עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (R21DC010806 ל- CAM ו- JCS ו- R01DC011285 ל- CAM).

השתמש זכר Fischer 344-Brown חולדות נורבגיה בגיל 6 ו 30 חודשים של גיל עבור פרוטוקול זה. חולדות התקבלו מן המכון הלאומי של זקנה מכרסמים המושב. השתמשנו עכברושים עבור מחקר זה, כי המבנה של הגרון חולדה דומה לזו של האדם, פונקציונלית המשרתים להגנה על דרכי הנשימה ו vocalizations המין המיוחד מחקר זה בוצע בהתאם למדיניות PHS על טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה, מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, וחוק רווחת בעלי חיים (7 USC et seq); פרוטוקול השימוש בבעלי חיים אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) של אוניברסיטת קנטקי. 1. הרדמה של חולדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרדמה על ידי ערבוב קטמין הידרוכלוריד (הרדמה דיסוציאטיבית) ו xylazine hydrochloride (הרגעה משכך כאבים) ב שנאגרו מלוחים. ריכוז ketamine ו xylazine בפתרון הסופי הם 100 מ&quot;ג / 8 מ&quot;ג לק&quot;גמשקל הגוף בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הרדמה לתוך החולדה על ידי הממשל intraperitoneal באמצעות מזרק עם מחט 25 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כי החולדה הוא הרדים מספיק על ידי צביטה הבוהן או הרגל עם מלקחיים. אם החולדה לא מגיבה על קמצוץ, ואז הניתוח יכול להתחיל. אם החולדה מגיבה על קמצוץ הבוהן עם התכווצויות רפלקס או שריר, ואז לחכות 1-2 דקות לחזור על מבחן קמצוץ. אם החולדה מגיבה שוב, להחליף את החולדה עם בעל חיים חדש הליך חוזר החל מ שלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיל משחה עיניים לעיניים של חולדה, לאחר החולדה הוא נייח, כדי למנוע את הקרניות להתייבש. </li></ol> 2. אוסמוטי משאבת ההשתלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה הגחון על אזור כירורגי aseptic. ניהול meloxicam כתרופה preanesthetic. ניהול intraperitoneally במינון של 1-4 מ&quot;ג / ק&quot;ג של משקל הגוף באמצעות מזרק עם מחט 25 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקוצץ כדי להסיר קירובTale 1 &quot;x 1&quot; מרובע פרווה מגב הצוואר, וכ 1 &quot;הזנב של שטח בין כתפיים. להתגלח קרוב ככל האפשר לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטוב את הגב והצוואר עם אתנול חיטוי (70%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גילוח, לשפשף את היבט הגב של הצוואר עם 3 מקרצף ברצף של אלכוהול האלכוהול הגמר עם אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה על ידי הנחת אותו על כרית חימום מוגדר 34 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים משאבות אוסמוטי מוכן aseptically עם או 50 μL של NTF4 או מלוחים עבור טיפול NTF4 מערכתית ( איור 1 ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי לבצע חתך אופקית כ 2 ס&quot;מ רחב דרך העור, רק גולגולתי לחלל בין scapulae. הרם את הקצה האחורי של החתך עם מלקחיים עם יד אחת תוך החדרת קצה hemostats בעדינות דוחף אחורי החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצה hemostats הוא כ 2 ס&quot;מ cרץ את החתך, לפתוח את הידיות על hemostats, הרחבת הקצות כדי ליצור חלול &quot;כיס&quot; תת עורית לאתר החתך. זה יהיה המיקום מיקום המשאבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט את המשאבה משלוח הפורטל בסוף הראשון עם הכניסה כדי למזער כל אינטראקציה של NTF4 ואת הריפוי של אתר החתך כיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספק 50 μL של מלוחים NTF4 עבור 7 או 7 ימים. קבוצת 7 ימים קיבלה 6.72 מ&quot;ג ליום של NTF4 במינון כולל של 47.04 מ&quot;ג. קבוצת הגיל 14 קיבלה 6.72 מ&quot;ג ליום עבור מינון כולל של 94.08 מ&quot;ג של NTF4 25 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חוט 5-0 ניילון תפר, hemostats ו מלקחיים כדי לסגור את החתך עשה עבור מיקום המשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב חולדות במשך מינימום של 30 דקות כפי שהם להתאושש מהרדמה. הקריטריונים להשלמת הניטור כוללים את החיה להיות פעיל, נע על הכלוב, מי שתייה, ומתחילים פעילויות רגילות אחרות כגון טיפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג חיות היומיבשבוע הראשון על ידי התבוננות בריפוי של אתר כירורגי, תזונה נורמלית וצריכת מים וחולפת שתן / צואה, וכל סימנים התנהגותיים חריגים של לחץ, כאב או סיבוכים לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חולדה נראה כואב או מצוקה, לספק חולדה עם 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג הזרקת תת עורית של carprofen פעם כל 24 שעות עד 5 ימים כדי להקל על הכאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש זיהום, להתייעץ עם וטרינר כדי לגרום כי הפצע מרפא כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם קבוצה ניסיונית החולדה ב, להסיר את תפר 5-0 ניילון 7-10 ימים לאחר הניתוח כדי למנוע גירוי מהחוט. </li></ol> 3. הרדמה של חולדות להזרקת ישיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע מזון מן החולדות בלילה לפני ההליך. זה מבטיח כי אין מזון לחסום את אנדוסקופ או מחט הזרקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול חולדות ולהכין acepromazine 1-2 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף. להזריק intramuscularly (מיקום IM הואשריר thyroarytenoid שמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה בתיבה אינדוקציה. להשרות הרדמה בתיבה אינדוקציה עם 5% isoflurane ו 1 LO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את החולדה על חרוט האף עם isoflurane 2% ו 600 מ&quot;ל O 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כי החולדה הוא הרדים מספיק על ידי צביטה הבוהן או הרגל עם מלקחיים. אם החולדה לא מגיבה על קמצוץ, אז פרוטוקול ההזרקה יכול להתחיל. אם החולדה מגיבה על קמצוץ הבוהן עם התכווצויות רפלקס או שריר, ואז לחכות 1-2 דקות לחזור על מבחן קמצוץ. אם החולדה מגיבה שוב, להחליף את החולדה עם בעל חיים חדש הליך חוזר החל מ שלב 3.4. </li></ol> 4. הזרקה ישירה ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מוכן aseptically 50 μL מינונים המכילים NTF4 או מלוחים ב H 2 O אמבטיה להגדיר 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה במצב שכיבה ו שכיבה על פלטפורמת פרספקס ( איור 2 ). סוסמכופפים את העכברוש בתנוחה השעורה מהחלק העליון של החותכות הקדמיות, דרך חוט תיל המתוח על החלק העליון של הרציף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף 50 מ&quot;מ, 30 מד, 100 מזרק μL ל 1.9 מ&quot;מ, 30 ° סינוס אנדוסקופ ( איור 3 ). הערה: מכלול המזרק מחובר באמצעות חפיפה המחזיקה את הצינורית בחוזקה לקיר החיצוני של האנדוסקופ. האנדוסקופ מאפשר הדמיה של קפל ווקאלי והכוונה של מזרק intraorally. המיקום של קצה צינורית מותאם לפני כל חיה כדי להבטיח את קצה במלואו וברור לעין באמצעות תצוגה אנדוסקופית ( איור 4 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מוטה גומי מורט להאריך את הלשון ולהזיז אותו רוחבית. לאחר מכן, הכנס משקולת פלסטיק כדי לשמור על הפטנט בעל פה. הפוך את speculum מ 5 מ&quot;ל חבית פלסטיק חבית כי הוא חתך באורך של 1.5 עד 2 ס&quot;מ, עם הקצוות לחתוך deburred ו מלוטש חלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות ברוומ &#39;ו לצרף מקור האור הלוגן ל אנדוסקופ. הפעל את מקליט הווידאו כדי ללכוד את ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקצה הדיסטלי של אנדוסקופ במים חמים למשך כמה שניות כדי למזער את הפיתוח של עיבוי על קצה זכוכית כאשר מוכנס לתוך הפה של החולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משוב חזותי מהצג, בקפידה להנחות את המחט לאזור הקפל השמאלי השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן את הזרקת הפתרון עם השלב השראה של מחזור הנשימה של בעלי חיים כדי לגשת באופן מלא לקפל ווקאלי. במהלך שלב ההשראה של הנשימה, קפל הקול נחשף במלואו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קפל ווקאלי גלוי לחלוטין, הכנס את המחט לתוך thyroarytenoid שמאל, נמצא לרוחב קצה המדיאלי הלבן של קפל ווקאלי. עם המחט במקום, לספק את הזרקת דרך דיכאון של המזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מקור האור הלוגן על אנדוסקופ ונגן וידאו, ופנה בחזרה על roאורות אום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את החולדה לכלוב הבית שלה במקום על כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר עכברוש להתאושש לפני הסרת כרית החימום. החלף מזון ומים בכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב חולדות במשך 7 ימים לאחר ההזרקה ולאחר מכן להרדים. הסר את הגרונות עבור cryosectioning 24 . </li></ol> 5. הרדמה של חולדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדות עם קטמין הידרוכלוריד ו xylazine hydrochloride (100 מ&quot;ג / 8 מ&quot;ג לכל ק&quot;ג משקל גוף מוזרק זריקה intraperitoneal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים על ידי exsanguination לאחר thoracotomy המדיאלי. </li></ol>

<ol>
