Bu eser İsrail Bilim Vakfı (grant 748/14) tarafından desteklenmektedir, Marie Curie Tümleştirme vermek (çiğ) - FP7-insanlar-20013-çiğ-618763 ve ben-çekirdek Program planlama ve bütçeleme Komitesi ve İsrail Bilim Vakfı No 41/11 verin.

tüm yordamları Bar Ilan Üniversitesi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından kabul edildi ve protokol deneyler onaylama Komitesi tarafından sağlanan kuralları izler.
 1. arıtma saf insan CD4 + hücre ve polarizasyon T yardımcı 1 (Th1) ve Th2 hücrelerinin Not: burada biz donmuş insan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) başlayan açıklayınız. İlk adım lastikteki kullanarak CD4 + hücreleri izole oluşur ve sütunları genellikle bize hücreleri CD4 + % 95'i daha fazla verin. Ancak, bu adımı her laboratuarında tercih edilen protokolüne göre değişebilir. T hücre aktivasyonu ve polarizasyon için protokolü Jenner ve ark. güncellenmiştir (2009) 18. yalıtım in CD4 + 10 milyon PBMCs verir hücrelerden artış 4-6 milyon için CD4 + hücre. Bölünmüş iki şişe ve Th1 altında yetiştirilen ve sadece bir hafta içinde koşullar verimli 3-5 milyon Th1 ve Th2 hücreleri Th2 polarize.
 Not: santrifüj ile 4 ° C arasında başlamadan önce soğumasını.
<ol><li>İnsan PBMCs çözülme 1 mL (10 7 hücreleri) %1 penisilin-streptomisin, 2 mM L-glutamin ve % 10 ısı inaktive fetal sığır serum RPMI orta 10 mL içeren bir 50 mL tüp. 500 x g 5 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve ilave RPMI orta 15 ml steril 25 mL pipet içeren hücreleri resuspend. Hücreleri (ile steril 25 mL pipet) bir T75 kültür şişesi transfer.</li>
	<li>Hücreleri oksijen İnkübatör (37 ° C, % 5 CO 2) geceleme bırakın.</li>
	<li>Steril 25 mL pipet ile yüzen hücreleri 50 mL tüp için transfer. Cep telefonu numarasını ve canlılığı trypan mavi dışlama tarafından belirlemek.</li>
	<li>İzole CD4 + 10 milyon hücrelerden canlı olmayan-yapışık PBMCs lastikteki CD4 + ve üreticiye göre sütunları kullanarak pozitif seçime göre &#39; s öneriler (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman) aşağıdaki değişiklik: 10 7 PBMCs % 0.5 BSA PBS içinde 120 µL CD4 lastikteki 30 µL ile etiketlenir.</li>
	<li>RhIL-2 (10 ng/mL), plaka bağlı anti-CD3 (5 µg/mL) ve çözünebilir anti-CD28 (2 µg/mL) tarafından CD4 + T hücreleri 72 h için etkinleştirin. Th1 polarizasyon için rhIL-12 (20 ng/mL) ve anti-Il-4 (10 µg/mL) ekleyin. RhIL-4 (40 ng/mL) ve anti-IFN-γ (10 µg/mL) Th2 polarizasyon için eklemek.</li>
	<li>RhIL-2 (10 ng/mL) huzurunda ek 7 gün ve aynı polarize sitokinler (rhIL-12 için Th1 ve Th2 için rhIL-4) hücreleri kültür.</li>
</ol> 2. Çekirdeklerin yalıtım Not: ataç-seq sağlam çekirdeği ile gerçekleştirilir. Lizis arabellek içeren % 0.05 nonylphenyl polietilen glikol (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman), çekirdek birincil insan Th1 ve Th2 hücrelerden yalıtmak için kalibre. Bu adım laboratuvar Kimyasalları ve hücreleri ile ayarlama tavsiye ediyoruz. Aşırı yetersiz deterjan sağlam hücre transpozisyonu tepki verimliliğini düşürür. Hücre lizis verimliliği göre hücrelerin sayısı toplam çekirdek (trypan mavi pozitif hücrelerinin) sayısına göre belirlenir. 
Not: lizis arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2) hazırlayın. Bir salıncak-kova rotor 4 ile bir santrifüj soğumasını ° C. sabit açılı santrifüj yerine bir salıncak-kova santrifüj hücrelerde peletleme hücre/çekirdek kaybı azaltır. Çekirdeği veya hücre kaybı, dikkatle süpernatant atarak zaman damlalıklı önlemek için.
<ol><li>Ekle taze nonylphenyl polietilen glikol (için son bir konsantrasyon % 0.05) ve soğuk lizis arabelleğine kullanımdan hemen önce proteaz inhibitörleri (için 1 x son bir konsantrasyon) x 100. Arabellek buz üzerinde tutmak</li>
	<li>Kendi tutar ve canlılığı trypan mavi yöntemini kullanarak belirlemek için sayısı T hücreleri. Daha yüksek non-spesifik sindirim sonuçlarında % 90 daha düşüktür canlılığı.</li>
	<li>Transfer 0.5 x 10 6 T hücreleri (Th1 veya Th2) 1.5 mL mikrotüpler için. Spin aşağı vasıl 500 x g 5 min için saat 4'te ° C.</li>
	<li>Hücre Pelet 1 mL soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm resuspend. Spin aşağı vasıl 500 x g 5 min için saat 4'te ° C.</li>
	<li>Hücre Pelet 1 mL soğuk lizis arabellek (nonylphenyl polietilen glikol ve proteaz inhibitörleri içeren) resuspend. Tüp buz üzerinde tutun. Yavaşça çekirdeklerin etkilemesini önlemek için pipet.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde 10 µL al ve lysed hücreleri ile microtube buz üstünde ise bir otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak. Bu adımı çekirdeklerin zarar görmesini önlemek için beş dakika aşmaması gerekir. Hücreleri en az % 80'i lysed.</li>
	Hemen yanaşma tepki ile <li>devam et. Hazırlanan çekirdeği üzerinde buz tutmak</li>
</ol> 3. Transpozisyon reaksiyon Not: Bu adımda, izole çekirdeği NGS sıralaması bağdaştırıcısı yüklü prokaryotik Tn5 transposase (TDE1) ile inkübe. Hiperaktif Tn5 aynı anda DNA parçaları ve bağdaştırıcıları (tagmentation süreci) genom erişilebilir bölgelere ligates. Çekirdek ve Tn5 transposase arasındaki oran erişilebilir Kromatin adlı tercihli bölünme için önemlidir. Bu iletişim kuralı için 100.000 çekirdeği 100 μL tepki birimindeki kalibre edilmiş. Ancak, reaksiyon küçültülmüş.
<ol><li>Ayarla sıcaklık termal bir shaker 37 ° c</li>
	<li>Transfer 100.000 çekirdekler için 1.5 mL microtube.</li>
	<li>10 dk 4 ° C'de ve yavaşça için 500 x g, santrifüj süpernatant kaldırmak.</li>
	<li>Transpozisyonu reaksiyon bileşenleri çekirdek için belirtilen Tablo 1 ekleyin.</li>
	<li>Nazik pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>(500 rpm) sallayarak nazik ile yanaşma tepki bir termal shaker-37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. 
	Not: DNA Temizleme katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk 19 tarafından gerçekleştirilir (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman) veya PCR arıtma sütunlar. Temizlik sonunda, 10 mm Tris-HCl, pH 8 20 µL içinde DNA parçaları elute. EDTA elüsyon arabellekte kaçının.</li>
