Biz çocuklar ve ailelerine COPSAC2010 kohort çalışmanın tüm destek ve bağlılık için minnettarlığımızı. Biz kabul ve COPSAC araştırma ekibi ve teknisyen Lisbeth Buus Rosholm, Danimarka Teknik Üniversitesi, teknik yardım sitokinler ve kemokinler ölçüm için benzersiz çaba için teşekkür ederiz.

Helsinki Deklarasyonu yol gösterici ilkeler doğrultusunda çalışmalar yapılmıştır. Etik Komitesi (KF 01-289/96 COPSAC2000 için) ve H-B-2008-093 COPSAC2010için Kopenhag ve Danimarka veri koruma ajansı için onayları elde edilmiştir ve her iki ebeveyn kayıt önce her konunun üzerinden yazılı Onam alındı.
1. deneysel Kur
<ol>
	<li>Adet filtre kağıt kullanın (fibröz hydroxylated-polyester sayfaları, bkz: Malzemeler tablo)6,7.<ol>
		<li>Kesip şeritler 3 x 15 mm 1 aylık çocuk için boyutu ve L şekil büyük çocuk ve yetişkinler (5 x 20 x 10 mm (m kısa kol)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir filtre kağıt parçası forseps kullanarak bir bebek her burun yerleştirin. Filtre kağıdı alt konka (yaklaşık 1 cm içinde Yenidoğan Bebeklerin burun ve diğer tüm yaş için 1,5 cm) ön kısmına yerleştirin.<ol>
		<li>Yenidoğan Bebeklerin bir yatağa yerleştirin ve konfor için şekerli su verin. Not: diğer tüm yaş çocuklar için örnekleme en kolay bir sandalyeye oturmuş konu ile gerçekleştirilir.</li>
		<li>Büyük çocuklar için L şeklindeki filtre kağıdı uzun kolu her burun yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir burun kıskacı rahatsızlık en aza indirmek için ve filtre kağıdı yanlışlıkla kaybedilmesini önlemek için burun delikleri çevresinde geçerli.</li>
	<li>Filtre kağıtları emme 2 dk sonra kaldırın.</li>
	<li>Filtre kağıtları etiketli tüplerde yerleştirin ve bunları hemen-80 ° C'de dondurmak</li>
	<li>Herhangi bir çocuk tarafından gösterilen örnekleme gününde hava yolu enfeksiyonu belirtileri not edin.</li>
	<li>Tüm hapşırma, sürekli ağlayan veya örnekleme sırasında 2 dk oluşur epistaksis kaydedin.</li>
</ol>
2. hava yolu bağışıklık-arabulucu miktar
<ol>
	<li>En çok 10 rasgele örnek dondurucudan almam. Kaydın kimlik numarası. Buz üzerinde örnekleri tüm çalışma işlemi sırasında tutmak.</li>
	<li>Buz çözdürme sonra filtre kağıtları (her konu) her iki burun delikleri 300 bırakın µL taze hazırlanmış, tampon (bkz: Malzemeler tablo) içeren bir tam proteaz inhibitörü tablet ( Tablo reçetesigörmek) arabelleği 25 mL başına.<ol>
		<li>Arabellek filtre kağıt boyutuna göre ses düzeyini ayarlayın.<ol>
			<li>300 µL arabellek filtre kağıtları 3 x 15 mm boyutunda için kullanın.</li>
			<li>Sadece bir filtre kağıdı varsa, yarım arabellek birim (150 µL) kullanın.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Örnekleri bir plaka shaker (400 d/d) 5 dk. kullanım için bir zamanlayıcı aktarın.</li>
	<li>Nemli filtre kağıtları ve tahlil arabellek selüloz asetat tüp filtre (0,22 µm gözenek boyutu) bir microcentrifuge içinde yer fincan içine transfer ( Tablo reçetesigörmek) tüp.</li>
	<li>16.000 x g 5 dakika içinde soğutmalı santrifüj (4 ° C'de) için filtre uygulanmış burun hulâsa tüp içinde elde etmek için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Fincan kaldırın ve buz aliquoting süre tüpler burun özü düşük proteinli bağlama depolama tabak ( Tablo reçetesigörmek) kuyu tutun.</li>
	<li>-80 ° C'de analiz kadar saklayın.</li>
	<li>Sitokinler ve yüksek-duyarlı, electrochemiluminesce tabanlı çoğaltılmış array sistemi kullanılarak nazal özleri kemokinler konsantrasyonları belirleyin (bkz. Tablo malzeme). Not: İnsan 10-plex TH1/TH2 sitokin tahlil, 9-plex Kemokin tahlil ve tek-plex IL-17A, TGF-β1 ve TSLP burada yapıldı.<ol>
		<li>Gecede 4 ° C'de burun özleri deneyleri için kuluçkaya (Bkz. Tablo reçetesi) standart üretici protokol gibi ölçümleri yapmak. Not: Uzun ( Tablo reçetesigörmek) genellikle yüksek dinamik aralık 1 arasında değişen ölçüm için var &#38; 10.000 pg/mL, ama bazı deneyleri için 100.000 pg/mL olabilir. Bu tüm örnekleri, diğer benzer uzun olduğu gibi böylece bireylerde sağlıklı ve hastalıklı birbirine benzemeyen dilutions etkisini sınırlama aynı seyreltme çalıştırılabilir anlamına gelir. Tüm sitokinler için algılama alt sınırı 1 pg/mL ya da daha az ve kemokinler için 1 arasında değişmektedir &#38; 50 pg/mL. TSLP 1 ayda örnekleri % 98'i içinde tespit değildi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. istatistik
<ol>
	<li>Günlük-analiz sitokin ve Kemokin düzeyleri normal dağılım kalıntıları elde etmek için önce verileri dönüştürme.</li>
	<li>Eğer birden fazla toplu iş iş işlemde örnekleri analiz edilir, batch-wise günlük dönüştürülmüş veriler üzerinde merkezleme için sitokin ve Kemokin verileri düzeltmek.<ol>