	<li>Trupe, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+and+consequences+of+eating+dependency+in+institutionalized+elderly.">Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly.</a> J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).</li><li>Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+the+voice+and+swallowing.">Aging of the voice and swallowing.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).</li><li>Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+on+the+effect+of+regulation+on+health+care+for+the+older+American:+a+tale+of+two+states.">A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states.</a> Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).</li><li>Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysphonia+in+the+elderly:diagnosis+and+management+of+age-related+voice+changes.">Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes.</a> South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).</li><li>Broniatowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+evaluation+and+treatment+of+patients+with+swallowing+disorders.">Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders.</a> Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).</li><li>Lundy, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration:+cause+and+implications.">Aspiration: cause and implications.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).</li><li>Schindler, J. S., Kelly, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swallowing+disorders+in+the+elderly.">Swallowing disorders in the elderly.</a> Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).</li><li>Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+neuromuscular+junctions+in+the+human+posterior+cricoarytenoid+muscles:+a+quantitative+study.">Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study.</a> Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).</li><li>Sinard, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+voice:+how+to+differentiate+disease+from+normal+changes.">The aging voice: how to differentiate disease from normal changes.</a> Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).</li><li>Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vocal+loudness+in+young+and+old+adults.">Control of vocal loudness in young and old adults.</a> J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>Lai, K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+signaling+of+new+players+at+the+neuromuscular+junction.">Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction.</a> J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+roles+in+neuronal+development+and+function.">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).</li><li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Trkb+mediated+signaling+induces+disassembly+of+postsynaptic+receptor+clusters+at+neuromuscular+junctions.">Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions.</a> Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).</li><li>Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+aged+vocal+folds:+first+human+case+treated+with+fibroblast+growth+factor.">Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor.</a> Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).</li><li>Branski, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+transforming+growth+factor-beta+1+on+human+vocal+fold+fibroblasts.">Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts.</a> Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).</li><li>Kishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exogenous+hepatocyte+growth+factor+on+vocal+fold+fibroblasts.">Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts.</a> Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).</li><li>Belluardo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+disassembly+and+muscle+fatigue+in+mice+lacking+neurotrophin-4.">Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4.</a> Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanisms+in+the+old+rat.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+initial+dosing+of+botulinum+toxin+in+treatment+of+adductor+spasmodic+dysphonia.">Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia.</a> Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).