</ol> 4. PCR zenginleştirme ataç-seq kütüphanelerin Not: ataç-seq Kütüphane Yani, DNA parçalarının takılı bağdaştırıcılar ile yükseltmek için bu adım hedefleniyor. Aynı yeni nesil sıralama şeritte birkaç ataç-seq kütüphanelerin karıştırma sağlamak için (&#34; çoğullama &#34;) kullanım Sıralanmayan astar 1 (Ad1_noMx) 1 tüm örnekleri için ve farklı bir dizine (barkodlu) astar 2 (reklam 2.1-2.24) Her örnek için 1. Astar dizileri desteklenmiştir Tablo malzemeleri/ekipman sağlanmaktadır.
<ol><li>İlk PCR güçlendirme Not: astar 1 (Ad1_noMx) ve astar 2 çalışma konsantrasyonu 25 µM olduğunu. Tüm astar için 25 µM 100 µM özgün stoktan seyreltilmiş. Tüm PCR reaksiyonları, astar 1 (Ad1_noMx) ve dizin oluşturulmuş astar 2 yalnızca birini kullanın.
	<ol><li>PCR reaksiyon bileşenleri belirtilen Tablo 2 steril bir PCR tüp ekleyin.</li>
		<li>Yer PCR tüp bir termal cycler ve PCR güçlendirme Tablo 3 ' te ayrıntılı bisiklet koşullarını kullanarak gerçekleştirmek.</li>
	</ol></li> <li>Ek amplifikasyon döngü sayısı değerlendirilmesi Not: ek PCR döngü sayısı Kütüphane parçaları f yeterli miktarda verimya da başarılı bir gelecek nesil sıralama çalışmasını, GC önlemek ve önyargı 20 boyutlandırmak için simge durumuna küçültülmüş. En iyi kütüphane parçası amplifikasyon için gerekli PCR döngü (N) sayısı tayini kantitatif PCR (qPCR) tarafından yapılır.
	<ol><li>Seyreltik astar 1 (Ad1_noMx) ve 2 25 µM den 6.25 µM (ilk kütüphane amplifikasyon için kullanılır).</li>
		<li>Optik PCR tüpleri veya bir tabak Tablo 4 ' te belirtildiği gibi bileşenleri ekleme.</li>
		<li>Bir qPCR alet ve döngüsü olarak belirtilen Tablo 5.</li>
		<li>Ek amplifikasyon döngüsü (N) süreyi tahmin etmek için arsa devir sayısı x ekseni ve y ekseni üzerinde göreli floresan (RFU).</li>
		<li>Ek amplifikasyon sayısını döngüleri (N) 1/3, plato qPCR tepki ulaştı döngü sayısı var. Şekil 2 ~ 2,350 göreli Floresans birimler, RFU (kalın yeşil çizgi) plato ulaştı üç ataç-seq kitaplıkları için örnekler sağlar. (Kırmızı ve mavi amplifikasyon eğrileri) kütüphanelerin iki kişilik 8 döngüleri ve üçüncü kütüphane (pembe) 9 ÇSYİ devredir içinde maksimal miktarı (783 RFU, y ekseni üzerinde işaretlenmiş) üçte biri güçlendirilmiş PCR devir sayısına karşılık gelir.</li>
	</ol></li> <li>Son PCR güçlendirme <ol><li>kalan 45 µL PCR reaksiyon yükseltmek. Termal cycler 4.1.2 adımda amplifikasyon tepki içeren bir PCR tüpü yerleştirin. Tablo 6 ' da açıklanan PCR programını çalıştırın. Amplifikasyon döngü (N) önceden belirlenmiş (Adım 4.2.5) sayısı kullanın.</li>
	</ol></li></ol> 5. Boyut seçimi ataç-Seq kütüphaneler Not: yüksek molekül ağırlıklı Kütüphane parçaları ortadan kaldırdığından deneyim, boyutu seçimi güçlendirilmiş ataç-seq kütüphanelerin yeni nesil sıralama sonuçları geliştirir. son ataç-seq kitaplık. 
Not: oda sıcaklığında 30 dk kullanmadan önce ısıtmak manyetik boncuklar izin. 
Taze % 70 etanol suda nükleaz ücretsiz hazırlayın.
<ol><li>Karıştırarak mıknatıslı boncuk resuspend.</li>
	<li>(4.3.1. adımda elde.) ataç-seq kitaplıklarına nükleaz ücretsiz su ekleyin ve en çok 100 µL getirmek.</li>
	<li>Ekle 50 µL (0.5 x) resuspended DNA'ya bağlanıcı manyetik boncuklar için güçlendirilmiş kütüphanelerin 100 µL. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından karıştırın. Örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Gerekirse, hızlı bir şekilde mikrotüpler spin.</li>
	<li>Tüp manyetik boncuklar süpernatant ayırmak 2 dk için uygun bir manyetik stand üzerine yerleştirin. 2 dakika sonra yeni bir microtube süpernatant transfer.</li>
	<li>Pipetting tarafından süpernatant hacmi ölçmek ve manyetik boncuklar 0.7 x ekleyin. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından Mix.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya. 2 dakika süreyle manyetik bir stand üzerinde yer</li>
	<li>Sonra 2 dk kuluçka, süpernatant atmak. Tüpler manyetik kürsüye iken boncuk yıkamak için 200 taze yapılmış µL % 70 etanol ekleyin.</li>
	<li>Devam microtube mıknatıs için 30 üzerinde s ve sonra atma etanol. Adım 5.7.for iki son etanol yıkar yineleyin.</li>
	<li>Tamamen kalan etanol ve tüp mıknatıs üzerinde ise Boncuk 5 min için kurumasına izin kaldırın. Gerekirse, kısaca microtube spin. P10 pipet ucu ile etanol izlerinin giderilmesi.</li>
	<li>Microtube mıknatıs kaldırın ve 10 mm Tris-HCl, pH 8 22 µL ekleyin. EDTA içeren arabellek ataç-seq kitaplıklarında elute değil.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2 min için tüp kuluçkaya ve manyetik kürsüye getirin.</li>
	<li>Çözüm açık olduğunda, yeni bir steril microtube eluted kütüphanelerin 20 µL transfer.</li>
	<li>Deposu boyutu seçili ataç-seq kitaplıkları, -20 ° c</li>
</ol> 6. ATAÇ-Seq kütüphanelerin kalitesi analizi <ol><li>ataç-seq kitaplıkları tarafından gerçek zamanlı PCR kalitesini doğrulanmasını Not: yeni nesil önce ataç-seq kütüphanelerin gürültü oranı sinyal değerlendirmek önemlidir sıralama. Bu DNA parçalarının üzerinden erişilebilir ve ulaşılmaz loci kantitatif PCR (qPCR) kullanarak göreli miktarı belirlenerek yapılır. Ulaşılmaz loci (negatif kontrol, chr1:48, 137, 860-48,137,934 ve chr1:193, 093, 748-193,093,827) 1 ve 2 astar çiftleri tarafından güçlendirilmiş. Erişilebilir loci (pozitif kontrolü, chr19:30, 336, 166-30,336,253 ve chr19:11546154-11546237) 3 ve 4 astar çiftleri tarafından güçlendirilmiş. Pozitif ve negatif loci insan CD4 + hücreleri (KODLA katılımların ENCSR000EQE ve ENCSR000EQG) Kromatin erişilebilirlik (DHS-seq) profillerden tanımlı değil. Negatif astar 1 büyük bir heterochromatic intergenic bölgeye (230 kb TRADB2 ve FOXD2 dan 88 kb) yer alır. Negatif kontrol bölgesi 2 CDC73 gene ilk intron içinde mevcuttur. Astar çifti 3 pozitif bir açık Kromatin bölge içinde olumlu astar çifti 4 süre siklin E (CCNE1) gen aşağı protein kinaz C substrat 80 K-H (PRKCSH) düzenleyici içinde ortalanır. Önemlisi, bu denetim loci onlar insan hücre türleri geniş bir yelpazede kitaplıklardan ataç-seq izlemek için uygulanabilir düşündüren başka insan hücre tipleri KODLA proje 3, erişilebilirlik benzer bir yol gösterir. Astar verimliliği ve tüm astar çiftleri özgüllüğü qPCR (hücrelerden insan Th) genomik DNA'ın seri bir seyreltme ve elde edilen güçlendirilmiş ürünler bir erime eğrisi analizi tarafından doğrulanmış.
