이 연구는 난청 및 기타 의사 소통 장애 (R21DC010806에서 CAM 및 JCS로, R01DC011285에서 CAM로)의 국립 연구소로부터의 보조금에 의해 지원되었습니다.

이 프로토콜에 대해 6 개월에서 30 개월 된 수컷 Fischer 344-Brown Norway 쥐를 사용하십시오. 랫트는 국립 늙은 쥐 서식지 연구소 (National Institute of Aging)의 설치류 식민지에서 얻은 것이다. 랫트 후두의 구조는기도 보호 및 종 특이 적 발성을 위해 기능적으로 작용하는 인간의 것과 유사하기 때문에 본 연구를 위해 쥐를 사용했다.이 연구는 실험실 동물의 인간애 관리 및 사용에 관한 PHS 정책에 따라 수행되었으며, 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 안내서 및 동물 복지법 (7 USC 외); 동물 사용 프로토콜은 University of Kentucky의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었습니다. 1. 쥐의 마취 <ol><li> 완충 식염수에 ketamine hydrochloride (해리 성 마취제)와 xylazine hydrochloride (진정제 및 진통제)를 혼합하여 마취약을 준비합니다. 최종 용액에서 ketamine과 xylazine의 농도는 kg 당 100 mg / 8 mg체중 각각. </li><li> 25G 바늘과 주사기를 사용하여 intraperitoneal 투여하여 쥐에 마취제를 주사. </li><li> 쥐가 포셉과 발가락이나 발을 꼬집어 의해 충분히 anesthetized 있는지 확인하십시오. 쥐가 꼬집음에 반응하지 않으면 수술을 시작할 수 있습니다. 쥐가 반사 또는 근육 수축으로 발가락 핀치에 반응하면 1 ~ 2 분을 기다렸다가 핀치 테스트를 반복하십시오. 쥐가 다시 반응하면 쥐를 새 동물로 바꾸고 1.2 단계부터 시작하여 절차를 반복하십시오. </li><li> 쥐가 움직이지 않으면 각막이 마르지 않도록 쥐의 눈에 안 연고를 바릅니다. </li></ol> 2. 삼투압 펌프 이식 <ol><li> 쥐를 무균 수술 부위에 복강으로 놓습니다. Preanesthetic 약물로 meloxicam를 관리하십시오. 25G 주사 바늘이 달린 주사기를 사용하여 체중 1kg 당 1-4mg의 용량으로 복강 내 투여. </li><li> 클리퍼를 사용하여 근사치 제거목 뒤에서 모피 1 &quot;x 1&quot;정사각형, 어깨 사이에 약 1 &quot;꼬리 공간. 가능하면 피부 가까이에 면도하십시오. </li><li> 에탄올 소독 (70 %)으로 목과 뒷부분을 적시십시오. </li><li> 면도 후, 알코올로 요오드 - 알코올 마무리를 연속적으로 3 번 문지르면 목의 등면을 문지릅니다. </li><li> 34 ° C로 설정된 가열 패드 위에 놓아 쥐의 체온을 유지하십시오. </li><li> 전신 NTF4 처리를 위해 50 μL의 NTF4 또는 식염수로 무균 처리 된 삼투 펌프를 채 웁니다 ( 그림 1 ). <ol><li> 메스를 사용하여 피부를 가로 지르는 약 2cm의 수평 절개를하고, 견갑골 사이의 공간으로 단지 두개의 절개를하십시오. 한쪽 손으로 겸자로 절개의 후부 가장자리를 들어 올리면서 hemostats의 팁을 삽입하고 절개 부분을 부드럽게 밀어 넣습니다. </li><li> 지혈 기 끝이 약 2 cm c목덜미를 절개 부위에 놓고 지혈대의 손잡이를 열어 절개 부위의 피하에 중공 &quot;포켓&quot;을 형성하도록 팁을 확장시킵니다. 이것은 펌프의 배치 사이트가됩니다. </li></ol></li><li> NTF4의 상호 작용과 포켓 절개 부위의 치유를 최소화하기 위해 삽입시 펌프 전달 포털 끝을 먼저 배향하십시오. </li><li> NTF4 생리 식염수 50 μL를 7 14 일 동안 전달하십시오. 7 일군은 6.72 mg / day의 NTF4를 투여 받았고 총 용량은 47.04 mg이었다. 14 일군은 6.72 mg / 일을 투여 받았고 총 용량은 94.08 mg NTF4 25 이었다. </li><li> 5-0 나일론 봉합사, hemostats 및 포셉 펌프 배치를 위해 만들어진 절개를 닫습니다. </li><li> 마취에서 회복되면서 최소 30 분 동안 쥐를 관찰하십시오. 