</li><li>Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cricothyroid+muscle+botulinum+toxin+injection+to+improve+airway+for+bilateral+recurrent+laryngeal+nerve+paralysis,+A+case+series.">Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series.</a> J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).</li><li>Coppoolse, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+study+of+composite+microgels+based+on+hyaluronic+acid+and+gelatin+for+the+reconstruction+of+surgically+injured+rat+vocal+folds.">An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds.</a> J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).</li><li>Herteg&#229;rd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linked+hyaluronan+used+as+augmentation+substance+for+treatment+of+glottal+insufficiency:+Safety+aspects+and+vocal+fold+function.">Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function.</a> Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).</li><li>Walker, W. F., Homberger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and dissection of the rat. , (1997).</li><li>Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+changes+in+the+expression+and+deposition+of+vocal+fold+collagen+and+hyaluronan.">Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan.</a> Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).</li><li>Stemple, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+aging+rat+laryngeal+muscles+with+endogenous+growth+factor+treatment.">Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment.</a> Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+dysfunction+and+altered+metabolic+profile+of+the+aging+rat+thyroarytenoid+muscle.">Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle.</a> J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).</li><li>Engle, W. K., Cunningham, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+examination+of+muscle+tissue.+An+improved+trichrome+method+for+fresh-frozen+biopsy+section.">Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section.</a> Neurology. (13), 919-923 (1963).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+practice+of+histotechnology.">Theory and practice of histotechnology.</a> Battelle. , (1980).</li><li>Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+TrkB+expression+results+in+precocious+age-like+changes+in+neuromuscular+structure,+neurotransmission,+and+muscle+function.">Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function.</a> J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).</li><li>Nishida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+change+in+rat+intrinsic+laryngeal+muscles:+analysis+of+muscle+fibers,+muscle+fiber+proteins+and+subneural+apparatuses.">Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שרירי הגרון חשופים להשפעות של הזדקנות. מחקרים קודמים הראו שינויים בשרירי הגרון המזדקנים הכוללים שינויים בגודל הסיבים, מספר הסיבים הכולל, יכולת התחדשות, גודל NMJ ושינויים בכמות, בנוסף לשינויים בתפקוד הקונסטרוקלי ובמיוסין איזופורם משמרות 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . הזדקנות שריר הגרון ניתן לשנות על ידי יישום של נוירוטרופים. שינויים אלו ניתנים למדידה. לכן, שרירי הגרון חולדה לספק מודל שימושי כדי לחקור את ההשפעות של הזדקנות, ווקאלי מחלות / הפרעות. המחקר של השרירים האלה עשוי גם לסייע בפיתוח התערבויות או תהליכי הגנה אצל האדם המזדקן. השיטה שלנו של יישום שיטתי או ישיר של NTF4 מייצרת תגובה שיפוץ הזדקנות חולדה העכבריםשרירים. זה מוכיח כי neurotrophins עשוי להיות פוטנציאל טיפולי על תפקוד לקוי של שרירים הקשורים להזדקנות. היישום הישיר של נויטרופינים יכול בקלות לתרגם את המודל האנושי של ההזדקנות ווקאלית למרות וקטורים הזרקת 25 . ישנם גורמים רבים שיש להביא בחשבון בעת ​​שימוש בפרוטוקול ההזרקה. ראשית, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע גירוד ופגיעה ברקמות הרכות סביב הפרוזדור הגרון בהתחשב קצה אנדוסקופ יש מחט חדה המצורפת. שנית, עיתוי התנועה של קצה המחט לתוך הגרון במהלך השלב מעוררת השראה של מחזור נשימה של בעלי חיים לוקח להתאמן כדי במדויק את הזריקה. שלישית, להבטיח את קצה המחט נראה בבירור לפני שתנסה את ההליך על ידי ויזואלית לבדוק את המנגנון על צג המחשב מראש. רביעית, ההתחממות קצה אנדוסקופ במים חמים במשך כמה שניות הוא צעד חשוב