	<ol><li>İzole genomik DNA ticari olarak kullanılabilir kullanarak (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman) kit.</li>
		<li>Güçlendirilmiş ataç seq seyreltik Kütüphane 1:10 (1 µL Kütüphane + 9 nükleaz ücretsiz su µL) ve genomik DNA ~ 5 ng/µL '.</li>
		<li>Reaksiyon karışımı (Tablo 7) tepkiler nüsha gerçekleştirilen dikkate alarak her pozitif ve negatif kontrol astar çifti için hazır olun.</li>
		<li>QPCR ana mix tedarikçi tarafından önerilen protokolüne göre qPCR termal cycler Incubate.</li>
		<li>Analiz sonuçları qPCR alet &#39; s yazılım (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman). Genomik DNA kontrolü örnek olarak seçin. Elde edilen değerler bir zenginleştirme erişilebilir bölgeler (pozitif kontrol astar tarafından güçlendirilmiş) temsil eder. Bir örnek Tablo 8 ' de gösterilen. 
		Not: Tahmini ortalama Kütüphane boyutu ve konsantrasyon: ataç-seq kitaplıklarından DNA parçalarının boyutu dağılımı yüksek-duyarlı otomatik Elektroforez Sistemleri üretici göre belirlenir &#39; s yönergeleri. Bu örnek toplama dsDNA yüksek-duyarlı kit ve en az 2 µL her DNA örneği kullanarak bir yer olarak ölçmek için tavsiye edilir. 
		Not: Yeni nesil sıralama - kütüphaneler çoğullama önce her ataç-seq Kütüphane molarite formülü kullanarak hesaplama: (ng/µL x 10 6) / (660 x ortalama kitaplığı parçası uzunluğu). İçin amaç &#62; açık Kromatin değerlendirmek için her ataç-seq kitaplık 30 milyon defa okundu insan örnekleri bölgelerinde. Kütüphanede NGS sıralama için yeterli olup olmadığını belirlemek istiyorsanız, başlangıçta ~ 10 milyon okur (sıralama Lane DNA sıralama cihazda hızlı çalıştırma modunda % 5) nişan al. Nucleosome konumlandırma anlaması için eşleştirilmiş uç sıralama gerekli 1 olduğunu göz önünde bulundurun.</li>
	</ol></li></ol> 7. Yeni nesil sıralama elde edilen sonuçların analiz <ol><li>FastQC resimler, her kitaplık için ayrı ayrı inceleyerek sıralama okuma kalitesini sonucuna.</li>
	<li>Papyon 21 yazılım Unix/Linux ortamında kullanarak okuma insan başvuru genom (hg19 birleştirme) için hizalayın. Komut &#39; papyon -m 1 - q -S Genom dizini reads.fastq output_aligned.sam &#39;. Genom dizini papyon genom dizinleri depolandığı klasörün için duruyor. Parametre -m 1 genomu içinde birden fazla locus okuyan hizalamasını izin vermiyor - q fastq biçiminde olması gerektiğini giriş dosyası için -S mı SAM biçiminde çıktı için.</li>
	<li>Yinelenen okuma UNIX/Linux ortamında SAMtools 22 rmdup seçeneğini kullanarak kaldırın. Komutları &#39; samtools göster -S output_aligned.sam -b | samtools sıralama -o-output_aligned &#62; output_aligned.bam &#39;, samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam &#39;. İlk komut, görünüm, hangi sonra sıralanır BAM biçime SAM biçimini değiştirir. Rmdup seçeneği daha sonra sıralanmış BAM dosyada uygulanır. İsteğe bağlı olarak bir özgün ataç-seq kağıt 1 ' de açıklandığı gibi okuma transposon ekleme sitesi için ayarlayabilirsiniz. Bu yapılır 23 UNIX/Linux ortamında komutları kullanarak BEDtools. Komutları &#39; bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam &#62; output_aligned _rmdup.bed &#39;, &#39; shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g genom &#62; output_aligned _rmdup_adjusted.bed &#39;. İlk komut, bamTobed, sonra shiftBed komut için kullanılabilecek yatak biçime BAM biçimini değiştirir. Genom genom her kromozom uzunluğunu içeren bir sekme sınırlandırılmış dosya dosyadır. Dosya genellikle BEDtools dizinine eklenir.</li>
	Aşağıdaki parametrelerle kayar yatak dosyada UNIX/Linux ortamında modeli tabanlı analiz ChIP-seq (MACS2) 24 yazılım kullanarak <li>gerçekleştir tepe arama:--nomodel--extsize 75 - shift -30. Bu parametreler her sıralama okuma ortasında transposon ekleme sitedir okuma ayarlamak için kullanılır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).</li><li>Thurman, R. E., Rynes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome.">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).</li><li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+(FAIRE)+to+isolate+active+regulatory+DNA.">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li><li>Cui, K., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Approaches+to+Determining+Nucleosome+Occupancy+in+Metazoans+Using+MNase-Seq.">Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq.</a> Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).</li><li>Qu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individuality+and+Variation+of+Personal+Regulomes+in+Primary+Human+T+Cells.">Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells.</a> Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).</li><li>Scharer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq+on+biobanked+specimens+defines+a+unique+chromatin+accessibility+structure+in+na&#239;ve+SLE+B+cells.">ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in na&#239;ve SLE B cells.</a> Sci Rep. 6, 27030 (2016).</li><li>Seb&#233;-Pedr&#243;s, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Regulatory+Genome+of+Capsaspora+and+the+Origin+of+Animal+Multicellularity.">The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity.</a> Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).</li><li>Davie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Transcription+Factors+and+Regulatory+Regions+Driving+In+Vivo+Tumor+Development+by+ATAC-seq+and+FAIRE-seq+Open+Chromatin+Profiling.">Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling.</a> PLOS Genet. 11 (2), (2015).</li><li>Villar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+Evolution+across+20+Mammalian+Species.">Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species.</a> Cell. 160 (3), 554-566 (2015).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Prescott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+Divergence+and+cis-Regulatory+Evolution+in+the+Human+and+Chimp+Neural+Crest.">Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest.</a> Cell. 163 (1), 68-83 (2015).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Jenner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factors+T-bet+and+GATA-3+control+alternative+pathways+of+T-cell+differentiation+through+a+shared+set+of+target+genes.">The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).</li><li>DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+reversible+immobilization+for+the+isolation+of+PCR+products.">Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).</li><li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries.">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Meyer, C. A., Shirley Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+mitigating+bias+in+next-generation+sequencing+methods+for+chromatin+biology.">Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology.</a> Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).</li><li>He, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+DNase-seq+protocol+and+data+analysis+reveals+intrinsic+bias+in+transcription+factor+footprint+identification.">Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification.</a> Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).</li><li>Madrigal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Accounting+for+Sequence-Specific+Bias+in+Genome-Wide+Chromatin+Accessibility+Experiments:+Recent+Advances+and+Contradictions.">On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).</li><li>Qin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChiLin:+a+comprehensive+ChIP-seq+and+DNase-seq+quality+control+and+analysis+pipeline.">ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline.</a> BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ATAC-seq+approach+reveals+lineage-specific+reinforcement+of+the+open+chromatin+landscape+via+cooperation+between+BAF+and+p63.">A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63.</a> Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).</li><li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA.">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan ataç-seq Protokolü başarılı bir şekilde erişilebilir Kromatin analiz için Primer hücre içinde istihdam edilmiştir (insan Th1, Th2 hücrelerinin ve B hücreleri) yanı sıra kültürlü hücre hatları (MCF10A insan meme kanseri hücreleri ve U261 glioblastoma hücreleri). Diğer hücre tipleri için ataç-seq yüklemeden lizis adımda özellikle bazı protokol optimizasyon gerektirebilir. Non-iyonik deterjan konsantrasyonu çok yüksek ise, mitokondriyal DNA kirlenme daha yüksek bir yüzdesi olabilir. Bu çekirdekler verim azaltmadan lizis arabellekte deterjan konsantrasyon azaltarak azaltılabilir. Deneyim, deterjan % 0.05 ile lizis tampon en tatmin edici sonuçlar verdi. Buna ek olarak, bir salıncak-kova sabit açılı rotor Pelet mitokondri azaltılmış 500 G force azaltmak izin yerine çekirdek iplik. Araştırmacılar Ayrıca deterjanlar, örneğin, digitonin17diğer türleri test edebilir. Ancak, en iyi duruma getirilmiş lizis koşullarla bile, mtDNA kirlenme kaçınılmazdır. MtDNA tümüyle kaldırmak için CRISPR/Cas9 sistem-ebilmek var olmak kullanılmış15. Bu durumda, ATAÇ-seq kütüphaneler sgRNAs hedef mtDNA ve Cas9 nükleaz mtDNA15sindirimi ile inkübe.
Bu ataç-seq Protokolü (100.000) için gerekli çekirdek sayısı hücre numarasının klinik örneklerinden kıt7olduğu durumlarda sınırlama. ATAÇ-seq başarıyla aşağı 5.000 ve 500 hücreleri1,13,17 tepki cilt1,13, azaltarak sütunlarla yerine manyetik boncuklar ile temizlemesi gerçekleştirmek ölçeklenmiş 13veya temizleme adım1kaçınarak. Buna ek olarak, tek hücreli ataç-seq (scATAC-seq) bireysel çekirdeği16ayrı bir mikrosıvısal aygıtı kullanarak gerçekleştirilebilir. Özellikle, daha fazla başlangıç materyali ve deney gerçekleştirmek için birkaç gün daha Dnaz seq ve dürüst-seq, gibi Kromatin erişilebilirlik ölçmek için diğer yöntemleri gerektirir.
O şimdi yaygın olarak çeşitli NGS yöntemleri önyargıları ortak olayları25olduğunu için teşekkür ederiz. Çeşitleri farklı Kromatin erişilebilirlik önlemler için nedenlerinden biridir enzimatik bölünme adım25. Dnaz bölünme önyargı26 gösterir ve şimdi Tn5 transposase27yanı sıra bölünme tercih gösterir tanınırsa gösterilmiştir. Neyse ki, olası önyargı hesaplama açısından bir kalite kontrol boru hattı ChiLin28gibi kullanarak belirlenebilir. Başka bir ortak kaynak önyargı PCR güçlendirme adım20,25' tir. Bir önyargı için GC-zengin amplifikasyon25parçaları gibi bu sık sık ortaya çıkar. Önyargı her PCR güçlendirme adım artırır beri biz 9 ek döngü (N) ataç-seq kitaplıkları son PCR amplifikasyon aşmayın.
Tn5 transposase ve çekirdek arasındaki uygun oran başarılı ataç-seq2için önemlidir. Enzim aşırı "aktarılması" ulaşılmaz loci ve yüksek arka plan yol açacak. Bu qPCR kalite kontrol adım negatif kontrol bölgelerde yüksek amplifikasyon yansıtılır. Çekirdeği aşırı "altında nda için" yol açacak. Bu durumda, çok uzak bir bölünme siteler daha az PCR güçlendirilmiş parçaları ve düşük Kütüphane karmaşıklık neden olur. Çekirdek sayısı doğru belirlemek için biz hukuka reaksiyon önce ve sonra hücre lizis ek bir sayım adım tanıttı.
Transkripsiyon regülatör belirli genomik yerlerde faaliyet izni olmaksızın Kromatin erişilebilirlik bir önemli epigenetik düzenleyici katmanıdır. Böylece, DNA dizisi erişilebilir Kromatin profilinde olası transkripsiyon faktörleri onlarca kimlik ve hedef loci hakkında bilgi sağlar. Bir RNA ifade profil (ataç-seq tarafından elde edilen) bu bilgileri birleştiren bir odak daha fazla ChIP-seq13,22tarafından analiz edilecek ilgili transkripsiyon faktörleri sağlar. Buna ek olarak, hastalık ilişkili polimorfizmleri sadece yüzde 10'u içinde kodlama genom30vardır. Böylece uygulama ataç-seq klinik numune kodlamayan türevleri (örneğin, sistemik lupus Eritematozus8) hastalık durumunda yönetmelikte gen etkileyebilir düzenleyici elemanlarının, olan ortaya çıkarabilir. Umarız bu ataç-seq protokolü yardımcı olacak ve baktılar müfettişler araştırma ilerlemek için güçlü bu yöntemi kullanmak için teşvik ediyoruz.