모니터링 완료 기준은 동물이 활성화되고, 새장 주위로 이동하고, 식수를 공급하고, 정리와 같은 기타 정상적인 활동을 시작하는 것을 포함합니다. </li><li> 매일 동물 관찰수술 부위의 치유, 정상적인 사료 및 물 소비, 소변 / 대변 통과, 스트레스, 통증 또는 기타 수술후 합병증의 비정상적인 행동 징후를 관찰하여 첫 주. </li><li> 쥐가 통증이나 고통을 겪고있는 것으로 나타나면 통증 완화를 위해 최대 24 시간마다 carprofen을 5 mg / kg 피하 주사하여 5 일 동안 투여하십시오. </li><li> 감염이있는 경우 수의사와상의하여 상처가 적절하게 치료되도록하십시오. </li><li> 어떤 실험 그룹에 따라 쥐가에 스레드에서 자극을 방지하기 위해 수술 후 7-10 일 5-0 나일론 봉합을 제거합니다. </li></ol> 3. 직접 주입을위한 쥐의 마취 <ol><li> 수술 전날 밤에 쥐에게서 음식물을 보류하십시오. 이렇게하면 내시경이나 주사 바늘을 막을 음식이 없습니다. </li><li> 쥐를 체중을 줄이고 아세 롤마 민 1 ~ 2 mg / kg 체중을 준비하십시오. 근육 주사로 주사하십시오 (IM 위치는thyroarytenoid 근육을 떠났다. </li><li> 유도 상자에 쥐를 놓으십시오. 5 % isoflurane과 1 LO 2로 유도 상자에서 마취를 유도하십시오. </li><li> 2 % isoflurane과 600mL O 2 를 사용하여 쥐 원추로 쥐를 이동하십시오. </li><li> 쥐가 포셉과 발가락이나 발을 꼬집어 의해 충분히 anesthetized 있는지 확인하십시오. 쥐가 핀치에 반응하지 않으면 주사 프로토콜을 시작할 수 있습니다. 쥐가 반사 또는 근육 수축으로 발가락 핀치에 반응하면 1 ~ 2 분을 기다렸다가 핀치 테스트를 반복하십시오. 쥐가 다시 반응하면 쥐를 새 동물로 바꾸고 단계 3.4부터 시작하여 절차를 반복하십시오. </li></ol> 4. 직접 주입 및 시각화 <ol><li> NTF4 또는 생리 식염수가 포함 된 무균 적으로 준비한 50 μL 용량을 주사하기 전에 30 분 동안 25 ° C로 설정된 H2O 배스에 놓습니다. </li><li> 플렉시 유리 플랫폼 ( 그림 2 )에서 쥐를 앙와위 자세로 올려 놓습니다. Sus플랫폼의 꼭대기를 가로 지르는 가이드 와이어를 통해 정면 상단 절치에서 젖혀지는 자세로 쥐를 지키십시오. </li><li> 50 mm, 30 게이지, 100 μL 주사기를 1.9 mm, 30 ° sinus 내시경에 부착하십시오 ( 그림 3 ). 참고 : 주사기 어셈블리는 내시경의 외벽에 캐뉼라를 단단히 고정하는 지그를 통해 부착됩니다. 내시경은 성대의 시각화 및 구강 내 주사기 안내를 허용합니다. 각 동물에 앞서 캐 뉼러 팁의 위치를 ​​조정하여 팁이 내시경보기를 통해 완벽하고 명확하게 보이는지 확인합니다 ( 그림 4 ). </li><li> 혀를 연장하고 그것을 옆으로 움직이려면 고무로 깎은 한 쌍의 집게를 사용하십시오. 그런 다음 구강 개통을 유지하기 위해 플라스틱 견본을 삽입하십시오. 1.5 ~ 2 cm 길이로 자른 5 mL 플라스틱 시린지 배럴에서 검체를 만들고, 절단 된 가장자리는 떨림을 제거하고 부드럽게 연마합니다. </li><li> 루아의 조명을 끄십시오.할로겐 광원을 내시경에 부착하십시오. 비디오 레코더를 켜서 절차를 캡처하십시오. </li><li> 쥐의 입에 넣을 때 유리 팁에 결로 현상을 최소화하기 위해 내시경의 말단을 따뜻한 물에 몇 초 동안 담그십시오. </li><li> 모니터의 시각적 피드백을 사용하여 바늘을 왼쪽 성대 영역으로 조심스럽게 당깁니다. </li><li> 성대에 완전히 접근하기 위해 동물 호흡주기의 흡기 단계로 용액 주입을 시간을 재십시오. 호흡의 흡기 단계에서 성대가 완전히 노출됩니다. <ol><li> 성대가 완전히 보이면, 바늘을 음성 골격의 흰색 중앙 가장자리 옆쪽에있는 왼쪽 thyroarytenoid에 삽입하십시오. 주사 바늘을 제 위치에 놓고 주사기의 우울증을 통해 주사액을 전달하십시오. </li></ol></li><li> 내시경과 비디오 플레이어의 할로겐 광원을 끄고 ro를 다시 켭니다.옴 조명. </li><li> 쥐를 집에 넣고 가열 패드에 놓습니다. </li><li> 발열 패드에서 제거하기 전에 쥐가 회복되도록하십시오. 새장에서 음식과 물을 교체하십시오. </li><li> 주입 후 7 일 동안 래트를 모니터링 한 다음 안락사하십시오. 절제를위한 후두 제거 24 . </li></ol> 5. 쥐의 안락사 <ol><li> 쥐를 케타민 하이드로 클로라이드 및 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (체중 kg 당 100mg / 8mg 복강 내 주사)로 마취시킨다. </li><li> 내측 thoracotomy 다음 exsanguination에 의해 안락사. </li></ol>