כדי לוודא כי ערפל של endoהיקף נמנעת. לבסוף, חשוב גם לצום את החולדה בלילה לפני כל הליך קביעת. אם המזון אינו נמנע סביר מאוד כי הם עדיין יש שאריות מזון הלוע, מה שהופך את הליך ההזרקה כמעט בלתי אפשרי לבצע. חולדות יש לבדוק את הסימנים של התייבשות היומי ושקל כדי לוודא שאין ירידה משמעותית במשקל (יותר כי 10% ממשקל הגוף). שני שלבים קריטיים בפיתוח הפרוטוקול היו התקשרות של המזרק לאנדוסקופ, ושימוש במשאב בעל פה. עיגון מוצק של מכלול המזרק היה הכרחי כדי להקל על פעולה חד פעמית להכנסת היקף והזרקת. בהתחשב במטרות המחקר, בהעדר הדמיה ישירה להנחת הזרקה של קפל הקול, הניסוי לא היה יכול להתממש. בנוסף, יצירתה של ספקולום אוראלי נחשב חשוב למנוע את הלשון מלהזיז ולשמור על הEiglottis פתוח במהלך ההליך. שיטת הזריקה מודרכת ויזואלית תחת הלך מספר סיבובים של שינוי הקשורים בעיקר למציאת האמצעים האופטימלי של עיגון מאובטח מזרק ומחט האנדוסקופ. לאחר בדיקה של צורות שונות של דבקים קלטת, נמצא כי מסחרי זמין קלטת אתלטי גמיש היה האמצעי הטוב ביותר לעגן את המזרק לגוף אנדוסקופ. המגבלה הגדולה ביותר של שיטת הזריקה המודרכת מבחינה ויזואלית לא הייתה קשורה למכשור, אלא לצורך צורך בפטנט ובדרכי הנשימה. אמנם, הגבלת מזון במשך 24 שעות לפני הליך לפתור את רוב הבעיה, חולדות יהיה לבלוע כל דבר בכלובים שלהם, כולל מצעים צואה. כאשר זה קרה, היו שני פתרונות: (1) לדחות את הזריקה עד החיה מנקה את הלוע שלהם באופן טבעי, או (2) מנסה להסיר את החסימה ידנית באמצעות מלקחיים. זה היה הניסיון שלנוE, כי לשעבר היתה אפשרות טובה יותר, כי זה הפחית את הסיכון של פגיעה פוטנציאלית באזור הלוע של החיה. בהתחשב בחידוש של פרוטוקול זה ואת הצורך להזריק ישירות את קפל ווקאלית עם המתחם, אין שיטות אמינים אחרים קיימים. בהתחשב בגודל קטן של מערכת בעלי חיים הגרון, הזריק מודרך חזותית דרך אזור הפה והלוע בדרך היחידה להבטיח מיקום נכון ועקבי של המתחם של חיה חיה. האמצעי האחיד היחיד להזרקה ישירה של קפל הקול היה לנסות לעשות זאת ממיקום חיצוני דרך העור והסחוס של הגרון. למרות שיטה זו מבוצעת בהצלחה בבני אדם העוברים טיפולי toxin botulinum כדי להקל על דיסטוניאס הגרון, שיטות הזרקה transcutaneous אינם בריאים בבעלי חיים קטנים. הטכניקה היא חזקה וניתן להשתמש בה לא רק הזרקה של קפל ווקאלי, אלא עבור אתרי הזרקה בתוךהאזורים הלועיים והאזוריים. בנוסף, השיטה יכולה להיות מותאמת עבור ניטור חזותית פשוטה של ​​החיה הלועי באזור הגרון על ידי הסרת המזרק. לסיכום, שיטת הזרקה זו היא אמצעי חדש לחקר המנגנונים הביולוגיים הקשורים לטיפול בתפקוד הקול הקשור להזדקנות בבני אדם. שיטה זו יש גם את הפוטנציאל להיות מיושם על מודלים אחרים של המחלה המשפיעים על קול, תפקוד קולי, תקשורת, בליעה בבני אדם.

שרירי הגרון מתכווצים במהירות ועקביות, והם פגיעים לתופעות הלוואי של ההזדקנות. פעילות מתמדת זו נחשבת לתורמת לבעיות קוליות או לדיספגיה שנצפתה אצל אנשים מעל גיל 65 שנים , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . מספר מנגנונים מולקולריים ו פתופיזיולוגיים תורמים לתפקוד לקוי הקשור לגיל. מנגנונים אלה יכולים לכלול שיפוץ של רירית הגרון, ניוון שריר או אובדן, חוסר סיבים שריר התחדשות או ניוון אשר גורם קשת של קפל ווקאלי חוסר יכולת של הסגר 8 , 9 , 10 , 11 . אין טיפול רפואי מוכח בשלב זה יכול comלמנוע או לשקם שינויים אלה הקשורים לגיל אלה שרירים. אפנון האפקטיביות של שידור neuromuscular יכול להשפיע מאוד על הביצועים neuromotor. משפחת הנוירוטרופים כוללת גורם לגדילה עצבית (NGF), גורם גדילה עצבי המופק על ידי המוח (BDNF), נוירוטרופין 3 (NTF3) ו- NTF4 12 , 13 . נוירוטרופים הוכחו כדי לווסת את יעילות הסינפטי 1 , 4 . גורם הצמיחה hepatocyte, הפיכת גורם גדילה ביתא גורם הגידול fibroblast לאחרונה נעשה שימוש בבני אדם לטיפול הצטלקות קפל 15 - 17 . NTF4 גם מסדיר את יעילות NMJ; עכברים חסרים NTF4 להראות מפורקים NMJs 11 , 18 , 19 . מחקרים אלה מובילים להשפעות מבטיחות של מטפליםT של הזדקנות שרירים הגרון ואת שימור עם גורמי גדילה. טיפול הזרקה ישירה לרקמות של קפל ווקאלי הם לא תקדים בבני אדם. לדוגמה, זריקות מקומיות של toxin botulinum משמשים כיום כטיפול יעיל להפרעות תנועה נוירולוגיות המשפיעות על השרירים בגרון, כגון דיספוניה של עוויתות ושיתוק עצבי חוזר דו-צדדי חוזר 20 , 21 . חומצה היאלורונית הידרוגנית נוספת היא זריקה, המשמשת לטיפול מפחיד ווקאלי קיפול וחסר glutal 22 , 23 . הזריקה laryngoplasty ניתן להשתמש כדי לטפל במגוון של הפרעות בתקשורת 24 . שיטות הזרקה ישירה אלו מקיימות הבטחה לשיפור תפקוד הקול והבלעה באוכלוסיות ההזדקנות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurotrophin 4</td>
			<td>Pepro Tech</td>
			<td>450-04</td>