		<li>Genel ortalama ve özgün ölçü birimleriyle verileri elde etmek için anti-günlük dönüştürme dahil. Not: yapılan analizler her dizi için sitokinler ve kemokinler düzeyini etkileyen değişkenleri ayarlama göz önünde bulundurun. Bu anne etkileri (Örneğin, alkol tüketimi ve hamilelik sırasında sigara), emzirme, istenmeyen olaylar olabilir örnekleme, kardeşler, pets içinde ev, vb sırasında</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+Rhinitis+and+Its+Impact+on+Asthma.">Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma.</a> J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).</li><li>Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+monitoring+of+nasal+airway+inflammation+in+rhinitis.">Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).</li><li>Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytokines+in+nasal+secretions+after+nasal+antigen+challenge:+lack+of+influence+of+antihistamines.">Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines.</a> Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).</li><li>Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+safety+of+fexofenadine+HCl+and+pseudoephedrine,+alone+and+in+combination,+in+seasonal+allergic+rhinitis.">The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).</li><li>Bisgaard, H., Robinson, C., R&#248;meling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+C4+and+histamine+in+early+allergic+reaction+in+the+nose.">Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose.</a> Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).</li><li>Chawes, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+unchallenged+levels+of+mediators+in+nasal+epithelial+lining+fluid.">A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid.</a> J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+colonizing+the+airways+in+asymptomatic+neonates+stimulates+topical+inflammatory+mediator+release.">Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release.</a> Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Cytokine+Profile+in+the+Airway+Mucosal+Lining+Fluid+Is+Skewed+by+Maternal+Atopy.">Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy.</a> Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).</li><li>Chawes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vitamin+D3+Supplementation+During+Pregnancy+on+Risk+of+Persistent+Wheeze+in+the+Offspring:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).</li><li>Bischoff, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Response+to+A(H1N1)pnd09+Vaccination+in+Pregnant+Women:+A+Single+Blinded+Randomized+Controlled+Trial.">Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial.</a> PloS One. 8 (4), 56700 (2013).</li><li>Wolsk, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornavirus-Induced+Airway+Mucosa+Immune+Profile+in+Asymptomatic+Neonates.">Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates.</a> J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).</li><li>Wolsk, H. M., Chawes, B. L., F&#248;lsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siblings+Promote+a+Type+1/Type+17-oriented+immune+response+in+the+airways+of+asymptomatic+neonates.">Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates.</a> Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).</li><li>Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+technique+for+recovery+of+cytokines+from+inflammatory+sites+in+situ.">Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ.</a> J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+bronchoscopic+microsample+probe+to+measure+the+biochemical+constituents+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+KL-6,+a+lung+epithelial+cell+marker,+in+plasma+and+epithelial+lining+fluid+in+acute+respiratory+distress+syndrome.">Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+level+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).</li><li>Komaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-mediated+xanthine+oxidase+upregulation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease's+airways.">Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways.</a> Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).</li><li>Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+exhaled+breath+condensates+in+infants.">Measuring exhaled breath condensates in infants.</a> Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).</li></ol>

Tüm yazarlar hiçbir potansiyel, algılanan ya da gerçek çıkar çatışması bu yazının içeriği ile ilgili olarak ilan ediyorum. Finansmanı kuruluşları tasarım ve çalışma yürütülmesi herhangi bir rolü yoktu; toplanması, yönetim ve verilerin yorumlanması; veya hazırlık, gözden geçirme ve onay şekilde alt alta yazılmalıdır. Hiçbir ilaç firması çalışmaya dahil.

