Wir bedanken uns für die Kinder und Familien von der COPSAC2010 -Kohortenstudie für all ihre Unterstützung und ihr Engagement. Wir anerkennen und schätzen die einzigartige Bemühungen der COPSAC-Research-Team und die technische Hilfe aus Techniker Lisbeth Buus Rosholm, Technical University of Denmark für die Messung der Zytokine und Chemokine.

Die Studien wurden im Einklang mit den Leitprinzipien der Deklaration von Helsinki. Genehmigungen von der Ethik-Kommission für Kopenhagen (KF 01-289/96 für COPSAC2000 ) und H-B-2008-093 COPSAC2010und der dänischen Datenschutzbehörde stammen, und schriftliche Einwilligung wurde von beiden Elternteilen jedes Fach vor der Einschreibung.
1. Versuchsaufbau
<ol>
	<li>Verwenden Sie Filter Papierbögen (faserige hydroxylierten Polyester Bettwäsche, siehe die Tabelle der Materialien)6,7.<ol>
		<li>Schneiden Sie Streifen 3 x 15 mm in der Größe für ein 1 Monat altes Kind und in einer L-Form für ältere Kinder und Erwachsene (5 x 20 x 10 mm (kurzen Arm des L)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Legen Sie ein Stück Filtrierpapier in jedes Nasenloch eines Säuglings mit Pinzette. Platzieren Sie das Filterpapier auf den vorderen Teil der unteren Nasenmuschel (ca. 1 cm in das Nasenloch für Neugeborene und 1,5 cm für alle anderen Altersgruppen).<ol>
		<li>Legen Sie Neugeborenen auf ein Bett und Ihnen Sie Zuckerwasser für Komfort. Hinweis: Für Kinder anderer Altersgruppen, wird die Probenahme am leichtesten mit dem Thema auf einem Stuhl sitzend durchgeführt.</li>
		<li>Einsetzen Sie für ältere Kinder den langen Arm des L-förmigen Filterpapiers in jedes Nasenloch.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wenden Sie eine Nasenklammer um die Nasenlöcher, die Beschwerden zu minimieren und den versehentlichen Verlust des Filterpapiers zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 2 min der Absorption der Filterpapiere.</li>
	<li>Legen Sie die Filterpapiere in beschrifteten Rohre und friere sie sofort bei-80 ° C.</li>
	<li>Notieren Sie sich irgendwelche Anzeichen einer Infektion der Atemwege des Kindes am Tag der Probenahme gezeigt.</li>
	<li>Zeichnen Sie alle Niesen, anhaltende schreien oder Nasenbluten, die auftritt, während die 2 min der Probenahme.</li>
</ol>
2. Quantifizierung der Atemwege immun-Mediatoren
<ol>
	<li>Nehmen Sie bis zu 10 Stichproben aus der Tiefkühltruhe. Notieren Sie die ID-Nummern. Halten Sie die Proben auf Eis während des gesamten Arbeitsprozesses.</li>
	<li>Nach dem Auftauen auf Eis tauchen die Filterpapiere (pro Fach) aus beiden Nasenlöchern in 300 µL der frisch zubereiteten Puffern (siehe die Tabelle der Materialien) enthält eine komplette Protease Inhibitor Tablette (siehe die Tabelle der Materialien) pro 25 mL des Puffers.<ol>
		<li>Stellen Sie die Lautstärke des Puffers entsprechend der Größe des Filterpapiers.<ol>
			<li>Verwenden Sie 300 µL Puffer für Filtertüten 3 x 15 mm groß.</li>
			<li>Wenn nur ein Filterpapier verfügbar ist, verwenden Sie die Hälfte das Puffervolumen (150 µL).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Übertragen Sie den Proben auf eine Platte Shaker (400 u/min) für 5 min. Einsatz einen Timer.</li>
	<li>Übertragen der feucht Filterpapiere und Testpuffer in der Tasse eine Cellulose-Acetat-Kerzenfilter (0,22 µm Porengröße) platziert in einem Microcentrifuge Schlauch (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 5 min in einer gekühlten Zentrifuge (bei 4 ° C), um gefilterte nasale Extrakt in das Rohr zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Tasse und halten Sie die Rohre auf dem Eis während Aliquotierung des nasalen Extraktes in die Vertiefungen der niedrig-Proteinbindung Speicherfolien (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Bis zur Analyse bei-80 ° C lagern.</li>
	<li>Die Konzentrationen der Zytokine und Chemokine in den nasalen Auszügen mit Hilfe eines hochempfindlichen, Electrochemiluminesce-basierte gemultiplexten Array Systems zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Eine menschliche 10-Plex TH1/TH2 Zytokin-Assay, 9-Plex-Chemokin-Assay, und Einzel-Plex IL-17A, TGF-β1 und TSLP wurden hier durchgeführt.<ol>
		<li>Inkubieren Sie für die Assays die nasale Extrakte über Nacht bei 4 ° c Führen Sie die Messungen wie pro die standard Hersteller Protokoll (siehe die Tabelle der Materialien). Hinweis: Die Immunoassays haben (siehe die Tabelle der Materialien) in der Regel einen hohen Dynamikbereich für Messung zwischen 1 &#38; 10.000 Pg/mL, aber für einige Tests kann es 100.000 Pg/mL. Dies bedeutet, dass alle Proben bei der gleichen Verdünnung, wodurch des Einfluss der unterschiedlichen Verdünnungen in gesunden und kranken Personen, wie der Fall in anderen ähnlichen Immunoassays ist ausgeführt werden können. Die untere Grenze der Erkennung für alle Zytokine wurde 1 Pg/mL oder weniger, und für Chemokine, es lag zwischen 1 &#38; 50 Pg/mL. TSLP war nicht nachweisbar in 98 % der Proben 1 Monat alt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(3) Statistiken
<ol>
	<li>Log-Transformation der Daten vor der Analyse, normalverteilte Residuen der Cytokine und Chemokin Ebene zu erhalten.</li>