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후두 근육은 노화의 부작용에 취약합니다. 이전의 연구들은 수축 기능과 myosin isoform 변이의 변화뿐만 아니라 섬유 크기, 총 섬유 수, 재생 능력, NMJ 크기 및 양 변화에 대한 후두 근육의 변화를 보여주었습니다 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . 노화 후두 근육은 신경 영양소의 적용으로 바꿀 수 있습니다. 이러한 변화는 쉽게 측정 할 수 있습니다. 따라서 쥐의 후두 근육은 노화와 성대 질환 / 장애의 영향을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다. 이 근육의 연구는 또한 노화 된 인간의 개입이나 보호 과정을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. NTF4를 전신 또는 직접 투여하는 우리의 방법은 쥐의 후기 후두에서 개조 반응을 일으킨다근육. 이것은 신경 영양소가 노화 관련 근육 기능 장애에 치료 적 잠재력을 가질 수 있음을 보여줍니다. 뉴로 트로 핀의 직접적인 적용은 주입 벡터를 통한 성숙한 노화의 인간 모델로 쉽게 전환 될 수 있습니다 25 . 주입 프로토콜을 사용할 때 고려해야 할 많은 요소가 있습니다. 첫째, 내시경의 끝 부분에 날카로운 바늘이 부착되어있어 후두 현관 주변의 연조직에 긁힘과 부상을 입지 않도록주의해야합니다. 두 번째로, 동물의 호흡주기의 흡기 단계에서 바늘 끝의 움직임을 후두에 맞춰 타이밍을 정확하게 잡는 것이 연습입니다. 셋째, 사전에 컴퓨터 모니터의 장치를 육안으로 검사하여 절차를 시도하기 전에 바늘 끝이 명확하게 보이는지 확인하십시오. 넷째, 내시경 팁을 몇 초 동안 온수로 데우는 것이 엔도의 흐림을 확실히하는 중요한 단계입니다.스코프 팁은 피할 수 있습니다. 마지막으로, 스코프 프로 시저가 생기기 전날 밤에 래트를 금식하는 것도 중요합니다. 음식을 보류하지 않으면 여전히 인두에 음식물 잔류 물이 남아있어 주사 절차를 거의 수행 할 수 없게 될 가능성이 큽니다. 쥐에게 매일 탈수 증상이 있는지 검사하고 체중 감량 (체중의 10 % 이상)이 없는지 확인하기 위해 체중을 측정해야합니다. 프로토콜의 개발에있어 중요한 두 단계는 주사기를 내시경에 부착하고 구강 검경을 사용하는 것이 었습니다. 주사기 어셈블리를 단단히 고정하는 것은 스코프 삽입 및 주입을위한 한 손으로 조작 할 수 있도록하기 위해 필요했습니다. 이 연구의 목표를 고려할 때 성대의 주입을 안내하는 직접적인 시각화가 없다면 실험을 실현할 수 없었을 것입니다. 또한, 구강 검경의 생성은 혀가 움직이지 않도록 유지하는 데 중요하다고 생각되었다.e 후두개가 수술 과정 전반에 걸쳐 열린다. 시각적 인 안내 주입 방법은 주사기와 바늘을 내시경에 단단히 고정시키는 최적의 방법을 찾는 것과 관련된 몇 차례의 수정을 거쳤습니다. 몇 가지 다른 형태의 테이프 접착제를 시험 한 결과 시판용 탄성 테이프가 주사기를 내시경 몸체에 고정시키는 가장 좋은 방법이라는 것이 밝혀졌습니다. 시각적 안내 주입 방법의 가장 큰 한계는 계측과 관련이 없으며 특허 인두와기도가 있어야한다는 것입니다. 절차 24 시간 전에 음식을 제한하면이 문제가 대부분 해결되지만 쥐는 침구와 배설물을 포함하여 우리의 새장에있는 모든 것을 섭취합니다. 이것이 발생했을 때, (1) 동물이 인두를 자연적으로 제거 할 때까지 주입을 연기하거나, (2) 포셉을 사용하여 수동으로 막히기를 시도하는 두 가지 해결책이있었습니다. 우리의 경험 이었어.e는 동물의 인두 부위의 잠재적 상해의 위험을 감소시키기 때문에 전자가 더 나은 선택 이었음을 나타냅니다. 이 프로토콜의 참신함과 성대에 화합물을 직접 주입 할 필요성을 감안할 때 다른 신뢰할 수있는 방법은 없습니다. 동물 후두 시스템의 작은 크기를 감안할 때, 살아있는 동물에 화합물의 정확하고 일관된 배치를 보장하는 유일한 방법으로 구강 및 인두 부위를 통한 시각적 안내 주사. 성대를 직접 주사하는 유일한 방법은 후두의 피부와 연골을 통해 외부 위치에서 그렇게하는 것입니다. 후두 근육 긴장 이상을 완화하기 위해 보툴리눔 독소 치료법을 시행하는 사람에게는이 방법이 성공적으로 수행되지만, 경피적 주사 방법은 작은 동물에게는 적합하지 않습니다. 이 기술은 강력하며 성대의 주사뿐만 아니라 주사 부위의 경우에도 사용할 수 있습니다.인두 및 구강. 또한이 방법은 주사기를 제거하여 인두 및 후두 동물을 간단하게 시각적으로 모니터링 할 수 있습니다. 요약하면,이 주사 방법은 인간의 노화와 관련된 음성 기능 장애의 치료와 관련된 생물학적 기작을 연구하는 새로운 수단입니다. 이 방법은 또한 사람의 음성, 음성 기능, 의사 소통 및 삼킴에 영향을 미치는 다른 질병 모델에도 적용될 수 있습니다.