Burada sunulan tekniği ile biz çocuk için 1 ay daha önce bitmiş değil yaş gibi erken vivo içinde üst hava yolu Mukozal bağışıklık profilinde belirlemek başardık. Biz o varlığı belirli hava yolu bakteri ve picornaviruses7,11, yanı sıra diğer öncesi ve perinatal Etkilenmeler, Yenidoğan Bebeklerin hava yolu bağışıklık profilinde yansıtılmış gözlenen. Ayrıca, biz bu hava yolu bağışıklık profil verileri bir randomize mikro besin deneme yüksek doz vitamin d etki mekanizması çalışırdım Bu sonuçlar geçerlilik ve Mukozal astar sıvı tekniği programı sonraki vivo içinde miktar hava yolu bağışıklık arabulucu bir noninvaziv örnekleme tekniği olarak altını çizin.
Aşağıdaki noktaları yöntemi uygulaması önce dikkate değer vardır: sitokinler Mukozal astar sıvı matris ölçmek için electrochemiluminescence iletişim kuralları tarafından sağlanan gibi yüksek duyarlılık dayalı immunoassay yöntemleri kullanmak önemlidir. Enzim bağlı uzun kullanımı kesmesi Absorbans okuma içinde yol açabilir. Burun ve bronşlar arasında güçlü bir ilişki olmakla birlikte, Ayrıca, üst solunum yolları bağışıklık profilde ölçüm hala bir kısıtlamadır. Örnekleme Mukozal katmanın üst kısmındaki gerçekleştirildi; Böylece, beklediğimiz sıvı jel katmanın sol katman kompozisyonu esas olarak temsil eder. Bu, hangi bir kısıtlamadır onaylamak için mukoza katmanı işaretleri ölçüyoruz değil. Burun sıvı salgılanması bireysel değişimler teorik olarak algılanan düzeyde sitokinler ve kemokinler etkileyebilir. Ancak, biz burun salgısı dynamics arası bireysel değişimler bu tekniği için büyük bir engel olabilir belirten yanıt Farklı Etkilenmeler7,8,9,10,11,12, açık ve değişen immünolojik fenotipleri tanımlamak mümkün olmuştur. Teknik yerine getirirken, işlenmesi sırasında protein yıkımı önlemek için düşük sıcaklıklarda (buz-soğutmalı) tüm yordamları gerçekleştirmek önemlidir. Protein yıkımı daha fazla protein ayıklama arabellek için önerilen protein proteaz inhibitörleri ekleyerek azaltılabilir.
Yine de, bu teknik gücünü noninvaziv ve gerçekleştirmek kolay olduğunu Mukozal hava yolu bağışıklık imza neonatal dönemde ve sonrasında boyuna Değerlendirmeler etkinleştirmektir. Bu tür bilgiler potansiyel olarak nasıl yerel hava yolu bağışıklık sistemi olgunlaşır ve geliştirir boyunca çocukluk ve yetişkinlik içine bilgi sağlayabilir. Ayrıca, örnekleme tekniği kesintisiz gerçekleştirilir ve bir in vivo -ilgili, su katılmamış bir şekilde, nerede bir bilinmeyen seyreltme faktörü bulgular13geçerliliğini azaltır burun lavaj tekniği ile saptanamayan olurdu bağışıklık arabulucu algılama etkin. Biz piyasada bulunan (bakınız Tablo reçetesi) ve tasarlanmıştır, lifli, hydroxylated-polyester sentetik orta örnek toplama, depolama ve eşlenik serbest bırakmak için kullanılır. Düşük biyomoleküler bağlama ile Hidrofil malzemesidir ve protein içeren depolama-80 ° C'de sırasında kararlı olduğu Yüksek emici bir malzemedir ve lif yüzeyler su wettability geliştirmek için değiştirdiniz.
