+case+series.">Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series.</a> J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).</li><li>Coppoolse, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+study+of+composite+microgels+based+on+hyaluronic+acid+and+gelatin+for+the+reconstruction+of+surgically+injured+rat+vocal+folds.">An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds.</a> J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).</li><li>Herteg&#229;rd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linked+hyaluronan+used+as+augmentation+substance+for+treatment+of+glottal+insufficiency:+Safety+aspects+and+vocal+fold+function.">Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function.</a> Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).</li><li>Walker, W. F., Homberger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and dissection of the rat. , (1997).</li><li>Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+the+expression+and+deposition+of+vocal+fold+collagen+and+hyaluronan.">Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan.</a> Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).</li><li>Stemple, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+aging+rat+laryngeal+muscles+with+endogenous+growth+factor+treatment.">Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment.</a> Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+dysfunction+and+altered+metabolic+profile+of+the+aging+rat+thyroarytenoid+muscle.">Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle.</a> J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).</li><li>Engle, W. K., Cunningham, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+examination+of+muscle+tissue.+An+improved+trichrome+method+for+fresh-frozen+biopsy+section.">Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section.</a> Neurology. (13), 919-923 (1963).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+practice+of+histotechnology.">Theory and practice of histotechnology.</a> Battelle. , (1980).</li><li>Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+TrkB+expression+results+in+precocious+age-like+changes+in+neuromuscular+structure,+neurotransmission,+and+muscle+function.">Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function.</a> J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).</li><li>Nishida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+change+in+rat+intrinsic+laryngeal+muscles:+analysis+of+muscle+fibers,+muscle+fiber+proteins+and+subneural+apparatuses.">Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Larinks kasları yaşlanmanın olumsuz etkilerine karşı savunmasızdır. Önceki çalışmalar, kontraktil fonksi- yon ve miyozin izoform değişikliklerine ek olarak lif boyutu, toplam lif sayısı, rejeneratif yeteneği, NMJ boyutu ve miktarı değişikliklerini içeren yaşlanma laringeal kaslarında değişiklikler olduğunu göstermiştir 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . Yaşlanma laringeal kas nörotrofinlerin uygulanması ile değiştirilebilir. Bu değişiklikler kolaylıkla ölçülebilir. Bu nedenle sıçan laringeal kasları yaşlanmanın ve vokal hastalıkların / rahatsızlıkların etkilerini incelemek için yararlı bir model oluşturmaktadır. Bu kasların incelenmesi, yaşlanan insanda müdahale veya koruyucu süreçlerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. NTF4&#39;ün sistemik veya direkt olarak uygulanması yöntemimiz yaşlanma sıçan larinksinde remodeling tepkisi üretirkaslar. Bu, nevrotrofinlerin yaşlanmayla ilişkili kas disfonksiyonu üzerinde terapötik potansiyele sahip olabileceğini göstermektedir. Nörotrofinlerin doğrudan uygulanması, enjeksiyon vektörleri 25 olsa da, insan yaşlanma vasıflarına kolayca dönüştürülebilir. Enjeksiyon protokolünü kullanırken göz önüne alınması gereken birçok faktör vardır. Birincisi, endoskopun ucu