후두 근육은 신속하고 지속적으로 수축하며 노화의 부작용에 취약합니다. 이 지속적인 활동은 65 세 이상의 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 명에서 관찰되는 목소리 문제 또는 연하 장애에 기여하는 것으로 생각됩니다. 몇 가지 분자 및 pathophysiologic 메커니즘이 나이 관련 기능 장애에 기여한다. 이러한 메커니즘은 후두 점막의 재건, 근육 섬유 위축 또는 손실, 성대의 굽힘과 성문 폐쇄의 원인이되는 근섬유 재생 또는 위축의 결핍을 포함 할 수 있습니다 8 , 9 , 10 , 11 . 현재로서는 입증 된 의학 요법이 없습니다.이러한 근육의 연령 관련 변화를 철저히 예방하거나 재활시킵니다. 신경근 전달의 효과를 조절하면 신경 모터의 성능에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 뉴로 트로 핀의 계열은 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 파생 신경 성장 인자 (BDNF), 뉴로 트로 핀 3 (NTF3) 및 NTF4 12 , 13을 포함 한다. 뉴로 트로 핀은 시냅스 효능을 조절하는 것으로 나타났습니다. 간세포 성장 인자, 형질 전환 성장 인자 베타 및 섬유 아세포 성장 인자는 최근 성대 흉터 치료를 위해 인간에서 사용되어왔다. NTF4는 또한 NMJ 효과를 조절합니다. NTF4가 결핍 된 마우스는 해체 된 NMJs 11 , 18 , 19를 보여준다. 이 연구는 치료자의 유망한 효과를 가져옵니다고령화 된 후두 근육 장애 및 성장 인자로 인한 노화. 성대 주름의 조직에 대한 직접 주사 치료제는 인간에게 전례가 없습니다. 예를 들어, 보툴리누스 독소의 국소 주사는 경련성 발성 장애 및 양측 재발 성 후두 신경 마비와 같은 후두 근육에 영향을 미치는 신경 학적 운동 장애에 대한 효과적인 치료법으로 현재 사용되고 있습니다 20 , 21 . Hyaluronic acid hydrogel은 보컬 폴드 징후와 성문 기능 부전을 치료하는 데 사용되는 또 다른 주사제입니다 22 , 23 . 주사 후두 성형술은 다양한 의사 소통 장애 치료에 사용될 수 있습니다 24 . 이러한 직접적인 주사 방법은 노령 인구에서 보컬 기능과 삼킴을 향상시킬 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurotrophin 4</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>450-04</td>
			<td>200ng in 50&#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet Osmotic Pump</td>
			<td>DURECT Corporation</td>
			<td>2001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176; endoscope</td>
			<td>Stoltz</td>
			<td>61029D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm 30 gauge 100-&#956;l syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84850 and 201812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline (sodium chloride solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G 5/8 needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic ointment</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>44-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Decon</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine (Betadine)</td>
			<td>Purdue Pharma L.P.</td>
			<td>606404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>731-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 nylon suture thread</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>PMN-518R6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crile hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delicate suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>49756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Merritt Veterinary Supplies</td>
			<td>148700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibiotic ointment</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>57110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acepromizine Aceproject</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>50033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction box (anesthetizing box)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxygen compressed tank</td>
			<td>Scott Gross</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plexiglas platform</td>
			<td>Small Parts Inc (Amazon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber tipped forceps</td>
			<td>Fine science tools rubber</td>
			<td>11075-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid rubber for forceps above</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td>42518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic spectula (BD syringe cut to length)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>halogen light source rhino-laryngeal stroboscope</td>
			<td>Kay-Pentax</td>
			<td>RLS 9100 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video recorder</td>
			<td>Kay-Pentax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat Mictotom HM525</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HM 525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill 1 hematoxylin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10143-142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon eosin-Y alcoholic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-X phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anaesthesia machine</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>CDS 9000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcutaneous neurotrophin 4 infusion using osmotic pumps or direct muscular injection enhances aging rat laryngeal muscles