COPSAC2010 çalışmada, biz bir panel 21 sitokinler ve yerel Havayolları hareket bağışıklık sisteminin büyük phenotypical yolları temsil etmek için bir priori seçilmiştir kemokinler seçildi. Bu arabulucu, TSLP, tek bir ayda tespit değildi.
Önemli bir yönelik uygulama alt solunum yolları (bronchoscopic microsampling tekniği kullanarakÖrneğin, ) Mukozal astar sıvı toplamak olacaktır alt solunum yolu İmmünoloji değerlendirmek için. Bronchoscopic microsampling için bronchoscopic tanı, yerel bronş epitel astar sıvı toplama yeteneğine sahip yeni bir işlemdir; kılıflı polyester fiber sonda14kullanır. Distal airways ulaşıldığında, sonda bronş epitel sıvısı bronş Lümen mevcut emmek için kılıf ucu dışarı itilir. Akut respiratuar distress Sendromu14,15,16 ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı17bronchoscopic microsampling beri kullanılmaktadır. Ancak, astım, varolan sorunlardan sonda epitel kırılganlık hastalık kaynaklı ve artan vaskülarizasyon nedeniyle kanama neden olabilir olduğunu. Bronchoscopic microsampling yordamına Mukozal astar sıvı tekniği uygulayarak anlayışımız ile ilgili olarak önemli klinik sonuçları patofizyolojisi yanı sıra izleme, tedavi ve birkaç akut ve kronik akciğer hastalıkları çocuk ve yetişkinler, sonucunu tahmin olabilir.
Arabulucu her türlü teorik olarak burada kullanılan ticari sisteminin multiplex immunoassay platform kullanılarak ölçülebilir ( Tablo reçetesigörmek). Platformu kendisi için herhangi bir arabulucunun monoklonal antikorlar bir immunoassay gelişimi için uygun bir çift elde edilebilir yüksek-duyarlı ve doğru miktar için sağlar. Bu platform da beraberinde getirmektedir yüksek hassasiyetli ve analiz edilecek sıvı pH, sıcaklık ve viskozite değişimler için daha az duyarlılık.
Gelecekte çalışmaları, bağışıklık arabulucu geçerli panel ölçümü, örneğin genişletmek için büyük bir değer olacaktır: antimikrobiyal peptidler; Toplam ve belirli IgA; C - reaktif protein gibi Akut Faz Reaktanları; lipid arabulucu, Prostaglandinler gibi; ve beyin kaynaklı Nörotrofik faktör (BDNF) gibi nörolojik arabulucu. Bu geniş hava pozlama ile vücut sitesinde Mukozal yanıt Sistemi'nin doğa daha ayrıntılı bir görünümünü sağlayabilir. Önerilen arabulucu da hedeflenen nicel yüksek-duyarlı uzun aracılığıyla, gibi geçerli Kur veya hedefli veya hedeflenmemiş Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi - veya sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (LC-MS) ölçülen-metabolomics teknikleri dayalı. İkinci yaklaşımı zaten bir ölçüde biofluid18 örnekleme ile ilgili olarak, Mukozal astar sıvı tekniği için belirgin değildir bazı yöntembilimsel dezavantajları vardır dışarı solunan nefes yoğuşma yöntemi ile uygulamaya konmuştur.
Boyuna örnekleme yenidoğan döneminden yetişkinlik, COPSAC2010 kohort gerçekleştirilen büyük ölçüde önceki veya kullanılazlar alerji ve astım gibi solunum yolu hastalıkları ile oyunculuk temel immünolojik faktörler anlayışımızı yükselecektir. Bu bulgular roman therapeutics belirli hastalık endotypes hedefleme gelişmesine ve mikro besin incelenmesi için önemli olabilir ve uyuşturucu mekanizmaları eylem randomize klinik çalışmalar.