			<td>200ng in 50&#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet Osmotic Pump</td>
			<td>DURECT Corporation</td>
			<td>2001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176; endoscope</td>
			<td>Stoltz</td>
			<td>61029D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm 30 gauge 100-&#956;l syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84850 and 201812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline (sodium chloride solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G 5/8 needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic ointment</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>44-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Decon</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine (Betadine)</td>
			<td>Purdue Pharma L.P.</td>
			<td>606404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>731-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 nylon suture thread</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>PMN-518R6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crile hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delicate suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>49756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Merritt Veterinary Supplies</td>
			<td>148700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibiotic ointment</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>57110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acepromizine Aceproject</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>50033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction box (anesthetizing box)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxygen compressed tank</td>
			<td>Scott Gross</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plexiglas platform</td>
			<td>Small Parts Inc (Amazon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber tipped forceps</td>
			<td>Fine science tools rubber</td>
			<td>11075-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid rubber for forceps above</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td>42518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic spectula (BD syringe cut to length)</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>halogen light source rhino-laryngeal stroboscope</td>
			<td>Kay-Pentax</td>
			<td>RLS 9100 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video recorder</td>
			<td>Kay-Pentax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat Mictotom HM525</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HM 525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill 1 hematoxylin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10143-142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon eosin-Y alcoholic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-X phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anaesthesia machine</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>CDS 9000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcutaneous neurotrophin 4 infusion using osmotic pumps or direct muscular injection enhances aging rat laryngeal muscles

תפקוד לקוי של הגרון אצל קשישים הוא גורם עיקרי לחולי נכות, מהפרעות קוליות ועד לקשיי ראייה ואובדן רפלקסים מגנים על דרכי הנשימה. מעטים, אם בכלל, קיימים טיפולים כי המטרה גיל הקשורים לתפקוד שרירים בגרון. נויטרופונים מעורבים בעצב שרירים ובידול של צמתים ניירומוסקולריים (NMJs). הוא חשב כי neurotrophins לשפר את העברת neuromuscular על ידי הגדלת שחרור נוירוטרנסמיטר. הצמתים הניירומוסקולריים (NMJ) הופכים קטנים יותר ופחות בשפע בשרירי הגרון העכברים המזדקנים, עם ראיות לשימור תפקודי. בחנו את ההשפעות של NTF4 לשימוש קליני עתידי כטיפול לשיפור תפקוד ההזדקנות בשרירי הגרון האנושיים. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול מפורט עבור יישום מערכתי הזרקת ישירה של NTF4 לחקור את היכולת של הזדקנות חולדה עכברוש הגרון לשפץ בתגובה יישום NTF4. בשיטה זו, חולדות או קיבלו NTF4 או באופן שיטתי דרך oמשאבה סמוטית או על ידי הזרקה ישירה דרך קפל ווקאלי. שרירי הלוע היו אז גזור ומשמש לבדיקת היסטולוגית של מורפולוגיה ושימור הקשורים לגיל.

