Bu eser kanser için bir V bilim adamı Ödülü (V2014-004) ve V bilim adamı artı Ödülü (D2016-030) kanser araştırmaları için V Vakfı ve bir Amerikan Kanser Derneği kurumsal araştırma bursu (ACS IRG Grant 58-006-53) Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından desteklenmiştir Araştırma. E. G. s. Borch lisansüstü Bağış Ödülü Purdue Üniversitesi tıbbi kimya ve moleküler Farmakoloji bölümü tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlıklar <ol><li>Hipotonik eriyik arabellek A: 0,3 M hazırlamak 100 mL sukroz, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA ve % 0,5 NP-40. 4 ºC mağaza. 
	Not: HEK293T gibi bazı hücre hatları daha az sıkı lysing koşullar gereklidir. Çekirdeği kolayca parçalayıcı, değiştirilme tarihi arabellek A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 mM EDTA, % 0,1 NP-40 ve %10 gliserol kullanın.</li>
	<li>2 x mRIPA çözüm 250 mL stok çözeltisi hazırlamak: 100 mM Tris pH 8.0, % 2 NP-40 ve %0,5 sodyum deoxycholate.</li>
	<li>100 mL stok 5 M NaCl çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>2 x mRIPA ve 5 M NaCl çözümleri, kullanarak hazırlamak 50 mL 1 x mRIPA çözeltisi her altı tuz konsantrasyonu için: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM ve 500 mM NaCl. Denemeyi başlatmadan önce serin buz üzerinde tüm çözümler</li>
	<li>Grow hücre satırları istenen koşullar altında. 
	Not: bir protein vurma etkilerini belirlerken, SSE devirme satırı için wildtype hücrelere kıyasla gerekir. Bu SSE yan yana gerçekleştirilmelidir. Kimyasal inhibitörleri ya da bir çekim gücü kullanan örnekler için 3-5 bölümlerine bakın.</li>
</ol> 2. Temel sıralı tuz çıkarımı her <ol><li>hasat 8 milyon hücre durumu ve yıkama buz soğuk PBS ile iki kez 5 mL. 
	Not: Eşit eşdeğer protein konsantrasyonları için hücre sayısı için önemlidir. Sayısına sahip hücreleri tek hücre satırları veya belirli proteinler için optimize edilmiş olması gerekir. Yok ki çok fazla protein konsantrasyonları artış gözlem denge bağlama üzerinde bağlıdır elüsyon eğrinin engeller gibi. Ancak, çok az hücrelerle olabilir eğri algılamak için yeterli protein ve Kromatin Pelet için zordur yalıtmak ve kesirler arasında kaybolabilir.</li>
	<li>Hücreleri arabelleği A 1 mL + proteaz inhibitörleri yeniden askıya alma, 1,5 mL mikro santrifüj tüpleri ve 10 dakika süreyle 4 ° C'nin altındaki döndürme üstünden içine transfer</li>
	<li>Tarafından Santrifüjü 6000 x g 4 ºC, 5 min için de çekirdeklerin yalıtmak. 
	Not: bu adımdan sonra nükleer zarf hala bozulmamış olması gerekir. Nükleer zarf sağlamsa, pelet tamamen yeniden askıya alacak; Ancak, zaman zarfı lysed ve Kromatin yayımlanır, pelet yeniden askıya alacak değil. Nükleer zarf arabellek A kuluçka sonra sağlam değilse, modifiye tampon A. kullanmak</li>
	Her hücre çekirdeği pelet pelet yeniden askıya almadan önce için <li>eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + proteaz inhibitörleri. Her örnek 1 mL pipet ile 15 kez pipetting tarafından lunaparkçı. Pelet kolayca yeniden askıya, ancak, çekirdekleri gibi bu pipetted ve örnek olacak kalın ve yapışkan ve pipet zor koşullar.
	<ol>Kadar Pelet ucunu çekmek, pipet ucu santrifüj tüpü dibine karşı sonuna dokunun için <li>. Pelet tam olarak bir kez DNA çekirdeklerin serbest, ama pipetting kıracak o yukarıya eriyecektir değil</li>
	</ol></li> <li>Ne zaman tüm örnekleri homojenize, kuluçkaya buz 3 dakika süreyle tüm örnekleri 
	Not: Kuluçka zaman faiz protein bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş gerekebilir.</li>
	<li>Örnekleri için 4 ºC de 6500 x g, 3 dk centrifuging tarafından ayrı tut moduyla Kromatin Pelet.</li>
	<li>Transfer süpernatant temiz 1.5 mL santrifüj için tüp. Bu 0 mM kesir olacak. Bu 0 mM mRIPA çözüm çekirdeklerin lizis bir yıkama adım olarak hareket edebilir ve herhangi bir gevşek proteinleri Kromatin ile ilişkili olmayan kaldırmak.</li>
	<li>Eklemek 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + proteaz inhibitörleri her Kromatin pelet pelet yeniden askıya almadan önce için. Kromatin pelet pelet yukarı ve aşağı 15 kez pipetting tarafından kırmak. 