	<li>Wenn die Proben in mehr als einer Charge analysiert werden, korrigieren Sie die Cytokine und Chemokin Daten für chargenweise Zentrierung auf die Log-transformierten Daten.<ol>
		<li>Der Gesamtmittelwert und Anti-logarithmische Transformation zum Abrufen von Daten in der ursprünglichen Maßeinheiten zu integrieren. Hinweis: Für jeden Satz von Analysen durchgeführt, betrachten Sie Anpassung der Variablen, die das Niveau der Zytokine und Chemokine beeinflussen. Dies könnte mütterlichen Einflüssen (z. B. Alkoholkonsum und Rauchen während der Schwangerschaft), stillen, unerwünschte Ereignisse während der Probenahme, Geschwister, Haustiere im Haus, etc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+Rhinitis+and+Its+Impact+on+Asthma.">Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma.</a> J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).</li><li>Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+monitoring+of+nasal+airway+inflammation+in+rhinitis.">Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).</li><li>Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytokines+in+nasal+secretions+after+nasal+antigen+challenge:+lack+of+influence+of+antihistamines.">Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines.</a> Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).</li><li>Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+safety+of+fexofenadine+HCl+and+pseudoephedrine,+alone+and+in+combination,+in+seasonal+allergic+rhinitis.">The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).</li><li>Bisgaard, H., Robinson, C., R&#248;meling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+C4+and+histamine+in+early+allergic+reaction+in+the+nose.">Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose.</a> Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).</li><li>Chawes, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+unchallenged+levels+of+mediators+in+nasal+epithelial+lining+fluid.">A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid.</a> J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+colonizing+the+airways+in+asymptomatic+neonates+stimulates+topical+inflammatory+mediator+release.">Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release.</a> Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Cytokine+Profile+in+the+Airway+Mucosal+Lining+Fluid+Is+Skewed+by+Maternal+Atopy.">Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy.</a> Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).</li><li>Chawes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vitamin+D3+Supplementation+During+Pregnancy+on+Risk+of+Persistent+Wheeze+in+the+Offspring:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).</li><li>Bischoff, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Response+to+A(H1N1)pnd09+Vaccination+in+Pregnant+Women:+A+Single+Blinded+Randomized+Controlled+Trial.">Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial.</a> PloS One. 8 (4), 56700 (2013).</li><li>Wolsk, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornavirus-Induced+Airway+Mucosa+Immune+Profile+in+Asymptomatic+Neonates.">Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates.</a> J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).</li><li>Wolsk, H. M., Chawes, B. L., F&#248;lsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siblings+Promote+a+Type+1/Type+17-oriented+immune+response+in+the+airways+of+asymptomatic+neonates.">Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates.</a> Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).</li><li>Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+technique+for+recovery+of+cytokines+from+inflammatory+sites+in+situ.">Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ.</a> J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+bronchoscopic+microsample+probe+to+measure+the+biochemical+constituents+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+KL-6,+a+lung+epithelial+cell+marker,+in+plasma+and+epithelial+lining+fluid+in+acute+respiratory+distress+syndrome.">Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+level+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).</li><li>Komaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-mediated+xanthine+oxidase+upregulation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease's+airways.">Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways.</a> Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).</li><li>Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+exhaled+breath+condensates+in+infants.">Measuring exhaled breath condensates in infants.</a> Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).</li></ol>

Alle Autoren erklären potenziellen, vermeintlichen oder tatsächlichen Interessenkonflikt bezüglich des Inhalts dieser Handschrift. Förderinstitutionen haben keine Rolle in der Konzeption und Durchführung der Studie; die Erhebung, Verwaltung und Interpretation der Daten; oder die Erstellung, Überprüfung und Genehmigung des Manuskripts. Kein Pharmaunternehmen wurde an der Studie beteiligt.