Burun Mukozal astar sıvı üst hava yolu sistem sıvı kısmını yukarı yapar. Epitel ve mikroorganizmaların istila karşı savunma ilk satırı oluşturan bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi türetilen arabulucu karmaşık matris oluşur. Nazal mukoza kolayca erişilebilir ve burun ve bronşlar1arasında güçlü bir işlevsel ve immünolojik ilişkisi. Bu bölümü çocukluk, astım ve alerjik rinit gibi aynı zamanda diğer solunum bozukluğu daha sonra hayatında daha yaygın bir dizi ortak olan solunum yolu hastalıkları ile ilgili olarak özel ilgi var.
Burada, örnek Mukozal burun boşluğuna sıvı astar bir filtre kağıt tabanlı, noninvaziv teknik yanı sıra bir sonraki çıkarma yordamı kullanarak, protein bazlı analitler filtre kağıtları önce onların miktar üzerinden elute için kullanılan bozulmamış bir yöntemin uygulanması açıklanmaktadır. Bu teknik, vivo sağlıklı bireyler ve bireylerin çeşitli solunum yolu hastalıkları ile bağışıklık imzaları elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, belirli bir bağışıklık imza için önemli Etkilenmeler incelemenize ve predictor veya aracı daha sonra hastalığı gelişme ise değerlendirmek mümkündür.
Mukozal astar sıvı daha önce nazal lavaj2kez bir burun meydan okuma testi ile nerede bir alerjen bir enflamatuar yanıt3,4uyarmak için yüksek seviyelerinde tanıtıldı önce gelmelidir tarafından elde edilmiştir. Ancak, nazal lavaj teknik genç çocuklarda mümkün değildir ve sonuçlar düzeyleri tahlil5algılama sınırın altına düşebilir seyreltilmiş aracı olarak zihnimi karıştıran bir bilinmeyen seyreltme faktörü tanıttı. Ayrıca, bilinmeyen seyreltme faktörü nedeniyle burun meydan okuma testleri ölçülen analit yanıtlarını bireyler, böylece burun lavaj tekniği ayarlama bir kohort kullanışlılığı sınırlayarak arasında karşılaştırılabilir değildir. Son olarak, alerjen meydan yalnızca duyarlilasmis bireylerde geçerlidir ve histamin sorun gibi başka sorunlar fizyolojik ilgili, potansiyel olarak arabulucu yayın tavan etkisi neden değildir. Bu sorunların sıvı ve analit düzeyleri bireysel salgı arası tek tek farkı etkileyen faktörler nerede Mukozal astar sıvı koleksiyonu için sunulan filtre kağıt tabanlı teknik hile.
Ayıklama işlemi sırasında analitler için tüm örnekleri özdeş birimi arabelleği eklenmesinden sonra filtre gazetelerden eluted. Bu tüm örnekleri benzer ex vivo seyreltme tercih eder. İzotonik tuz solüsyonu albümin tabanlı bir ayıklama arabellek ayıklama adım için kullanılır; Bu protein bazlı arabulucu çıkarma sağlar ve protein miktar önce eluted proteinlerin sonraki donma sırasında denatürasyon sınırlamak için stabilize. Ekstraksiyon aşamasında protein yıkımı önlemek için proteaz inhibitörleri bir kokteyl ayıklama arabelleğe eklenir.
Rahatsız edilmeden vivo içindemiktar için izin teknikleri uygulanması-Mukozal sitelerinde oluşturulan bağışıklık arabulucu olduğunu çok önemli. İlk olarak, vücudun en büyük immünolojik organ Mukozal sitesi oluşturur. İkincisi, burun konum birincil site hava maruz kalma ve1akciğerler solunum immünolojik yuvası için sıkı bir şekilde bağlı. Üçüncü olarak, bu önemli organ invaziv olmayan bir teknik ile ölçme imkanı olasılığı sağlık ve hastalığında solunum yolları ile ilgili olarak önemli mikrop-bağışıklık etkileşim ekseninde bir bolluk bilgi sağlamak için açılır. Dördüncü, bu tekniğin randomize, kontrollü çalışmalarda yerel immünolojik değişiklikler uyuşturucu ve mikro eğitim gibi diğer birçok olası uygulama vardır.