노인에서 후두 장애는 음성 장애에서부터 연하 장애로,기도 보호 반사 신경 장애로 이어집니다. 연령 관련 후두 근육 기능 장애를 표적으로하는 치료법은 거의 없습니다. 뉴로 트로 핀 (neurotrophin)은 근육 신경 분포 및 신경근 접합부 (NMUs)의 분화에 관여합니다. 뉴로 트로 핀은 신경 전달 물질 방출을 증가시킴으로써 신경근 전달을 향상시키는 것으로 생각됩니다. neuromuscular junctions (NMJs)는 노화 된 쥐의 후두 근육에서 작고 덜 풍부 해지고, 기능적 소실의 증거가 있습니다. 우리는 노화 후두 근육의 기능을 향상시키는 치료제로서 미래의 임상 적 사용을위한 NTF4의 효과를 탐구했다. 여기서는 NTF4 적용에 대한 반응으로 쥐의 두드러기 후두 근육이 재 형성되는 능력을 조사하기 위해 NTF4의 전신 투여 및 직접 주사에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법에서는 쥐가 NTF4를 전신적 으로 o자극적 인 펌프 또는 성대를 통한 직접 주입에 의한 것입니다. 후속 근육을 절개하여 형태학 및 연령 관련 소실에 대한 조직 학적 검사에 사용 하였다.