ATAÇ-seq1,2 düzenleyici3 açık Kromatin bölgeleri ve nucleosome konumlandırma sağlar güçlü bir yöntemdir. Bu bilgileri konumu, kimlik ve transkripsiyon faktörleri Faaliyet çıkarım için uygulanır. Kromatin yapısı nicel değişimler ölçmek için yöntemin duyarlılığı Kromatin remodelers ve değiştiriciler, RNA polimeraz II1transkripsiyon aktivite gibi Kromatin faktörlerin aktivitesinin çalışma sağlar. Böylece ataç-seq ilgi herhangi bir hücre tipi transkripsiyon yönetmelikte yöneten mekanizmaları deşifre için güçlü ve tarafsız bir yaklaşım sağlar. Biz ataç-seq adaptasyon için birincil insan Th1 ve Th2 hücreleri tanımlamak.
ATAÇ-seq adaptörler için yeni nesil sıralama (NGS) çiftler DNA fragmantasyonu DNA'sı adaptörler (örneğin, "tagmentation" süreci)1ile etiketleme ile olan hiperaktif Tn5 transposase dolu. PCR güçlendirme elde edilen DNA kütüphaneler yeni nesil sıralama (şekil 1) için hazırsınız demektir. Erişilebilir Kromatin tercihli tagmentation ataç-seq sıralama okur yerel zenginleştirme analiz tarafından algılanır.
Kısa deneysel işlemin ve Kromatin erişilebilirlik ve nucleosomal Dnaz seq4, dürüst-seq5ve MNase-seq6, gibi konumlandırma ölçmek için diğer yöntemleri göre daha az başlangıç materyali için gereksinim vardır ATAÇ-seq kullanımı insan Primer hücre1,7 ve klinik örnekleri8yanı sıra tek hücreli organizmalar9, bitkiler10, meyve sinekleri11 de dahil olmak üzere birden çok biyolojik sistemlerde terfi ve çeşitli memeliler12.
Kimlik için erişilebilir loci bağlı faktörler zenginleştirme onların bağlama sırası motifleri analiz veya ataç-seq takip yüksek üretilen iş DNA sıralama () tarafından Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ile birleştirerek ortaya transkripsiyon ChIP-seq). Bu yaklaşım lineage özgü transkripsiyon faktörleri fare13' te hematopoiesis için önemli tanımlaması etkin. ATAÇ-seq tarafsız ve küresel doğası gen düzenlemesi reaktifler çipi analiz için antikorlar gibi mevcut değildir organizmalarda eğitim sağlar. Örneğin, evrimsel değişimler CIS-düzenleyici bölgeleri tespit edilmiştir kafatası nöral crest hücrelerden insan ve şempanzenin14, düzenleyici elemanlarının gelişimsel değişimler sırasında erken fare inceleyerek embriyogenez15, tek hücreli C. owzarzakibir yaşam döngüsü boyunca yasal manzara modunda değiştirir9ve Organizatör ve arttırıcılar 20 memeli türü12arasında evrimi.
ATAÇ-seq Ayrıca Kromatin erişilebilirlik hangi genellikle genom genelinde Çalışmalar7,16evades böylece ifşa değişkenlik hücre popülasyonlarının içinde tek kişilik hücrelerde ölçmek için vesile olmuştur. Buna ek olarak, ATAÇ-seq örnekleri nadir hastalık koşullarında DNA yasal bölgelerde meydana gelen değişiklikler çalışma için kullanılabilir. Örneğin, ATAÇ-seq Akut Miyeloid Lösemi (AML)17 veya Rasbaşlangıcı sırasında değişiklikleri düzenleme peyzaj çalışması için kullanılabilir-oncogenesis11tahrik.

mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq

Yüksek işlem hacmi sıralama (ataç-seq) ile Transposase erişilebilir Kromatin için tahlil (erişilebilir) bölgelerinde açık: Kromatin tanımlanması için kullanılan bir yöntemdir. Bu bölgeler için hangi transkripsiyon faktörleri bağlamak düzenleyici DNA öğeleri (örneğin, Organizatör, arttırıcılar, odağı kontrol bölgeleri, izolatörler) temsil eder. Erişilebilir Kromatin manzara eşleme bir güçlü açığa çıkarmak etkin düzenleyici elemanlarının için genom arasında bir yaklaşımdır. Bu bilgiler ilgili transkripsiyon faktörleri ağ ve gen ifade programları yöneten Kromatin yapısı mekanizmaları keşfetmek için tarafsız bir yaklaşım olarak hizmet vermektedir. ATAÇ-seq Dnaz için güçlü ve hassas bir alternatif olduğunu ben yeni nesil sıralama (Dnaz-seq) ve formaldehit destekli yalıtım Kromatin genom geniş analizi için düzenleyici elemanlarının (FAIRE-seq) ile birleşince aşırı duyarlılık analizi erişilebilirlik ve micrococcal nükleaz duyarlı sitelerin (MNase-seq) nucleosome konumlandırma belirlemek için sıralama için. Biz insan birincil bağışıklık Yani CD4 + lenfosit hücreleri için en iyi duruma getirilmiş detaylı bir ataç-seq Protokolü mevcut (T yardımcı 1 (Th1) ve Th2 hücrelerinin). Bu kapsamlı protokol hücre hasat ile başlar sonra Kromatin tagmentation, numune hazırlama için yeni nesil sıralama, moleküler yordamı açıklar ve ayrıca yöntemleri ve konuları için kullanılan hesaplama analizleri içerir Sonuçları yorumlayın. Ayrıca, zaman ve para tasarrufu için biz ataç-seq Kütüphane sıralama önce değerlendirmek için kalite kontrol önlemleri tanıttı. Önemlisi, bu protokol için sunulan ilkeleri diğer insan bağışıklık ve non-immün Primer hücre ve hücre hatları onun uyum sağlar. Söz konusu kurallar da yeni nesil sıralama yöntemleri ile yetkin olmayan laboratuarlar için yararlı olacaktır.