Mit der hier vorgestellten Technik konnten wir das in Vivo obere Atemwege Schleimhaut immun Profil bei Kindern bereits ab 1 Monat alt, zu bestimmen, die nicht zuvor getan wurde. Wir haben beobachtet, dass das Vorhandensein von spezifischen Atemwege Bakterien und Picornaviren7,11, sowie andere Pre und perinatale Expositionen im Atemweg immun Profil von den Neugeborenen gespiegelt wurden. Darüber hinaus haben wir diese Atemwege immun Profildaten studieren den Wirkmechanismus einer randomisierten Mikronährstoff-Studie von hoch dosierten Vitamin d. Diese Ergebnisse unterstreichen die Gültigkeit und den Nutzen der Darmschleimhaut Fluid Technik als eine nicht-invasive Probenahme-Technik für die anschließende in Vivo Quantifizierung der Atemwege immun Mediatoren.
Folgende Punkte sind vor der Methodenimplementierung eine Überlegung: um Zytokine in der Darmschleimhaut flüssigen Matrix zu messen, ist es wichtig, hohe Empfindlichkeit-basierende Immunoassay Methoden, wie die Electrochemiluminescence Protokolle zu verwenden. Die Verwendung von Enzym-linked Immunoassays führen zu Inferenz in der Extinktion auslesen. Darüber hinaus gibt es zwar eine starke Beziehung zwischen der Nase und Bronchien, ist die Messung des immun-Profils in den oberen Atemwegen noch eine Einschränkung. Probenahme erfolgte auf dem oberen Teil von der Darmschleimhaut; Daher erwarten wir, dass die Flüssigkeit vor allem die Zusammensetzung der Gelschicht, nicht die Sol-Schicht darstellt. Wir haben nicht messen Schleimschicht Markierungen, um dies zu bestätigen, das ist eine Einschränkung. Individuelle Variationen in nasale Sekretion Fluid können theoretisch die erkannten Ebenen der Zytokine und Chemokine beeinflussen. Jedoch konnten wir identifizieren klare und unterschiedlichen immunologische Phänotypen in Reaktion auf unterschiedlichen Belichtungen7,8,9,10,11,12, darauf hinweist, dass die interindividuelle Unterschiede in der Dynamik der nasale Sekretion möglicherweise kein großes Hindernis für diese Technik. Während der Durchführung der Technik, ist es wichtig, alle Eingriffe bei niedrigen Temperaturen (Eis gekühlt) Proteinabbau während der Verarbeitung zu vermeiden. Proteinabbau kann weiter reduziert werden, indem die empfohlenen Protein Proteaseinhibitoren zu dem Protein Extraktionspuffer.
Die Stärke dieser Technik ist allerdings, dass ist einfach durchzuführen, und nicht-invasive, longitudinale Bewertungen der Schleimhaut der Atemwege immun Signatur aus der Neugeborenenperiode und ab damit. Solche Informationen könnten potenziell wissen auf wie die lokalen Atemwege Immunsystem reift und entwickelt sich während der gesamten Kindheit und bis ins Erwachsenenalter. Darüber hinaus die Entnahmetechnik erfolgt ungestört und in einer in Vivo -unverdünnt, relevante Art und Weise, die die Erkennung von immun Mediatoren, die hätte nicht nachweisbar mit der nasale Lavage-Technik, wo ein unbekannter Faktor reduziert die Gültigkeit der Ergebnisse13ermöglichte. Wir haben eine synthetische, faserige, hydroxylierten Polyester Medium, das ist im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien) und dient für Sample-Sammlung, Speicherung und konjugierte Freisetzung. Das Material ist hydrophil, mit niedrigen biomolekularen Bindung und Protein-haltigen Proben sind stabil während der Lagerung bei-80 ° C. Das Material ist sehr saugfähig und die Faseroberflächen wurden geändert, um Wasser Benetzbarkeit verbessern.
