Diese Arbeit wurde durch einen V Scholar Award (V2014-004) und ein Gelehrter V plus Award (D2016-030) von der V Foundation for Cancer Research und eine amerikanische Krebs Gesellschaft institutionelle Research Grant (ACS IRG Grant 58-006-53) an der Purdue University Center für Krebs unterstützt. Forschung. E. G. P. wurde von der Borch Graduate Endowment Award an der Purdue University medizinische Chemie und Molekulare Pharmakologie Abteilung unterstützt.

1. Vorbereitungen <ol><li>vorbereiten 100 mL Hypotonische Lösung Puffer A: 0,3 M Saccharose, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, und 0,5 % NP-40. Bei 4 º c. 
	Hinweis: Einige Zelllinien, wie HEK293T, erfordern weniger strenge Lysiereinrichtung Auflagen. Wenn Kerne leicht lösen, benutzen Sie geändert Puffer A: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA 0,1 % NP-40 und 10 % Glycerin.</li>
	<li>Bereiten eine 250 mL Stammlösung 2 X mRIPA Lösung: 100 mM Tris pH 8.0, 2 % NP-40 und 0,5 % Natrium-Deoxycholate.</li>
	<li>Bereiten eine 100 mL Stammlösung 5 M NaCl.</li>
	<li>Mit 2 X mRIPA und 5 M NaCl-Lösungen, 50 mL 1 X mRIPA-Lösung für jede der sechs Salzkonzentrationen vorbereiten: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM und 500 mM NaCl. Vor Beginn des Experiments, alle Lösungen auf Ice cool</li>
	<li>Grow Zellinien gewünschten Bedingungen. 
	Hinweis: Wenn Sie die Auswirkungen der umzuwerfen eines Proteins zu bestimmen, muss SSE für die Knockdown Linie mit Wildtyp-Zellen verglichen werden. Diese SSE muss nebeneinander durchgeführt werden. Für Beispiele für die Verwendung von chemischen Inhibitoren oder Reize, siehe Abschnitte 3-5.</li>
</ol> 2. Grundlegenden sequenzielle Salzgewinnung <ol><li>Ernte 8 Millionen Zellen der einzelnen Zustand und zweimal mit 5 mL Eis kaltem PBS waschen. 
	Hinweis: Es ist entscheidend für die gleiche Anzahl von Zellen zu entsprechenden Proteinkonzentrationen haben. Die genaue Anzahl der Zellen müssen für die einzelnen Zell-Linien oder bestimmte Proteine optimiert werden. Es ist wichtig, nicht zu viele, da der Anstieg der Proteinkonzentrationen Beobachtung der Elution Kurve, verhindert das Gleichgewicht Bindung abhängt. Jedoch mit zu wenig Zellen möglicherweise nicht genügend Protein um die Kurve zu erkennen und das Chromatin-Pellet ist schwieriger zu isolieren und verloren zwischen Brüchen.</li>
	<li>Wieder aussetzen Zellen in 1 mL Puffer A + Protease-Inhibitoren, transfer in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren und drehen oben über Boden bei 4 ° c für 10 min.</li>
	<li>Isolieren die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g für 5 min bei 4 ° c. 
	Hinweis: Nach diesem Schritt sollte die Kernhülle noch intakt sein. Wenn die Kernhülle intakt ist, wird das Pellet vollständig neu aussetzen; jedoch wird wenn der Umschlag lysiert und das Chromatin wird freigegeben, das Pellet nicht erneut aussetzen. Wenn die Kernhülle nach Puffer A Inkubation nicht intakt ist, verwenden Sie modifiziert Puffer A.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Kerne Pellet vor Aussetzung neu Pellet. 15-Mal mit einer 1-mL-Pipette pipettieren, um jede Probe zu homogenisieren. Das Pellet sollten leicht wieder auszusetzen, jedoch wird die Kerne lösen, wie es Pipettieren ist und die Probe wird dick und klebrig und schwer zu pipette.