	Not: Bu kaç kez Pelet içinde pipetted ile tutarlı olacak şekilde önemlidir.</li>
	<li>Incubate 3 dakika buzda. Bu kuluçka adım ne zaman birden çok örnekleri var özellikle önemli olan bir denge durumu ulaşmak tüm örneklerini sağlar.</li>
	<li>3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.</li>
	<li>Tekrar 2.6-2,10 için kalan tuz konsantrasyonları. 
	Not: 400 mM NaCl sonra mRIPA Pelet aptallar ve açık olmalı ve tüp alt kısmında kalmak olmaz. Pelet santrifüj tüpü izole süpernatant süre kapağı yerleştirilebilir.</li>
	<li>4 protein yükleme x 70 eklemek µL boya her bölümü için ve her kesir bir SDS Akrilamid jel western blot analizi için üzerine 30 µL yük. 
	Not: bağlama profil protein belirlemek için bu lysate yerine, yükleme eşit protein konsantrasyonları eşdeğer miktarda yüklemek için önemlidir.</li>
	<li>Standart bir western blot bir membran transfer ederek gerçekleştirmek ve faiz proteinler için birincil antikorlar kullanın.</li>
	Kromatin eluted protein quantitate <li>kuluçkaya kızılötesi floresan IRDye ikincil antikorlar blot ve görüntü leke bir Görüntüleyici ile. Diğer yöntemleri geliştirme kullanılabilir ise, doğada daha nicel olarak floresan veya kızılötesi görüntüleme öneririz.</li>
	<li>Kullanım ImageJ veya benzer yazılım yoğunluğu her tuz konsantrasyonu eluted protein için hesaplamak için. Grup yoğunluğu tuz konsantrasyonu karşı grafiklerini çizerek, elüsyon desen senin protein ilgi belirlenebilir.</li>
</ol> 3. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir &#34; okuyucu &#34; inhibitörü <ol><li>iki hücre (4 milyon) hasat ve çekirdeklerin olduğu gibi standart bir SSE yalıtmak.</li>
	<li>Her iki mRIPA 0 mM NaCl 200 µL içinde yeniden askıya alma ve kuluçkaya 3 dakikadır. Bu çekirdeklerin ücretsiz herhangi bir protein kaldırılması için sağlayacaktır.</li>
	<li>Eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl her Pelet için. İnhibitörü (1 mm (+) JQ1 2 µL) bir örnek ve DMSO denetim kümesine ekleme.</li>
	<li>Propaganda pelet tarafından 15 kez pipetting ve 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya</li>
	<li>3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.</li>
	<li>3.3-4 için tuz konsantrasyonları tekrarlayın ve standart Batı leke gerçekleştirmek.</li>
</ol> 4. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir &#34; yazar &#34; inhibitörü <ol><li>tedavi inhibitörü (10 µM SAHA) içeren hücreleri veya DMSO 3 h. için</li>
	<li>Her tedavi için 4 milyon hücre hasat.</li>
	<li>İçin tüm arabellekleri eklendi inhibitörü ile örnekleri için standart bir SSE gerçekleştirmek.</li>
</ol> 5. Sıralı tuz ayıklama aşağıdaki DNA hasar <ol><li>1 µM doksorubisin 1 h. için hücrelerle tedavi</li>
	<li>Hücreleri medyada değiştirmek ve onları için 3 h. kurtarmak izin</li>
	<li>8 milyon hücre hasat ve temel SSE gerçekleştirmek.</li>
</ol> 6. Sigara sıralı tuz çıkarma <ol><li>12 milyon hücre hasat ve yıkama PBS ile.</li>
	<li>Bölmek hücreleri böylece mikro santrifüj tüpü başına 2 milyon hücre.</li>
	<li>Arabellek A 500 µL içinde yeniden askıya alma ve 10 dk. için kuluçkaya</li>
	<li>Çekirdeklerin Santrifüjü 6000 x g. adlı tarafından izole</li>
	<li>Yeniden askıya 200 bir µL her mRIPA arabellekleri + NaCl unsurlardandır.</li>
	<li>1 mL pipet ucu ile 15 kez pipetting tarafından her örnek lunaparkçı.</li>
	<li>Incubate on Ice 3 dakika süreyle</li>
	<li>Tarafından Santrifüjü 6500 x g, Kromatin yalıtmak ve tüpler temizlemek için süpernatant aktarın. Boya yükleme 70 µL ekleyin ve western blot analizi için SDS-sayfa jel 30 µL çalıştırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma.">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+complexes--many+combinations,+many+functions.">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+BET+bromodomains.">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family.">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li><li>Sanchez, R., Zhou, M. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Protein ve Kromatin etkileşimleri aracılığıyla tuz çekimi karakterizasyonu istihdam edilmiş bir ortak için onlarca yıl14,15yöntemidir; Ancak, bu sistematik olarak daha önce nedeniyle ortaya çıkarmak için optimize edilmiştir değil. Biz göstermek ne kadar hızlı ve ucuz bir şekilde protein veya çevre değiştirildiğinde Kromatin bağlama değişiklikleri ayırt etmek için sıralı bu yöntemi sağlar. Son derece uyumlu ve en iyi hale getirileb...