Bu iletişim kuralı, nihai sonucunu genellikle 3-20 ng/µL bir ataç-seq kütüphanedir. Ne zaman bir sistemde DNA bütünlük analizi için koşmak (bakınız Tablo malzemeleri/ekipman), merdiven gibi bir görünüm2 (şekil 3A) gösteriyorlar. DNA parçaları ortalama boyutunu genellikle ~ 450-530 bp var.
Yeni nesil sıralama gerçekleştirmeden önce ataç-seq kütüphanelerin uygun kalite kontrol zaman ve para tasarrufu önemlidir. Pozitif denetimleri zenginlik daha--dan 25 - ve 75 - kat olduğunu biz arşivlerine yeni nesil sıralama (NGS) için uygun düşünün (için astar çiftleri 3 ve 4, sırasıyla) göre negatif denetimleri (şekil 3B) ve ne zaman onlar göstermek daha önce bahsedilen nucleosomal, merdiven gibi görünüm. QPCR veri analiz ederken, biz de Cq değerleri negatif ve pozitif kontrol astar için bir şablon olarak genomik DNA ile reaksiyonlarda benzer ve Cq (reaksiyonlarda ataç-seq DNA ile negatif kontrol bölgeleri için değer doğrulamakta olduğunuz deneyler. arasında sürekli parçaları) Örneğin, aniden daha düşük Cq değerleri söz konusu olduğunda biz çekirdek aşırı ters yazılan ve böylece heterochromatin bölgelerden kaynaklanan DNA parçalarının aşırı temsil şüpheli. Ayrıca, ATAÇ-seq kitaplıkları (yüksek-duyarlı teyp tabanlı Elektroforez tarafından elde edilen) jel görüntü adaptörler varlığını gösteriyorsa (~ 120 bp), aşırı DNA bozulması (~ 200 parçaları çoğu bp), veya büyük parçalar (1 kb üzerinde), biz NGS adıma devam.
Ayrıca, her zaman ilk NGS Kütüphane başına 10 milyon okur amacımız içinde gerçekleştirin. Bu sıralama sonuçlar (örnek tüm parametreler FastQC rapor dosyasında geçen ve tepe arama yaptıktan sonra 1000-2000 doruklarına elde edebilirsiniz) tatmin edici değilse, arşivlerine daha derinden sıralanamadı (30 milyondan fazla okuma/ataç-seq Kütüphanesi).
ATAÇ-seq deneyler memeli hücreleri üzerinde herhangi bir yere gelen ~ 30-%70 sıralı okuma mtDNA10gelebilir. Buna ek olarak, bizim kütüphaneleri mitokondrial genom eşlenmiş % 6-20 okuma içeriyordu. Bu insan CD4 + T lenfositleri1ataç-seq kitaplığında bildirilen % 46 daha düşüktür. Bunlar okuma kirletici ortadan kaldırarak sonra biz ~ 7-32 milyon benzersiz okuma başvuru insan genomu (% 58-%91 tüm okuma) eşleme ile kalmıştı. Bunlardan 0.1 - ataç-seq tepeler (şekil 4) 2 milyon okuma (%6,8 - % 12, tüm okuma) olduğunu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig1.jpg"> 
Resim 1 . İş akışı deneysel adımlar. Binbaşı gösterimi adımlar bu ataç-seq protokol için. Durdurma Puan sarı altıgenler tarafından belirtilir. İsteğe bağlı bir adım turuncu bir Altıgen ile temsil edilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig2.jpg"> 
Resim 2 . PCR döngü ataç-seq kitaplıkları son zenginleştirme için gerekli ek sayısı hesaplanması. PCR güçlendirme eğriler üç farklı ataç seq kitaplıkları için kırmızı, mavi ve pembe gösterilir. Amplifikasyon reaksiyonlar 2.350 RFU (üst yeşil yatay çizgi) bir plato ulaştı. Ek PCR döngü sayısı 783 RFU (2,350/3) amplifikasyon eğri üzerinde ile kesişiyor. İki kitaplık (kırmızı ve mavi) 8 ek amplifikasyon döngüleri üçüncü kütüphane (pembe) 9 döngüleri gerektirir. Sigara-şablonu denetim (NTC) alt yeşil çizgilerle gösterilir. X ekseni, döngüsü numarası. Y ekseni, RFU birimleri. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig3.jpg"> 
Şekil 3 . Kalite kontrol analizi ataç-seq kütüphanelerin. Teyp tabanlı otomatik Elektroforez güçlendirilmiş ataç-seq kütüphanelerin(a)sonuçları. L, merdiven; A-D, biyolojik kütüphanelerin Th1 ve Th2 hücrelerden yineler. (B) qPCR kalite kontrol analizi ataç-seq kütüphanelerin. Genomik DNA ve dört ataç-seq kitaplık negatif kontrol astar çiftleri (1 ve 2) ve pozitif kontrol astar (3 ve 4) tarafından güçlendirilmiş. ATAÇ-seq kitaplıkları (mavi) için elde edilen değerler ilk genomik DNA amplifikasyon düzeyleri için normalleştirilmiş (1; için değeri: keyfi Kırmızı). Daha sonra değerleri pozitif kontrol bölgeleri için negatif kontrol bölgeleri (daha düşük grafik) normalleştirilmiş. Kitaplık #1 ve #2 NGS sıralama için gönderildik. Değerleri temsil eden ortalama ± SEM <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig4.jpg"> 
Şekil 4 . Genom tarayıcı snapsh ots erişilebilir Kromatin bölgeleri Th1 ve Th2 hücrelerinin. ATAÇ-seq parça NFKB1, JUN, CD28, (sadece Th1 ifade) IFNG ve IL4 ve IL13 (sadece Th2 ifade) loci Th1 ve Th2 hücrelere (her biri için iki biyolojik tekrarlar) gösterilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TD arabellek</td>
			<td>50</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDE1 transposase</td>
			<td>5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nükleaz ücretsiz su</td>
			<td>45</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam hacim</td>
			<td>100</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Yanaşma tepki karışımı hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATAÇ-seq Kütüphane</td>
			<td>15</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astar 1 (Ad1_noMx) *</td>
			<td>2.5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
</tbody></table>		<tr>
			<td>Astar 2 *</td>
			<td>2.5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext yüksek-sadakat 2 x PCR Master Mix **</td>
			<td>25</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nükleaz ücretsiz su</td>
			<td>5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam hacim</td>
			<td>50</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* Final her astar 1,25 mikron bölgedir.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">** Kit ile sağlanan PCR reaktif tavsiye edilmez</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">(Buenrostro ve ark., 2015. ATAC-seq: Kromatin erişilebilirlik genom çapında raporlaması için bir yöntem).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Buna ek olarak, ayrıca başarılı Arttırımlar ile gerçekleştirdik</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">NEBNext Q5 sıcak başlangıç HiFi PCR Master Mix (uzantısı sıcaklık ise 65 ° C).</td>
		</tr>
	