חולדות היו מורדמים לאחר שבועיים של עירוי משאבת אוסמוטי או 1 שבוע לאחר הזרקה ישירה של NTF4. Larynges נקצרו, הניח cryoprotectant (סוכרוז 30% ו 70% פוספט שנאגרו מלוחים) ולאחר מכן מקוטע סדרתי ברוחב 10 מיקרומטר עם cryostat. הזדקנות שרירי הגרון מושפעים על ידי הממשל של NTF4 25 . בנוסף חולדה צעירה וישנה, ​​השווה את הצד מוזרק ולא מוזרק של השרירים thyroarytenoid. בדרך כלל אנו רואים שינוי בגודל סיבי עם הגיל, אשר משתנה בהתאם לתוואי של ניהול NTF4 ( איור 5 ). פחות fibrosis הוא גם ציין איכותית לאחר הטיפול. אחוז סיבים משומש פוחת עם יישום מערכתית ישירה של NTF4 בחולדות בגילאי ( איור 6 ). כמות NMJs גם מגדילה ( איור 7 ). המשמעות של עלייה זו דה<html> על אורך הטיפול או על דרך הניהול. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig1.jpg" /> איור 1: תמונה נציג של משאבת אוסמוטי. לאחר מילוי המשאבה ב - NTF4, מנחה הזרימה מוכנס לגוף הראשי כדי לאטום את המשאבה. <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig2.jpg" /> איור 2: פלטפורמה להליך הזרקה. החולדה ממוקמת בתנוחת פרקדן על הרציף ומוחזקת על ידי החותכות העליונות חזיתית באמצעות תיל מנחה המונח על ראש הרציף. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3: תמונה מייצגת של מזרק. ממלאים את המזרק עם NTF4 תערובת מלוחים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig4.jpg" /> איור 4: נוהל הזרקה. ( א ) המזרק הוא מצמידים ל אנדוסקופ 19.9 מ&quot;מ 30 ° (מוצג); (ב) האור האופטי נבדק כדי לוודא שיש אור עבור ההליך; ( ג ) וידאו בזמן אמת מבטיח כי המחט מודרכת למיקום הנכון. <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig5.jpg" /> איור 5: שינויים בגודל סיבים ומורפולוגיה. נציג הואMatoxylin ו eosin קטעים מוכתמים של מערכתית NTF4 7 ימים מטופלים (ימין) ולא מטופל (משמאל) שרירים thyroarytenoid בגיל 30 חודש 26 , 27 , 28 . יש גידול בגודל סיבי משליטה לבעלי חיים מטופלים. הטיפול ב- NTF4 משנה את גודל הסיב של 30 מ &#39;לזה של בעל חיים צעיר בן 6 חודשים. * P &lt;0.05 לעומת 30 חודש (תמונות נתפסו בהגדלה 40X, סולם בר = 25 מיקרומטר, P &lt;0.001). החצים בתמונה העליונה מצביעים על שטח של פיברוזיס. יש גם ירידה איכותית של פיברוזיס אצל בעלי החיים שטופלו. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55837/55837fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig6.jpg" /> איור 6: שינויים בפניםעם טיפול NTF4. נציג Nav1.5 קטעים מוכתמים של מערכתית NTF4 14 יום מטופלים (ימין) ולא מטופל (שמאל) שרירים thyroarytenoid בגיל 30 חודש (תמונות נתפסו בהגדלה 40X, קנה מידה בר = 25 מיקרומטר) 29 . יש ירידה של שימור עם הגיל על ידי Na v 1.5 תיוג (ירוק). פאנל שמאלי הוא נציג Na v 1.5 (ירוק) ו phalloidin, כדי לציין סיבים (אדום) קטעים מוכתמים של שרירים thyroarytenoid מטופל, הפאנל הימני מטופל השרירים. הוספה ירוקה היא Na v 1.5 מכתים לבד. <img alt="איור 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55837/55837fig7.jpg" /> איור 7: שינויים ב- NMJ עם טיפול ב- NTF4. נציג תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של NMJs מ NTF4 14 ימים מטופלים סעיפים שרירים thyroarytenoid מ בעלי חיים שונים שכותרתו עם α-bungarotoxin (ירוק) וPhalloidin (אדום) מראה כי מספר NMJ עולה עם טיפול NTF4 ב 30 חודש (קנה מידה בר = 25 מיקרומטר), (P &lt;0.001) 11 .

Watch this Scientific Journal Video about Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles at JoVE.com

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את השימוש של neurotrophin 4 (NTF4) באופן שיטתי ישירות כדי לשפץ עכברוש ההזדקנות שרירים הגרון.

תת עורית נוירוטרופין 4 עירוי באמצעות אוסמוטי משאבות או הזרקת שרירים ישירה משפר הזדקנות עכברים שרירי הלוע.

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

subcutaneous-neurotrophin-4-infusion-using-osmotic-pumps-or-direct

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  University of Kentucky.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את השימוש של neurotrophin 4 (NTF4) באופן שיטתי ישירות כדי לשפץ עכברוש ההזדקנות שרירים הגרון. 

Video: Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...