Biz başlangıçta teknik astım tarihinde Kopenhag prospektif çalışmalarda çocukluk2000 (COPSAC2000) kohort Mukozal astar sıvı sağlıklı kontrol13karşı alerjik rinit ile 7 yaşındaki çocuklarda bağışıklık profil belirlendiği yerde, hayata. Daha sonra biz başarılı bir şekilde bu teknik boyuna COPSAC2010 kohort ve biçilen hava yolu bağışıklık profilleri için 1 ay, 2 yıl ve 6 yaşın ve akut solunum yolu semptomları örneklerini uygulanır. Sonuçlar 1 aylık Yenidoğan Bebeklerin bağışıklık imza ve gençliği çevre pozlama7,8,9,10,11,12arasındaki önemli ilişkileri gösterdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1688">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fibrous hydroxylatedpolyester sheets</td>
			<td style="width:103px;">Accuwik Ultra&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SPR0730</td>
			<td style="width:1084px;">Filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milliplex Assay Buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-AB</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-protein binding storage plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CLS8161</td>
			<td>Plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:103px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Reader of multi-spot plates</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Sector imager 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Assays&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-&#946;1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive sampling of mucosal lining fluid for the quantification of in vivo upper airway immune-mediator levels

Bu iletişim kuralı rahatsız edilmeden üst solunum yolu Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme açıklar. Ayrıca sıvı eluates bağışıklık arabulucu analizini önce (genellikle diğer teknikleri tarafından kullanılan) stimülasyon yordamlar için gerek kalmadan havayolu topikal bağışıklık imza çalışma için kullanılan ayıklama yordam ayrıntıları. Mukozal astar sıvı bir şerit filtre kağıdı üzerindeki örneklenir alt konka ve emme 2 min için sol ön kısmına yerleştirilmiş. Analitlerin filtre gazetelerden eluted ve ayıklanan protein bazlı eluates düşük ve yüksek seviye analitler aynı örnek içinde yüksek-duyarlı miktar için izin veren bir electrochemiluminescence tabanlı immunoassay tarafından incelenir. Biz 20 önceden seçilmiş bağışıklık arabulucu yolları üst solunum yolu mukozasında sinyal belirli bağışıklık ile ilgili vivo içinde düzeyleri ölçüldü, ama tekniği o belirli paneli veya örnekleme sitesine sınırlı değildir. Bu teknik ilk 7 yaşındaki çocuklarda astım üzerine Kopenhag prospektif çalışmalar çocukluk2000 (COPSAC2000) kohort alerjik rinit ile uygulanmıştır. Bundan sonra 1 ay, 2 yıl ve 6 yaşın ve akut solunum yolu semptomları örneklerini örneklenmiş boyuna COPSAC2010 doğum kohort, kullanıldı. Biz başarıyla elde edilen ve 620 (% 89) 700 1 aylık çocukların örnekleri analiz; (Medyan (arası DÖRTTEBİRLİK aralığı (IQR)) bildirdi. tahlil algılama sınırın altındaki birkaç edildi Her aracı için (Yani 0 algılama alt sınırı için set noktasına) algılama sınırın altındaki örnekleri sayısı 29 (7.25-119.5) oldu. Bu teknik doğum içinde vivo hava yolu Mukozal bağışıklık profilden miktar sağlar, boyuna uygulanabilir ve çalışmalar genetik ve gençliği çevre pozlama, patofizyolojisi, endotyping ve solunum yolu hastalıkları ve geliştirme ve roman therapeutics değerlendirilmesi izleme etkisi üzerinde uygulanabilir.

Baseline Characteristics of the Airway Immune Profiles: 
Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 samples were lost in transportation (See the study flowchart, Figure 1). Baseline characteristics for the cohort are shown in Table 1.
Most of the mediators had a low level of detection &#60;10 pg/mL (IL-1&#946;, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, TGF-&#946;1, IFN-&#947;, TNF-&#945;, CXCL8, CCL13, CCL4, and CCL17), whereas 5 had a detection level &#62;10 pg/mL (CXCL10, CCL2, CCL11, CCL26, and CCL22) (Table 2). The median (IQR) number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5) (Table 2). IFN-&#947; levels were below the lower detection limit in almost half (46%) of the samples, whereas CXCL8 and IL-1&#946; levels were detectable in all samples, and TGF-&#946;1, CCL4, and TNF-&#945; levels were below the lower detection limit in &#60;1% of the samples. One of the mediators, TSLP, was only detected in 2% of samples, and TSLP data was therefore not used for consecutive data analyses. A strong multicollinearity was evident for the 20 detected immune mediator levels, which is visualized in a heatmap (Figure 2).