keskin bir iğne takılı olduğu göz önüne alındığında, laringeal vestibül çevresinde çizilmeyi ve yumuşak dokunun yaralanmasını önlemeye özen gösterilmelidir. İkincisi, hayvanların solunum döngüsünün inspiratuar fazı sırasında iğne ucunun larenks içerisine hareketinin zamanlamasıyla, enjeksiyonun doğru bir şekilde yapılması zaman alır. Üçüncü olarak, prosedürü denemeye başlamadan önce iğne ucunun net bir şekilde görülebildiğinden emin olun, önceden cihazdaki cihazı kontrol edin. Dördüncüsü, endoskopun ucunu sıcak suda birkaç saniye ısınmak, endo&#39;nun sislenmesini kesin olarak belirlemek için önemli bir adımdır.Alan ucu önlenir. Sonunda, farenin herhangi bir skoplama prosedüründen önceki gece hızlı olması da önemlidir. Eğer yiyecek tevkifat etmezse, farenksde hala yiyecek kalıntısı olacak ve bu da enjeksiyon prosedürünü neredeyse imkansız kılıyor. Sıçanlar günlük dehidrasyon bulguları açısından kontrol edilmeli ve belirgin bir kilo kaybı olmadığından emin olmak için tartılmalıdır (vücut ağırlığının% 10&#39;undan daha fazla). Protokolün geliştirilmesinde iki kritik adım şırınganın endoskopa tutturulması ve bir oral spekulum kullanılması idi. Şırınga takımının firma çapa bağlanması, kapsam ekleme ve enjeksiyon için tek elle operasyonu kolaylaştırmak için gerekliydi. Araştırmanın amaçları göz önüne alındığında, vokal kılıfın enjeksiyonu için doğrudan görselleştirme yokluğunda, deney gerçekleştirilemedi. Buna ek olarak, sözlü spekulum oluşturulması, dili hareket ettirmemesi ve ağız sağlığını korumak açısından önem taşımaktadır.Progranda epiglotlar açıktır. Görsel olarak yönlendirilen enjeksiyon yöntemi, şırınga ve iğneyi endoskopa güvenli bir şekilde tespit etmenin en uygun araçlarını bulmakla ilgili birkaç turluk değişikliğe gitti. Çeşitli farklı bant yapıştırıcılarını test ettikten sonra, ticari olarak temin edilebilen elastik atletik bandın, şırıngayı endoskop gövdesine demirlemenin en iyi aracı olduğu bulundu. Görme rehberliğindeki enjeksiyon yönteminin en büyük kısıtlılığı enstrümantasyonla değil, daha çok bir patent farinks ve havayolu gereksinimi ile ilgiliydi. Usul öncesi 24 saat boyunca yiyeceklerin kısıtlanması bu sorunun çoğunu çözmüş olmasına rağmen, sıçanlar yatak takımları ve dışkılar da dahil kafeslerindeki herhangi bir şeyi yutacak. Bu gerçekleştiğinde, iki çözüm vardı: (1) hayvanın gırtlağını doğal olarak temizleyene kadar enjeksiyonu ertelemek veya (2) forseps kullanarak elle tıkanıklığı gidermeye çalışmak. Bizim deneyimdiE, bunun daha iyi bir seçenek olduğu, çünkü hayvanın faringeal bölgedeki yaralanma riskini azalttı. Bu protokolün yeniliği ve vokal katın doğrudan bileşik ile enjekte edilmesi ihtiyacı göz önüne alındığında, güvenilir herhangi bir yöntem mevcut değildir. Hayvanların larinks sisteminin küçüklüğü göz önüne alındığında, canlı hayvanda bileşiğin doğru ve tutarlı yerleştirilmesini sağlamak için tek yol olarak oral ve farengeal bölgede görsel olarak yönlendirilmiş enjeksiyon. Vokal katın doğrudan enjekte edilmesinin tek yolu, bunu harici bir konumdan, gırtlak cildi ve kıkırdak yoluyla yapmaya çalışmaktı. Larstitüsyon distonilerini hafifletmek için botulinum toksini tedavisi gören insanlarda bu yöntem başarıyla uygulansa da, küçük hayvanlarda transkutanöz enjeksiyon yöntemleri uygulanabilir değildir. Teknik sağlamdır ve sadece vokal katın enjeksiyonu için değil, aynı zamanda enjeksiyon bölgelerindeFarengeal ve oral bölgeler. Buna ek olarak, bu yöntem şırınganın çıkarılmasıyla farenjeal ve laringeal bölgenin basit görsel denetimi için uyarlanabilir. Özetle, bu enjeksiyon yöntemi, insanlardaki yaşlanmaya bağlı ses bozukluklarının tedavisi ile ilgili biyolojik mekanizmaları incelemek için yeni bir araçtır. Bu yöntemin ayrıca, vokal, sesli fonksiyon, iletişim ve insanlarda yutma sorunlarını etkileyen diğer hastalık modellerine uygulanma potansiyeli vardır.