In der COPSAC-Studie2010 wählten wir eine Gruppe von 21 Zytokine und Chemokine, die a priori darzustellende große phänotypische Wege des Immunsystems handeln lokal in den Atemwegen ausgewählt wurden. Einen Monat alt war nicht nur eines dieser Mediatoren, TSLP, nachweisbar.
Eine wichtige zukünftige Anwendung wäre, Schleimhaut Flüssigkeit aus den unteren Atemwegen (z. B. durch die Verwendung der bronchoskopischen Microsampling Technik) zu sammeln, zu beurteilen, untere Atemwege Immunologie. Bronchoskopische Microsampling ist ein neues Verfahren zur bronchoskopischen Diagnostik, sammeln von lokalen bronchiale epithelialen Auskleidung Flüssigkeit; Es nutzt einen ummantelten Polyester-Faser-Sonde-14. Wenn die distalen Atemwege erreicht sind, wird die Sonde aus der Scheide Spitze geschoben, absorbieren die bronchiale epitheliale Flüssigkeit in das bronchiale Lumen vorhanden. Bronchoskopische Microsampling wurde in akute Atemnotsyndrom14,15,16 und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung17verwendet. Allerdings bei Asthma ist ein bestehendes Problem, dass die Sonde wegen Krankheit-induzierte epithelialen Zerbrechlichkeit und erhöhte Vaskularisierung Blutungen verursachen kann. Anwendung der Darmschleimhaut Fluid Technik der bronchoskopischen Microsampling Verfahren hätten wichtige klinische Implikationen in Bezug auf unser Verständnis der Pathophysiologie sowie zur Überwachung und Behandlung von Vorhersage der Ergebnisse von mehreren akuten und chronischen Lungenerkrankungen bei Kindern und Erwachsenen.
Alle Arten von Mediatoren können theoretisch mit dem Multiplex-Immunoassay-Plattform des hier verwendeten kommerziellen Systems gemessen werden (siehe die Tabelle der Materialien). Die Plattform ermöglicht die hohe Empfindlichkeit und genaue Quantifizierung der, die Vermittler für die ein paar von monoklonalen Antikörpern für die Entwicklung von einem Immunoassay erreicht werden kann. Diese Plattform auch mit sich bringt hohe Präzision und weniger empfindlich auf pH-Wert, Temperatur und Viskosität Variationen in den Fluiden analysiert werden.
In Zukunft Studien, wäre es von großem Wert für die aktuelle Panel immun Mediatoren zur Messung, z. B. zu erweitern: antimikrobielle Peptide; Gesamt- und spezifische IgA; akute-Phase-Reaktionspartner, wie C - reaktives Protein; Lipid-Mediatoren, wie Prostaglandine; und neurologische Mediatoren, wie Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF). Dies könnte eine detailliertere Ansicht der Natur des Systems der Schleimhaut Antwort auf einer Körperstelle mit umfangreichen Luft bieten. Die vorgeschlagenen Mediatoren können entweder gemessen werden durch gezielte quantitative hochempfindlichen Immunoassays, wie z. B. in das aktuelle Setup oder durch gezielte oder ungezielte Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie- oder flüssigen Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Metabolomik Techniken basiert. Letzteres wurde bereits in gewissem Maße mit der Ausatmungsluft Kondensat-Methode implementiert hat einige methodische Nachteile in Bezug auf die Probenahme der Biofluid18 , die nicht offensichtlich für die Schleimhaut-Fluid-Technik.
Longitudinal Probenentnahme aus der Neugeborenenperiode bis ins Erwachsenenalter, wird wie in der COPSAC-2010 -Kohorte, deutlich erhöhen unser Verständnis der zugrunde liegenden immunologische Faktoren vor oder begleitend mit Erkrankungen der Atemwege wie Asthma und Allergien zu handeln. Solche Erkenntnisse möglicherweise wichtig, die Entwicklung neuer Therapeutika, die gezielt bestimmte Krankheit Endotypes und der Untersuchung von Mikronährstoffen und Droge Wirkmechanismen in randomisierten klinische Studien.