The Influence of Airway Bacteria and Viruses in Neonates: 
We previously found an association between the airway immune profile and colonization in specific airway bacteria sampled concomitantly with mucosal lining fluid at 1 month of age. An upregulated Type 1- and Type 17-based airway immune profile was observed in neonates colonized with intracellular bacteria, whereas the presence of extracellular bacteria was associated with a Type 17-based profile7. We have also shown previously that the presence of picornavirus was associated with an upregulated profile comprised mainly of Type 1 immune mediators (Figure 3)11. These findings were obtained in children without respiratory symptoms, (i.e.&#160;asymptomatic) on the day of sampling, suggesting an immune-triggering role of colonizing bacteria and viruses in the earliest part of life.
The Influence of Pre- and Perinatal Exposure: 
We have further observed an association between the level of immune mediators at 1 month of age and a maternal history of atopy8, where children born to atopic mothers displayed an overall lower level of immune mediators than children of non-atopic mothers. We subsequently identified an association between the presence of siblings in the household at birth and a specific Type 1/Type 17-directed mucosal immune response, with evidence of this being related to an in utero immune priming effect, as the immune response was inversely correlated to the time since last childbirth (Figure 4)12. Further evidence for in utero immune priming effects was determined from an association between maternal H1N1 influenza vaccination status and the upregulation of TGF-&#946;1 levels in the neonatal airway10.
Evidence for Micronutrient Mechanisms of Action: 
In COPSAC2010, we performed a high-dose versus standard-dose vitamin D intervention trial during pregnancy, which showed an almost one-fourth reduction in the risk of asthma/recurrent wheeze in the offspring at 3 years of age9. Utilizing the measured neonatal airway immune profile, we observed that children born to mothers receiving high-dose vitamin D, compared to standard-dose, were characterized by an upregulation of specific mediators (IL-12p70, IL-13, CCL17, TGF-&#946;1, and IL-2), suggesting that vitamin D promotes an anti-bacterial defense system different from that induced by bacteria, virus, siblings, and maternal atopy9 (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig1.jpg" /> 
Figure 1: Study Group Flowchart. Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 samples were lost in transportation. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig2.jpg" /> 
Figure 2: Heatmap of Pairwise Correlations between the 20 Cytokines and Chemokines. The red color represents a positive correlation and the blue color represents a negative correlation. The number inside every square denotes the correlation between two mediators. The figure shows that all mediators are positively correlated. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig3.jpg" /> 
Figure 3: The Presence of Picornavirus is Associated with an Upregulated Profile Comprised Mainly of Type 1 Immune-mediators. This figures shows the Geometric Mean Ratios (GMR), with 95% Confidence Intervals (CI), of airway mediators in neonates with/without the concomitant presence of picornavirus, measured at 1 month of age. This figure has been modified from Wolsk et al.11, with permission. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig4.jpg" /> 
Figure 4: Effects of the Presence of Siblings in the Household at Birth. A) Airway immune signature (PC1) in neonates with and without siblings at birth. B) Scatterplot showing an inverse association between the airway immune signature (PC1) and time since previous birth for children with siblings. This figure has been modified from Wolsk et al.12, with permission. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig5.jpg" /> 
Figure 5: Principal Component Analysis Biplot of the Effect of Vitamin D Intervention in the COPSAC2010 Cohort on the Airway Immune Mediator Level at 1 Month of Age. Each point represents a sample, colored according to the intervention allocation of the child. The loadings (i.e.&#160;impact) of the original variables on the principal components are shown as arrows. The intervention resulted in a significantly upregulated immune profile in PC1, which is positively correlated with all immune mediators. This figure has been modified from Chawes et al.9, with permission. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>N = 620 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maternal atopy</td>
			<td>334 (54)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Caucasian</td>
			<td>29 (5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesarean section</td>
			<td>134 (22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics in 3rd trimester&#160;</td>
			<td>126 (20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siblings in the home at birth</td>