Tablo 2: Bileşenleri ilk PCR reaksiyon karışıma (Adım 5.1.1.).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DÖNGÜSÜ ADIM</td>
			<td>SICAKLIK</td>
			<td>ZAMAN</td>
			<td>DÖNGÜLERİ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uzantısı *</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>5 dk</td>
			<td rowspan="2">1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İlk denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavlama</td>
			<td>63 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uzantısı</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>3 dk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basılı tutun</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Bu adımı her ikisi de genişletmek için gereklidir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">astar transpozisyonu reaksiyon sonra biter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 3: PCR bisiklet koşullarını ilk kütüphane amplifikasyon (Adım 5.1.2.) için
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR reaksiyon (Adım 4.1.1) aliquot *</td>
			<td>5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astar 1 (Ad1_noMx) **</td>
			<td>1</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astar 2</td>
			<td>1</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x SYBR ana mix ***</td>
			<td>7.5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nükleaz ücretsiz su</td>
			<td>0,5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam hacim</td>
			<td>15</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* DNA şablon yerine şablon sigara denetimi için ultra saf su ekleyin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">** Son her astar 417 bölgedir nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Tercih edilen ana karışımı için qPCR kullanın.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Polimeraz, dNTPs, MgCl2ve floresan boya içermelidir.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 4: QPCR reaksiyon karışımı (Adım 5.2.2) hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DÖNGÜSÜ ADIM</td>
			<td>SICAKLIK</td>
			<td>ZAMAN</td>
			<td>DÖNGÜLERİ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İlk denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavlama</td>
			<td>63 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uzantısı</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>3 dk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basılı tutun</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 5: Bisiklete binme amplifikasyon döngüleri (N) (Adım 5.2.3.) ek sayının qPCR dayalı değerlendirme için koşullar
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DÖNGÜSÜ ADIM</td>
			<td>SICAKLIK</td>
			<td>ZAMAN</td>
			<td>DÖNGÜLERİ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İlk denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavlama</td>
			<td>63 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uzantısı</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>3 dk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basılı tutun</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 6: Bisiklete binme son PCR zenginleştirme adım (Adım 5.3.) için koşullar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Bir tek PCR reaksiyon için:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seyreltme genomik DNA Kütüphanesi</td>
			<td>2.5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mikron astar F (F1 veya F2 veya F3 veya F4) *</td>
			<td>0,3</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mikron astar R (R1 veya R2 veya R3 veya R4) **</td>
			<td>0,3</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x SYBR ana mix ***</td>
			<td>5</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nükleaz ücretsiz su</td>
			<td>1.9</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam hacim</td>
			<td>10</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* Son 300 tepki karışımı her astar bölgedir nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">** Eğer R astar R1 vb olması gerekenden daha astar F1 kullanarak.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">2 x ana mix, laboratuvar qPCR araç için uygun tercih edilen kullan.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 7: Reaksiyon koşulları QC analizi (adım 7.1.3.) için.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Hedef</td>
			<td>Örnek</td>
			<td>CQ demek</td>
			<td>CQ SEM</td>
			<td>Göreli miktarı</td>
			<td>Normalleştirilmiş</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="4">Negatif kontrol</td>
			<td>ATAÇ-seq</td>
			<td>30.39</td>
			<td>0,11</td>
			<td>1</td>
			<td>1,01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>30,4</td>
			<td>0,16</td>
			<td>0,99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td>ATAÇ-seq</td>
			<td>30,3</td>
			<td>0.18</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>30.34</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0,99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="4">Pozitif kontrol</td>
			<td>ATAÇ-seq</td>
			<td>23.27</td>
			<td>0.03</td>
			<td>1</td>
			<td>173.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>30,7</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,01</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td>ATAÇ-seq</td>
			<td>21,55</td>
			<td>0,24</td>
			<td>1</td>
			<td>750.31</td></tr></tbody></table>güçlü >
		
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>31,1</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	

Tablo 8: Negatif denetimleri (adım 7.1.5.) üzerinde pozitif denetimler zenginleştirme hesaplanması.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq at JoVE.com

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Tahlil Transposase erişilebilir yüksek üretilen iş sıralama (ataç-seq) ile birleştiğinde Kromatin için erişilebilir Kromatin ortaya çıkarmak için genom geniş bir yöntemdir. Bu bir adım adım ataç-seq insan lenfosit (Th1/Th2) için en iyi duruma getirilmiş son hesaplama çözümleme moleküler üzerinden iletişim kuralıdır. Bu iletişim kuralı yeni nesil sıralama yöntemleri deneyiminiz olmadan araştırmacılar tarafından kabul edilebilir.

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

mapping-genome-wide-accessible-chromatin-primary-human-t-lymphocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

17.9K Görüntüleme.  Bar-Ilan University. Tahlil Transposase erişilebilir yüksek üretilen iş sıralama (ataç-seq) ile birleştiğinde Kromatin için erişilebilir Kromatin ortaya çıkarmak için genom geniş bir yöntemdir. Bu bir adım adım ataç-seq insan lenfosit (Th1/Th2) için en iyi duruma getirilmiş son hesaplama çözümleme moleküler üzerinden iletişim kuralıdır. Bu iletişim kuralı yeni nesil sıralama yöntemleri deneyiminiz olmadan araştırmacılar tarafından kabul edilebilir.

Video: Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genetik

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible chromatin. In this paper we present an improved ATAC-seq protocol that reduces contaminating mitochondrial DNA reads. While previous ATAC-seq protocols have struggled with an average of 50% contaminating mitochondrial DNA reads, the optimized&#160;lysis buffer introduced in this protocol reduces mitochondrial DNA contamination to an average of 3%. This improved ATAC-seq protocol allows for a near 50% reduction in the sequencing cost. We demonstrate how these high-quality ATAC-seq libraries can be prepared from activated CD4+ lymphocytes, providing step-by-step instructions from CD4+ lymphocyte isolation from whole blood through data analysis. This improved ATAC-seq protocol has been validated in a wide range of cell types and will be of immediate use to researchers studying chromatin accessibility.

Here, we present a protocol to perform an assay for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) on activated CD4+ human lymphocytes. The protocol has been modified to minimize contaminating mitochondrial DNA reads from 50% to 3% through the introduction of a new lysis buffer.