2 주 동안 삼투압 펌프를 주입하거나 NTF4를 직접 주입 한 후 1 주일 동안 랫트를 안락사시켰다. 후두를 수확하고 동결 방지제 (30 % 자당 및 70 % 인산 완충 생리 식염수)에 넣은 다음 저온 유지 장치를 사용하여 10-μm 폭으로 연속 절편을 만들었습니다. 나이가 들어간 후두 근육은 NTF4 투여로 영향을받습니다 25 . 젊고 오래된 쥐 이외에, 우리는 thyroarytenoid 근육의 주입 된 것과 주입되지 않은 것을 비교했다. 일반적으로 NTF4의 투여 경로에 따라 연령에 따라 섬유 크기가 달라집니다 ( 그림 5 ). 섬유화가 적 으면 치료 후에도 질적으로 관찰됩니다. 노화 된 래트에서 NTF4의 전신 투여 및 직접 적용으로 탈질 된 섬유의 백분율이 감소한다 ( 도 6 ). NMJ의 양도 증가한다 ( 그림 7 ). 이 증가의 중요성은 de<html> 치료 기간 또는 투여 경로에 따라 달라집니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig1.jpg" /> 그림 1 : 삼투압 펌프의 대표 이미지. 펌프를 NTF4로 채운 후 유량 조절기를 본체에 삽입하여 펌프를 밀봉합니다. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig2.jpg" /> 그림 2 : 주입 절차를위한 플랫폼. 랫트를 플랫폼 위에 눕힌 자세로 놓고 플랫폼 상단에 장착 된 가이드 와이어를 통해 전두부 절치에 매달았다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 : 주사기의 대표 이미지. NTF4와 염분 혼합물 주사기를 채우십시오. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig4.jpg" /> 그림 4 : 주입 절차. ( A ) 주사기는 19.9mm 30 ° 내시경에 연결됩니다 (그림 참조). (B) 시신경 조명을 점검하여 수술을위한 빛이 있는지 확인하십시오. ( C ) 실시간 비디오는 바늘이 올바른 위치로 안내되도록합니다. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig5.jpg" /> 그림 5 : 섬유 크기와 형태의 변화. 대표자matoxylin과 eosin은 26 개월 , 27 개월 , 28 개월에 전신 NTF4 7 일 처리 (우측) 및 치료하지 않은 (좌측) thyroarytenoid 근육의 절편을 염색 하였다. 대조군에서 처리 된 동물에 이르기까지 섬유 크기가 증가합니다. NTF4로 치료하면 30 개월짜리 섬유 크기가 젊은 6 개월 된 동물의 크기로 바뀝니다. * p &lt;0.05 대 30 개월 (사진은 40X 배율로 촬영 한 것으로 Scale bar = 25μm, P &lt;0.001). 위쪽 그림의 화살표는 섬유증 부위를 가리 킵니다. 또한 처리 된 동물에서 섬유화의 질적 감소가있다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig6.jpg" /> 그림 6 : 내부의 변화NTF4 치료법이 적용됩니다. 대표 Nav1.5 시스템 NTF4에서 섹션을 스테인드 섹션 30 일 개월 (사진 40X 배율로 촬영했다, 스케일 바 = 25 μm의) 29 일 (오른쪽)과 치료되지 않은 (왼쪽) thyroarytenoid 근육 29 . Na v 1.5 표시 (녹색)에 의한 노화에 따른 황반화가 감소합니다. 왼쪽 패널은 치료되지 않은 thyroarytenoid 근육에서 섬유 (빨간색)로 염색 된 섹션을 나타내는 Na v 1.5 (녹색) 및 phalloidin을 대표하며 오른쪽 패널은 근육을 치료합니다. 녹색 인서트는 Na v 1.5 염색 혼자입니다. <img alt="그림 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig7.jpg" /> 도표 7 : NTF4 처리를 가진 NMJs에있는 변화. 전신 NTF4에서 NMJs의 대표 형광 현미경 이미지 α - bungarotoxin (녹색)와 레이블이 다른 동물에서 14 일 치료 thyroarytenoid 근육 섹션 및phalloidin (red)은 NMJ 수치가 NTF4 치료 30 개월 (Scale bar = 25 μm)에서 증가하는 것을 보여 주며 (P &lt;0.001) 11 .

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Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

여기에서 우리는 쥐 노화 후두 근육을 재구성하기 위해 전신적으로 그리고 직접적으로 뉴로 트로 핀 4 (NTF4)의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시합니다.

삼투압 펌프 또는 직접적인 근육 주사를 이용한 피하 뉴로트로핀 4 주입으로 노화 후두 근육 강화

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

subcutaneous-neurotrophin-4-infusion-using-osmotic-pumps-or-direct

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K 조회수.  University of Kentucky.  여기에서 우리는 쥐 노화 후두 근육을 재구성하기 위해 전신적으로 그리고 직접적으로 뉴로 트로 핀 4 (NTF4)의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시합니다. 

비디오: Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

연구

발생학

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...