Die Flüssigkeit der Schleimhaut der Nase macht sich der flüssige Teil des Systems der oberen Atemwege. Es besteht aus einer komplexen Matrix von Mediatoren aus dem Wechselspiel zwischen dem Epithel und der immunen Zellen, aus denen sich die erste Linie der Verteidigung gegen eindringende Mikroorganismen abgeleitet. Die Nasenschleimhaut ist leicht zugänglich, und es gibt eine starke funktionale und immunologische Beziehung zwischen der Nase und Bronchien1. Dieses Fach ist von besonderem Interesse in Bezug auf Krankheiten der Atemwege, die häufig in der Kindheit, wie Asthma und allergische Rhinitis, sondern auch zu einer Reihe von anderen Erkrankungen der Atemwege häufiger später im Leben.
Hier beschreiben wir die Durchführung eines Verfahrens zur Probe ungestört Schleimhaut Futter Flüssigkeit aus der Nasenhöhle ein Filterpapier-basierte, nicht-invasive Technik, sowie eine anschließende Extraktionsverfahren, verwendet, um Protein-basierten Analyten aus der Filterpapiere vor deren Quantifizierung eluieren. Diese Technik kann, z. B. zur in Vivo immun Unterschriften von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Erkrankungen der Atemwege zu erhalten. Darüber hinaus ist es möglich, Aufnahmen von Bedeutung für eine bestimmte immun Signatur zu prüfen und zu bewerten, ob es ein Prädiktor oder Vermittler der späteren Entwicklung der Krankheit ist.
Schleimhaut Flüssigkeit wurde zuvor durch nasale Lavage2, erteilt, die oft durch eine nasale Challenge-Test wo ein Allergen in hohe vorausgegangen ist Förderung eine entzündliche Reaktion3,4eingeführt. Jedoch die nasale Lavage-Technik ist nicht möglich bei Kleinkindern und stellt eine unbekannte Verdünnungsfaktor, die die Ergebnisse als der verdünnte Mediator verwirrt, die Ebenen unterhalb der Nachweisgrenze der Assay5fallen können. Aufgrund der unbekannten Verdünnungsfaktor sind die gemessenen Analyten Antworten aus der nasale Provokationstests nicht vergleichbar zwischen den Individuen, wodurch die Nützlichkeit der nasale Lavage Technik in einer Kohorte Einstellung begrenzt. Schließlich Allergen Herausforderung ist nur anwendbar bei sensibilisierten Personen und andere Herausforderungen, wie die Histamin-Herausforderung sind nicht physiologisch relevanten, verursachen eine Decke Wirkung auf Mittler-Version. Diese Probleme werden in der vorgestellten Filterpapier-basierte Technik für Schleimhaut Flüssigkeitsansammlung, wo die einzelnen Sekretion von Flüssigkeiten und Analyten Ebenen sind die einzigen Faktoren, die Einfluss auf interindividuelle Varianz, umgangen.
Während der Extraktionsverfahren sind Analyten aus der Filterpapiere nach Zugabe von identischen Volumen des Puffers auf alle Proben eluiert. Dies begünstigt ähnliche ex Vivo Verdünnung aller Proben. Ein Extraktionspuffer Albumin-basierte isotonische Salzlösung dient dem Extraktionsschritt; Es ermöglicht die Gewinnung von Protein-basierten Mediatoren und stabilisiert Proteine um Denaturierung während der nachfolgenden Einfrieren der eluierten Proteine vor der Quantifizierung zu begrenzen. Zur Vermeidung von Proteinabbau während der Extraktion-Phase wird ein Cocktail von Protease-Inhibitoren die Extraktionspuffer hinzugefügt.
Die Umsetzung der Techniken, mit denen für die Quantifizierung von ungestört, in-Vivo-generierten immun Mediatoren an Schleimhaut Standorten ist von größter Bedeutung. Erstens macht die Schleimhaut Website das größte immunologische Organ im Körper. Zweitens ist die nasale Lage am Hauptstandort in der Luft ausgesetzt und in die Atemwege immunologische Abteil der Lunge1eng verbunden ist. Drittens, eröffnet die Möglichkeit der Vermessung dieses wichtigen Organs mit einer nicht-invasive Technik die Möglichkeit bieten eine Fülle von Informationen auf der Achse wichtig Mikrobe-immun-Interaktion in Bezug auf Gesundheit und Krankheit in den Atemwegen. Viertens gibt es viele weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik, wie z. B. lokale immunologische Veränderungen in randomisierten, kontrollierten Studien von Medikamenten und Mikronährstoffen zu studieren.