			<td>358 (58)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pets (cat and/or dog) in the home</td>
			<td>216 (35)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully-breastfed at 1 month</td>
			<td>570 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No smoking in 3rd trimester</td>
			<td>597 (96)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No alcohol consumption in 3rd trimester</td>
			<td>591 (95)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Family income &#62;100.000 euro/year</td>
			<td>89 (14)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gestational age &#62;37 weeks</td>
			<td>601 (97)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apgar score &#62;7 at 5 min</td>
			<td>591 (95)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Baseline Characteristics of the COPSAC2010 Cohort.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mediator</td>
			<td>Detection limit pg/ml</td>
			<td>&#60; Detection limit N (%)</td>
			<td>Median pg/ml</td>
			<td>IQR&#160;pg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12p70</td>
			<td>1.4</td>
			<td>102 (16%)</td>
			<td>10.80</td>
			<td>4.99 - 22.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL10</td>
			<td>31</td>
			<td>8 (1%)</td>
			<td>1787.78</td>
			<td>722.8 - 5423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>4.1</td>
			<td>285 (46%)</td>
			<td>20.14</td>
			<td>7.63 - 48.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>0.6</td>
			<td>5 (&#60;1%)</td>
			<td>28.33</td>
			<td>10.06 - 88.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL4</td>
			<td>4.3</td>
			<td>4 (&#60;1%)</td>
			<td>194.90</td>
			<td>71.22 - 655.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL2</td>
			<td>16.0</td>
			<td>9 (1%)</td>
			<td>256.11</td>
			<td>134.4 - 468.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL13</td>
			<td>2.8</td>
			<td>13 (2%)</td>
			<td>15.17</td>
			<td>10.35 - 22.80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>1.1</td>
			<td>196 (32%)</td>
			<td>1.37</td>
			<td>0.42 - 2.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>1.2</td>
			<td>172 (28%)</td>
			<td>3.72</td>
			<td>1.42 - 8.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>2.7</td>
			<td>48 (8%)</td>
			<td>14.49</td>
			<td>6.84 - 27.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL11</td>
			<td>22.0</td>
			<td>39 (6%)</td>
			<td>139.54</td>
			<td>85.00 &#8211; 236.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL26</td>
			<td>45.0</td>
			<td>252 (41%)</td>
			<td>164.93</td>
			<td>56.33 - 350.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL17</td>
			<td>7.2</td>
			<td>90 (15%)</td>
			<td>41.30</td>
			<td>26.83 - 60.68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL22</td>
			<td>25.0</td>
			<td>78 (13%)</td>
			<td>398.31</td>
			<td>243.4 - 575.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>225.49</td>
			<td>50.07 - 1169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>1.5</td>
			<td>285 (46%)</td>
			<td>1,480</td>
			<td>0.43 - 4.79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL8</td>
			<td>3</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>19465</td>
			<td>6321 - 38274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>5.2</td>
			<td>1 (&#60;1%)</td>
			<td>28.66</td>
			<td>20.76 - 39.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>1</td>
			<td>13 (2%)</td>
			<td>22.32</td>
			<td>9.28 - 49.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>1.5</td>
			<td>19 (3%)</td>
			<td>18.72</td>
			<td>8.29 - 37.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2: Mucosal Lining Fluid Samples from 1-month-old Neonates from the COPSAC2010 Cohort. Most of the mediators had a low level of detection &#60;10 pg/mL (IL-1&#946;, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, TGF-&#946;1, IFN-&#947;, TNF-&#945;, CXCL8, CCL13, CCL4, and CCL17), whereas 5 had a detection level &#62;10 pg/mL (CXCL10, CCL2, CCL11, CCL26, and CCL22).

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels at JoVE.com

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Bu iletişim kuralı için üst solunum yolları rahatsız edilmeden Mukozal astar sıvı örnekleme invaziv olmayan bir teknik anlatılmaktadır. Vivo düzeyleri sitokinler ve kemokinler, gibi protein arabulucu miktar her yaştan bireylerde gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

noninvasive-sampling-mucosal-lining-fluid-for-quantification-vivo

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

10.2K Görüntüleme.  University of Copenhagen. Bu iletişim kuralı için üst solunum yolları rahatsız edilmeden Mukozal astar sıvı örnekleme invaziv olmayan bir teknik anlatılmaktadır. Vivo düzeyleri sitokinler ve kemokinler, gibi protein arabulucu miktar her yaştan bireylerde gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Video: Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

intra-trakeal İdaresi<em&gt; Haemophilus influenza</em&gt; Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.