DNA düzenlemesi ökaryotik hücrelerde hücre içi ve hücre dışı uyaranlara yanıt koordine proteinler bir ürün yelpazesine tarafından sıkı bir şekilde kontrol karmaşık ve sofistike bir sistemdir. DNA Histon octamers gevşek DNA dağıtılmış veya sıkı bobinleri1sıkıştırılmış form oluşturarlar için etrafında sarılır. Bu Yapısal düzenleme DNA ve Histon okumanıza, yazmanıza ve sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTM) Histon2silmek proteinlerin bir ağ tarafından düzenlenen Kromatin olarak bilinir. Asetilasyon gibi bazı Histon PTMs, amino asit onlar, Histon ve DNA2arasındaki etkileşim değiştiren yatırılan ücret değiştirin. Histon PTMs aynı zamanda transkripsiyon regülatör, Kromatin remodelers, DNA hasar onarım makineleri ve DNA çoğaltma makineleri genom3özel bölgeler için recruit hizmet.
Kromatin etkileşimleri çalışmak için pek çok yöntem küçük ölçekli etkileşimleri soruşturma veya büyük genom çapında analizleri dahil. Vitro bağlama çalışmalar genellikle bireysel rekombinant etki alanlarında Histon peptidler veya DNA deneyleri Elektroforez hareketlilik shift deneyleri (EMSAN), izotermal titrasyon Kalorimetre, Floresans polarizasyon ve peptid pulldowns gibi kullanmak. Bu deneyleri genellikle bir bireysel protein etki alanında odaklanmak çünkü onlar bulmaca küçük bir parça anlayış kolaylaştırmak, ama çok protein rollerini bırak, birden çok etki alanı proteinler kooperatif doğasını anlamak için bize izin verme kompleksleri. Başka tabaka-in karışıklık en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri heterojen bileşimi tarafından eklenir. Bu protein heterojenite Kromatin peyzaj dinamik yapısı ile birlikte bu etkileşimleri Kromatin proteinleri Kromatin içinde vitroiçin bağlama vivo özetlemek için zor yapar.
Vivo yöntemler önemli gelişmeler yaptık; Ancak, pahalı, zaman alıcı ve teknik olarak zor çoğu zaman. Önemli optimizasyon4gerektirir ancak Kromatin immunoprecipitation (ChIP-seq) sıralama tarafından takip çok arasında soykırım, proteinler ve Histon değişiklikleri yerelleştirilmesini belirlemek için kullanışlıdır. Proteinler çoğu kez çapraz Kromatin etkileşimleri korumak için; Ancak, bu yapay etkileşimler oluşturabilir ve5maskeleme epitope neden olabilir. Ayrıca, immunoprecipitations (IP) çok özel antikorlar ve DNA kesme ve ChIP-qPCR genellikle kullanılabilir bir temanındeğildir bilinen bağlama sitesini kullanarak IP koşulları geniş optimizasyonu gerektirir. Optimizasyon çip koşullardan sonra işleme örnekleri maliyetlidir ve ay sıra ve analiz için birkaç hafta gerektirir. Bu yöntem çok değerli olmasına rağmen Kromatin lokalizasyonu tanımlamak için proteinler bağlı genom maliyet ve süre taahhüdü engelleyici küçük değişiklikler küresel bağlama özellikleri etkilemesi hakkında hipotezler oluşturmak için bu yöntemi kullanmak için yapmak .