Wir umgesetzt zunächst die Technik in der Kopenhagener Prospektivstudien zu Asthma Kindheit2000 (COPSAC2000) Kohorte, wo wir das immun Profil der Schleimhaut Flüssigkeit bei 7 Jahre alten Kindern mit allergischer Rhinitis im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen13bestimmt. Anschließend bewarb sich wir erfolgreich diese Technik längs-COPSAC2010 Kohorte und bewerteten Atemwege immun Profile 1 Monat, 2 Jahre und 6 Jahre alt und in Fällen von akuten respiratorischen Symptomen. Ergebnisse von 1-Monat-alten Neugeborenen haben gezeigt, dass wichtige Zusammenhänge zwischen immun Signatur und frühes Leben Umweltexposition7,8,9,10,11,12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1688">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fibrous hydroxylatedpolyester sheets</td>
			<td style="width:103px;">Accuwik Ultra&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SPR0730</td>
			<td style="width:1084px;">Filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milliplex Assay Buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-AB</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-protein binding storage plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CLS8161</td>
			<td>Plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:103px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Reader of multi-spot plates</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Sector imager 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Assays&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-&#946;1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive sampling of mucosal lining fluid for the quantification of in vivo upper airway immune-mediator levels

Dieses Protokoll beschreibt nicht-invasive Probenahme ungestört oberen Atemwegen Schleimhaut Flüssigkeit. Es beschreibt auch die Extraktionsverfahren vor der Analyse von immun Mediatoren in Fluid Eluate für die Untersuchung der Atemwege topische immun Signatur, ohne die Notwendigkeit einer Stimulation-Verfahren (oft durch andere Techniken verwendet). Die Schleimhaut-Flüssigkeit wird auf einem Streifen Filterpapier aufgenommen am vorderen Teil der unteren Nasenmuschel und Links für 2 min der Absorption. Analyten aus der Filterpapiere eluiert werden, und die extrahierten Protein-basierten Eluate werden durch eine Electrochemiluminescence-basierte Immunoassay, zulassend die hochempfindlichen Quantifizierung von Low und high - level Analyten in der gleichen Probe analysiert. Wir maßen die in Vivo -Level 20 vorausgewählten immun Mediatoren, die im Zusammenhang mit spezifischen immunen Signalwege in der Schleimhaut der oberen Atemwege, aber die Technik ist nicht beschränkt auf, dass bestimmte Panel oder Sampling-Website. Die Technik wurde zuerst in 7-Year-Old Kinder aus dem Kopenhagen Prospektivstudien über Asthma im Kindesalter2000 (COPSAC2000) Kohorte mit allergischer Rhinitis umgesetzt. Er diente danach in der Längsrichtung COPSAC2010 Geburt Kohorte, abgetastet, 1 Monat, 2 Jahre und 6 Jahre alt und in Fällen von akuten respiratorischen Symptomen. Erhielten wir erfolgreich und analysierten Proben von 620 (89 %) von 700 1-Monat-alten Kindern, ein paar Proben waren unterhalb der Assay-Nachweisgrenze (als der Median (Inter Quartil Range (IQR)) berichtet. Die Anzahl der Proben unter der Nachweisgrenze (d.h. von 0 auf den Sollwert für die untere Grenze der Erkennung) für jeden Vermittler war 29 (7,25-119,5). Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung der in Vivo Atemwege Schleimhaut immun Profil von Geburt, längs aufgebracht werden und auf Studien über die Wirkung von Genetik und frühes Leben Umwelteinflüsse, Pathophysiologie, Endotyping und Überwachung von Erkrankungen der Atemwege, Entwicklung und Evaluierung neuer Therapeutika angewendet werden kann.

Baseline Characteristics of the Airway Immune Profiles: 
Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 samples were lost in transportation (See the study flowchart, Figure 1). Baseline characteristics for the cohort are shown in Table 1.