Larinks kasları hızla ve sürekli olarak kasılır ve yaşlanmanın olumsuz etkilerine karşı savunmasızdır. Bu sabit etkinliğin, 65 yaş üzerindeki 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 numaralı kişilerde görülen ses problemlerine veya disfajiye katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Birkaç moleküler ve patofizyolojik mekanizma bu yaşla ilişkili disfonksiyona katkıda bulunmaktadır. Bu mekanizmalar laringeal mukozanın yeniden şekillendirilmesi, kas lifi atrofisi veya kaybı, vasküler kıvrımların eğilmesine ve glottis kapanmasının başarısız olmasına neden olan kas lifi rejenerasyonu veya atrofisinin eksikliği içerebilir 8,9,10,11. Şu anda, kanıtlanmış bir tıbbi tedavi yoktur.Bu kaslarda bu yaşa bağlı değişiklikleri kolayca önlemek veya rehabilite etmek. Nöromüsküler bulaşmanın etkinliğinin modülasyonu, nöromotor performansı büyük ölçüde etkiler. Nörotrofinin ailesi, sinir büyüme faktörü (NGF), beyin türevi sinir büyüme faktörü (BDNF), nörotrofin 3 (NTF3) ve NTF4 12 , 13&#39;ü içerir . Nörotrofinlerin sinaptik etkinliği 1 , 4&#39;ü modüle ettiği gösterilmiştir. Hepatosit büyüme faktörü, dönüştürücü büyüme faktörü beta ve fibroblast büyüme faktörü son zamanlarda insanlarda vokal kıvrım skarlanması 15-17 tedavisinde kullanılmıştır. NTF4 ayrıca NMJ etkinliğini düzenler; NTF4&#39;ten yoksun fareler , 11 , 18 , 19 numaralı NMJ&#39;leri parçalamıştır. Bu çalışmalar, tedavi edici etkilere yol açmaktadırLaringeal kas bozukluklarının yaşlanması ve büyüme faktörleri ile denervasyon. Vokal kıvrımların dokularına direkt enjeksiyon tedavileri insanlarda eşi benzeri görülmez. Örneğin, botulinum toksininin lokal enjeksiyonları şu anda spazmodik disfoni ve bilateral tekrarlayan laringeal sinir paralizisi gibi larenks kaslarını etkileyen nörolojik hareket bozuklukları için etkili bir tedavi olarak kullanılmaktadır 20,21. Hyaluronik asit hidrojel, vokal kat korkutma ve glotal yetmezliği tedavi etmek için kullanılan başka bir enjekte edilebilir 22 , 23 . Enjeksiyon larinkoplasti, çeşitli iletişim bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir 24 . Bu doğrudan enjeksiyon yöntemleri vokal fonksiyonu iyileştirmek ve yaşlanan popülasyonlarda yutmak için söz verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurotrophin 4</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>450-04</td>
			<td>200ng in 50&#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet Osmotic Pump</td>
			<td>DURECT Corporation</td>
			<td>2001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176; endoscope</td>
			<td>Stoltz</td>
			<td>61029D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm 30 gauge 100-&#956;l syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84850 and 201812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline (sodium chloride solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G 5/8 needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic ointment</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>44-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Decon</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine (Betadine)</td>
			<td>Purdue Pharma L.P.</td>
			<td>606404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>731-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 nylon suture thread</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>PMN-518R6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crile hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delicate suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>49756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Merritt Veterinary Supplies</td>
			<td>148700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibiotic ointment</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>57110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acepromizine Aceproject</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>50033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction box (anesthetizing box)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxygen compressed tank</td>
			<td>Scott Gross</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plexiglas platform</td>
			<td>Small Parts Inc (Amazon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber tipped forceps</td>
			<td>Fine science tools rubber</td>
			<td>11075-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid rubber for forceps above</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td>42518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic spectula (BD syringe cut to length)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>halogen light source rhino-laryngeal stroboscope</td>
			<td>Kay-Pentax</td>
			<td>RLS 9100 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video recorder</td>
			<td>Kay-Pentax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat Mictotom HM525</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HM 525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill 1 hematoxylin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10143-142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon eosin-Y alcoholic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-X phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anaesthesia machine</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>CDS 9000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcutaneous neurotrophin 4 infusion using osmotic pumps or direct muscular injection enhances aging rat laryngeal muscles