Bu yazıda, sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil küresel bağlama profilleri Kromatin bağlı proteinlerin incelemek ve bir protein, karmaşık veya genel PTM profil değişiklikleri etkileşimleri nasıl değiştirebilir ayırt etmek için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Tuz çekimi geniş ve yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasına rağmen nasıl sıralı bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve çok yönlü olduğunu göstermektedir. SSE için toplu Kromatin kompleksi'nın genel ilgi nasıl bir kompleks veya hatta tek bir etki alanında tek bir alt birim katkıda karakterize için bize izin verir. SSE bağlama bir protein Kromatin ortamındaki değişikliklerden ChIP-seq ve diğer genom geniş çalışmaları kullanarak doğruladı Histon işareti hedefleme için ilginç hipotezler sağlayan etkilenir eğer belirlemek için de kullanılabilir.
Aslında bu yöntem--dan Wu Polybromo1 işlevinin incelemek için vd., uyarlanmış (PBRM1) bağlama PBAF Kromatin remodeler6,7. Bu tekniği kullanarak, biz PBRM1 rolü için karmaşık remodeling PBAF Kromatin içinde Kromatin bağlamasını belirlenir ve bu işlev7altı bireysel bromodomains göreli katkısını belirledi.
Burada nasıl bir protein Kromatin çıkarılması bir kimyasal inhibitörü incelemek için benzer Kromatin kompleksleri, değiştirme göreli bağlama benzeşme değerlendirmek için farklı hücre tipleri bağlamasında Kromatin keşfetmek için bu yöntem en iyi duruma getirmek için açıklamak ve Kromatin bağlama Kromatin manzara için değişiklik sonra etkilerini belirlemek için.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Aydınlatma proteinleri Kromatin hedefleme bağlama özellikleri Kromatin karmaşık doğası ve en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri türdeş olmayan doğası nedeniyle çok zor olabilir. Bu engelleri aşmak için Kromatin-bağlı kompleksleri göreli bağlama benzeşim değerlendirmek için bir sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil adapte olması. Bu kolay ve basit tahlil sigara-uzmanlar tarafından benzeşme iki ilgili kompleksleri, benzeşim bir kompleks bir alt birim kaybolur veya bir etki alanı denetleyicisindeki inaktive değişimler ve değişikliği bağlama göreli farkı değerlendirmek için kullanılabilir bağlama benzeşme Kromatin manzara için değişiklik sonra. Sırayla tuz miktarda artan toplu Kromatin yeniden askıya tarafından biz Kromatin belirli bir protein elüsyon profil edebiliyoruz. Bu profilleri kullanarak, biz değişiklikler Kromatin değiştirme karmaşık veya değişiklikler Kromatin ortamına bağlama etkileşimleri etkilemesi tespit edebiliyoruz. SSE diğer içinde in vitro ve in vivo deneyleri ile kaplin, biz bireysel etki alanları ve proteinleri Kromatin ortamlarda çeşitli bir kompleks işlevselliğinin rolleri belirleyebilirsiniz.

Bu yazıda, avantajları ve uygulamaları edebiyat6adapte olması sık kullanılan sıralı tuz ayıklama (SSE) yöntemi göstermektedir. Şekil 1' de, biz proteinler ardışık olarak sigara ARID1a ve PBRM1 elüsyon şekillerinin algılayarak ayıklama SSE tekrarlanabilirlik karşılaştırın. Biz sürekli olarak ARID1a, BAF alt birimi, öncelikle 200 mM NaCl ve PBRM1, bir özel PBAF alt birim elutes, öncelikle 300 mM NaCl elutes g?...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

sequential-salt-extractions-for-analysis-bulk-chromatin-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K Görüntüleme.  Purdue University. Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Video: Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genetik

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly defined states of chromatin organization. The dynamic architecture of the nucleus is controlled by multiple mechanisms and shapes the transcriptional output programs. It is, therefore, important to determine locus-specific chromatin accessibility in a reliable fashion that is preferably independent from antibodies, which can be a potentially confounding source of experimental variability. Chromatin accessibility can be measured by various methods, including the Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) assay, that allow the determination of general chromatin accessibility in a relatively low number of cells. Here we describe a FAIRE protocol that allows simple, reliable, and fast identification of genomic regions with a low protein occupancy. In this method, the DNA is covalently bound to the chromatin proteins using formaldehyde as a crosslinking agent and sheared to small pieces. The free DNA is afterwards enriched using phenol:chloroform extraction. The ratio of free DNA is determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or DNA sequencing (DNA-seq) compared to a control sample representing total DNA. The regions with a looser chromatin structure are enriched in the free DNA sample, thus allowing the identification of genomic regions with lower chromatin compaction.

The plasticity of nuclear architecture is controlled by dynamic epigenetic mechanisms including non-coding RNAs, DNA methylation, nucleosome repositioning as well as histone composition and modification. Here we describe a Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) protocol which allows the determination of chromatin accessibility in a reproducible, inexpensive, and straightforward manner.

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...