Most of the mediators had a low level of detection &#60;10 pg/mL (IL-1&#946;, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, TGF-&#946;1, IFN-&#947;, TNF-&#945;, CXCL8, CCL13, CCL4, and CCL17), whereas 5 had a detection level &#62;10 pg/mL (CXCL10, CCL2, CCL11, CCL26, and CCL22) (Table 2). The median (IQR) number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5) (Table 2). IFN-&#947; levels were below the lower detection limit in almost half (46%) of the samples, whereas CXCL8 and IL-1&#946; levels were detectable in all samples, and TGF-&#946;1, CCL4, and TNF-&#945; levels were below the lower detection limit in &#60;1% of the samples. One of the mediators, TSLP, was only detected in 2% of samples, and TSLP data was therefore not used for consecutive data analyses. A strong multicollinearity was evident for the 20 detected immune mediator levels, which is visualized in a heatmap (Figure 2).
The Influence of Airway Bacteria and Viruses in Neonates: 
We previously found an association between the airway immune profile and colonization in specific airway bacteria sampled concomitantly with mucosal lining fluid at 1 month of age. An upregulated Type 1- and Type 17-based airway immune profile was observed in neonates colonized with intracellular bacteria, whereas the presence of extracellular bacteria was associated with a Type 17-based profile7. We have also shown previously that the presence of picornavirus was associated with an upregulated profile comprised mainly of Type 1 immune mediators (Figure 3)11. These findings were obtained in children without respiratory symptoms, (i.e.&#160;asymptomatic) on the day of sampling, suggesting an immune-triggering role of colonizing bacteria and viruses in the earliest part of life.
The Influence of Pre- and Perinatal Exposure: 
We have further observed an association between the level of immune mediators at 1 month of age and a maternal history of atopy8, where children born to atopic mothers displayed an overall lower level of immune mediators than children of non-atopic mothers. We subsequently identified an association between the presence of siblings in the household at birth and a specific Type 1/Type 17-directed mucosal immune response, with evidence of this being related to an in utero immune priming effect, as the immune response was inversely correlated to the time since last childbirth (Figure 4)12. Further evidence for in utero immune priming effects was determined from an association between maternal H1N1 influenza vaccination status and the upregulation of TGF-&#946;1 levels in the neonatal airway10.
Evidence for Micronutrient Mechanisms of Action: 
In COPSAC2010, we performed a high-dose versus standard-dose vitamin D intervention trial during pregnancy, which showed an almost one-fourth reduction in the risk of asthma/recurrent wheeze in the offspring at 3 years of age9. Utilizing the measured neonatal airway immune profile, we observed that children born to mothers receiving high-dose vitamin D, compared to standard-dose, were characterized by an upregulation of specific mediators (IL-12p70, IL-13, CCL17, TGF-&#946;1, and IL-2), suggesting that vitamin D promotes an anti-bacterial defense system different from that induced by bacteria, virus, siblings, and maternal atopy9 (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig1.jpg" /> 
Figure 1: Study Group Flowchart. Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 samples were lost in transportation. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig2.jpg" /> 
Figure 2: Heatmap of Pairwise Correlations between the 20 Cytokines and Chemokines. The red color represents a positive correlation and the blue color represents a negative correlation. The number inside every square denotes the correlation between two mediators. The figure shows that all mediators are positively correlated. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig3.jpg" /> 
Figure 3: The Presence of Picornavirus is Associated with an Upregulated Profile Comprised Mainly of Type 1 Immune-mediators. This figures shows the Geometric Mean Ratios (GMR), with 95% Confidence Intervals (CI), of airway mediators in neonates with/without the concomitant presence of picornavirus, measured at 1 month of age. This figure has been modified from Wolsk et al.11, with permission. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig4.jpg" /> 
Figure 4: Effects of the Presence of Siblings in the Household at Birth. A) Airway immune signature (PC1) in neonates with and without siblings at birth. B) Scatterplot showing an inverse association between the airway immune signature (PC1) and time since previous birth for children with siblings. This figure has been modified from Wolsk et al.12, with permission. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig5.jpg" /> 
Figure 5: Principal Component Analysis Biplot of the Effect of Vitamin D Intervention in the COPSAC2010 Cohort on the Airway Immune Mediator Level at 1 Month of Age. Each point represents a sample, colored according to the intervention allocation of the child. The loadings (i.e.&#160;impact) of the original variables on the principal components are shown as arrows. The intervention resulted in a significantly upregulated immune profile in PC1, which is positively correlated with all immune mediators. This figure has been modified from Chawes et al.9, with permission. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55800/55800fig5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>N = 620 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maternal atopy</td>