Yaşlılarda laringeal işlev bozukluğu, ses bozukluklarından disfajiye ve hava yolu koruyucu reflekslerde azalmaya neden olan önemli bir sakatlık nedenidir. Yaşa bağlı laringeal kas disfonksiyonunu hedef alan az sayıda, varsa, terapiler mevcuttur. Nörotrofinler, kas innervasyonu ve nöromüsküler kavşakların (NMJ&#39;lerin) farklılaşmasına katılırlar. Nörotrofinlerin nörotransmitter salınımını arttırarak nöromüsküler iletimi arttırdığı düşünülmektedir. Nöromusküler kavşaklar (NMJ&#39;ler) fonksiyonel denervasyon bulguları ile sıçan laringeal kas yaşlanmasında daha küçük ve daha az miktarda bulunur. İnsanın laringeal kas yaşlanmasında fonksiyon geliştirmek için NTF4&#39;ün ileride klinik kullanıma yönelik terapötik olarak etkilerini araştırdık. Burada, sıçan laringeal kasının yaşlanması NTF4 uygulamasına tepki olarak yeniden şekillenme yeteneğini araştırmak için sistemik uygulama ve doğrudan NTF4 enjeksiyonu için ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Bu yöntemde, sıçanlar NTF4&#39;ü ya sistemik olarak oSmotik pompa veya vokal kıvrımlar yoluyla doğrudan enjeksiyon yoluyla uygulanabilir. Larinks kasları ayrıldı ve morfolojinin histolojik incelenmesi ve yaşla ilişkili denervasyon için kullanıldı.