			<td>334 (54)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Caucasian</td>
			<td>29 (5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesarean section</td>
			<td>134 (22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics in 3rd trimester&#160;</td>
			<td>126 (20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siblings in the home at birth</td>
			<td>358 (58)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pets (cat and/or dog) in the home</td>
			<td>216 (35)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully-breastfed at 1 month</td>
			<td>570 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No smoking in 3rd trimester</td>
			<td>597 (96)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No alcohol consumption in 3rd trimester</td>
			<td>591 (95)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Family income &#62;100.000 euro/year</td>
			<td>89 (14)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gestational age &#62;37 weeks</td>
			<td>601 (97)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apgar score &#62;7 at 5 min</td>
			<td>591 (95)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Baseline Characteristics of the COPSAC2010 Cohort.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mediator</td>
			<td>Detection limit pg/ml</td>
			<td>&#60; Detection limit N (%)</td>
			<td>Median pg/ml</td>
			<td>IQR&#160;pg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12p70</td>
			<td>1.4</td>
			<td>102 (16%)</td>
			<td>10.80</td>
			<td>4.99 - 22.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL10</td>
			<td>31</td>
			<td>8 (1%)</td>
			<td>1787.78</td>
			<td>722.8 - 5423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>4.1</td>
			<td>285 (46%)</td>
			<td>20.14</td>
			<td>7.63 - 48.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>0.6</td>
			<td>5 (&#60;1%)</td>
			<td>28.33</td>
			<td>10.06 - 88.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL4</td>
			<td>4.3</td>
			<td>4 (&#60;1%)</td>
			<td>194.90</td>
			<td>71.22 - 655.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL2</td>
			<td>16.0</td>
			<td>9 (1%)</td>
			<td>256.11</td>
			<td>134.4 - 468.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL13</td>
			<td>2.8</td>
			<td>13 (2%)</td>
			<td>15.17</td>
			<td>10.35 - 22.80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>1.1</td>
			<td>196 (32%)</td>
			<td>1.37</td>
			<td>0.42 - 2.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>1.2</td>
			<td>172 (28%)</td>
			<td>3.72</td>
			<td>1.42 - 8.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>2.7</td>
			<td>48 (8%)</td>
			<td>14.49</td>
			<td>6.84 - 27.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL11</td>
			<td>22.0</td>
			<td>39 (6%)</td>
			<td>139.54</td>
			<td>85.00 &#8211; 236.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL26</td>
			<td>45.0</td>
			<td>252 (41%)</td>
			<td>164.93</td>
			<td>56.33 - 350.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL17</td>
			<td>7.2</td>
			<td>90 (15%)</td>
			<td>41.30</td>
			<td>26.83 - 60.68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL22</td>
			<td>25.0</td>
			<td>78 (13%)</td>
			<td>398.31</td>
			<td>243.4 - 575.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>225.49</td>
			<td>50.07 - 1169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>1.5</td>
			<td>285 (46%)</td>
			<td>1,480</td>
			<td>0.43 - 4.79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL8</td>
			<td>3</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>19465</td>
			<td>6321 - 38274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>5.2</td>
			<td>1 (&#60;1%)</td>
			<td>28.66</td>
			<td>20.76 - 39.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>1</td>
			<td>13 (2%)</td>
			<td>22.32</td>
			<td>9.28 - 49.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>1.5</td>
			<td>19 (3%)</td>
			<td>18.72</td>
			<td>8.29 - 37.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2: Mucosal Lining Fluid Samples from 1-month-old Neonates from the COPSAC2010 Cohort. Most of the mediators had a low level of detection &#60;10 pg/mL (IL-1&#946;, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, TGF-&#946;1, IFN-&#947;, TNF-&#945;, CXCL8, CCL13, CCL4, and CCL17), whereas 5 had a detection level &#62;10 pg/mL (CXCL10, CCL2, CCL11, CCL26, and CCL22).

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Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

noninvasive-sampling-mucosal-lining-fluid-for-quantification-vivo

Nanyang Technological University

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JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

10.2K Aufrufe.  University of Copenhagen. Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.

Serie: Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Intratracheale Verabreichung von<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.