Sıçanlar, 2 hafta ozmotik pompa infüzyonundan sonra veya NTF4&#39;ün doğrudan enjeksiyonundan 1 hafta sonra ötenazi yapıldı. Larenjler hasat edildi, kriyoprotektan (% 30 sükroz ve% 70 fosfat tamponlu salin) içine yerleştirildi ve daha sonra bir kriyostat ile 10 um&#39;lik genişlikte kesit olarak kesildi. Yaşlanma laringeal kasları, NTF4 25&#39;in uygulanmasından etkilenir. Genç ve yaşlı sıçanın yanısıra, tiroidenoid kasların enjekte edilen ve enjekte edilmeyen tarafı karşılaştırıldı. Tipik olarak, NTF4 uygulama yoluna bağlı olarak değişen yaşla beraber lif boyutunda bir değişiklik görüyoruz ( Şekil 5 ). Az görülen fibroz da tedaviden sonra nitel olarak gözlemlenir. Denervasyon yapılan liflerin yüzdesi NTF4&#39;ün yaşlı sıçanlarda sistemik ve doğrudan uygulanmasıyla azalmaktadır ( Şekil 6 ). NMJs miktarı da artar ( Şekil 7 ). Bu artışın önemi de<html> Tedavi süresine veya uygulama rotasına bağlıdır. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig1.jpg" /> Şekil 1: Osmotik Pompanın Temsili Görüntüsü. Pompayı NTF4 ile doldurduktan sonra, akış moderatörü pompayı kapatmak için ana gövdeye yerleştirilir. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig2.jpg" /> Şekil 2: Enjeksiyon Prosedürü Platformu. Sıçan, platform üzerinde sırtüstür bir duruşa yerleştirilir ve platformun üst kısmına monte edilmiş bir kılavuz tel vasıtasıyla ön üst kesici dişlerle asılır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: Şırınganın Temsili Görüntüsü. Şırıngayı NTF4 ve tuz karışımı ile doldurun. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig4.jpg" /> Şekil 4: Enjeksiyon Prosedürü. ( A ) Şırınga, 19.9 mm 30 ° endoskopa (gösterilmiştir) bağlanır; (B) Işık ışığı işlem için ışık olduğundan emin olmak için kontrol edilir; ( C ) Gerçek zamanlı video iğnenin doğru yere yönlendirilmesini sağlar. <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig5.jpg" /> Şekil 5: Elyaf Boyutunda ve Morfolojide Değişiklikler. Temsilci o26 , 27 , 28. 30 aylarda sistemik NTF4 7 günlük tedavi edilen (sağdaki) ve işlenmemiş (sol) tiroksinoid kasların matoksilen ve eozin boyalı kesitleri. Kontrolten işlenmiş hayvanlara elyaf boyutunda bir artış var. NTF4 ile tedavi, 30-mo lif boyutunu daha genç bir 6 aylık hayvanınkine değiştirir. * 30 aya karşılık p &lt;0.05 (resimler 40X büyütmede; Ölçek çubuğu = 25 μm, P &lt;0.001). Üstteki resimdeki oklar fibrozun bir alanını işaret eder. Ayrıca, muamele edilen hayvanlarda fibrozun nitel bir azalması vardır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig6.jpg" /> Şekil 6: İç DeğişikliklerNTF4 Tedavisi ile Tedaviler. 30 yaşındaki sistemik NTF4 14 günlük tedavi edilen (sağ) ve işlenmemiş (sol) tiroksinoid kaslardan temsilciler Nav1.5 lekeli bölümler (resimler 40X büyütme ile yakalandı; Ölçek çubuğu = 25 μm) 29 . Na v 1.5 etiketleme ile denervasyonun yaşla azalması vardır (yeşil). Sol panel, temsil edilmemiş Na v 1.5 (yeşil) ve phalloidin olup, tedavi edilmemiş tiroaritenoid kaslardan elyaf (kırmızı) lekelenmiş bölümleri belirtir, sağ panel tedavi edilen kaslardır. Yeşil ek, tek başına Na v 1.5 boyamadır. <img alt="Şekil 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig7.jpg" /> Şekil 7: NTF4 Tedavisi ile NMJ&#39;lerdeki değişiklikler. Sistemik NTF4&#39;ten NMJ&#39;lerin temsilci floresan mikroskobu görüntüleri, a-bungarotoksin (yeşil) ile etiketlenmiş farklı hayvanlardan 14 günlük tedavi edilen tiroksinoid kas bölümleri veFalloidin (kırmızı) NMJ sayısının 30 ayda NTF4 tedavisi ile arttığını gösteriyor (Ölçek çubuğu = 25 μm), (P &lt;0.001) 11 .

Watch this Scientific Journal Video about Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles at JoVE.com

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Burada, sistemik olarak ve direkt olarak sıçan yaşlanmasına bağlı laringeal kasların yeniden şekillendirilmesi için nevrotropin 4&#39;ü (NTF4) tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Osmotik Pompalar veya Doğrudan Kas Enjeksiyonu Kullanılarak Subkutanöz Neurotrophin 4 İnfüzyonu, Yaşlanan Farenin Larinks Kaslarını Arttırır

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

subcutaneous-neurotrophin-4-infusion-using-osmotic-pumps-or-direct

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Görüntüleme.  University of Kentucky.  Burada, sistemik olarak ve direkt olarak sıçan yaşlanmasına bağlı laringeal kasların yeniden şekillendirilmesi için nevrotropin 4'ü (NTF4) tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. 

Video: Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

Sıçan Memesi Bezinde Dallanma Yoğunluğunun Nicelleştirilmesi Sholl Analiz Yöntemini Kullanarak Bütünüyle Tutturulur

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...