	<ol><li>Um das Pellet in der Spitze aufzustellen, tippen am Ende die Pipettenspitze gegen die Unterseite des die Zentrifugenröhrchen. Das Pellet wird nicht vollständig auflösen, sobald die DNA wird aus den Kernen entlassen, aber Pipettieren bricht es auf</li>
	</ol></li> <li>Wenn alle Proben homogenisiert worden sind, brüten die Proben auf Eis für 3 min. 
	Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach Protein des Interesses optimiert werden müssen.</li>
	<li>Isolieren Chromatin Pellet durch Zentrifugieren die Proben für 3 min bei 6500 X g bei 4 º c.</li>
	<li>Transfer überstand zu einer Zentrifuge sauber 1,5 mL Tube. Dies wird die Fraktion 0 mM sein. Diese 0 mM mRIPA Lösung kann fungieren als ein Waschschritt zur Lyse der Kerne und entfernen Sie alle losen Proteine nicht im Zusammenhang mit Chromatin.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Chromatin Pellet vor Aussetzung neu Pellet. Unterteilen Sie das Chromatin Pellet durch pipettieren die Kugel nach oben und unten 15 Mal. 
	Hinweis: Es ist entscheidend für die Anzahl der Wiederholungen entsprechen die Pellet in pipettiert.</li>
	<li>Inkubation für 3 min auf Eis. Diese Inkubationsschritt kann alle Proben einen Gleichgewichtszustand zu erreichen, was besonders wichtig ist, gibt es mehrere Proben.</li>
	<li>Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>Wiederholen Sie 2,6-2.10 für die verbleibenden Salzkonzentrationen. 
	Hinweis: Nach 400 mM NaCl, mRIPA das Pellet sollte klar und glitschige und bleibe nicht am Boden des Röhrchens. Das Pellet in den Deckel des Zentrifugenröhrchen während des Überstands isoliert platziert werden kann.</li>
	<li>Hinzufügen 70 µL 4 x Protein laden färben, jede Fraktion und laden Sie 30 µL der einzelnen Fraktionen auf ein SDS-Acrylamid-Gel für die western-Blot Analyse. 
	Hinweis: Um das verbindliche Profil des Proteins zu bestimmen, ist es wichtig, entsprechende Mengen an lysate, anstatt be-gleich Proteinkonzentrationen laden.</li>
	<li>Führen Sie eine standard-western-Blot durch die Übertragung auf eine Membran und primären Antikörper für interessierender Proteine.</li>
	<li>, Das Protein aus dem Chromatin eluiert quantitate inkubieren der Blot in Infrarot-Fluoreszenz IRDye Sekundärantikörper und Bild Blot mit einem Imager. Während andere Methoden der Entwicklung verwendet werden können, empfehlen wir Fluoreszenz oder Infrarot-Bildgebung, wie es in der Natur mehr quantitative.</li>
	<li>Einsatz ImageJ oder ähnliche Software zu berechnen, die Intensität für das Protein an jede Salzkonzentration eluiert. Durch die grafische Darstellung der Band Intensität gegen die Salzkonzentration, die Elution Muster von Ihr Protein des Interesses bestimmt werden kann.</li>
</ol> 3. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein &#34; Leser &#34; Inhibitor <ol><li>zwei Gruppen von Zellen (4 Millionen) zu ernten und isolieren die Kerne wie in einem standard SSE.</li>
	<li>Wieder auszusetzen, beide in 200 µL mRIPA 0 mM NaCl und 3 min inkubieren. Dadurch wird für die Entfernung von jedem kostenlos Protein in den Kernen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl, jedes Pellet. Hinzufügen der Steuerelementsatz Inhibitor (2 µL 1 mm (+) JQ1) zu einer Probe oder DMSO.</li>
	<li>Rühren die Pellets durch Pipettieren 15mal und inkubieren Sie für 5 min auf Eis</li>
	<li>Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>3.3-4 für die Salzkonzentrationen wiederholen und führen Sie eine standard-western-Blot.</li>
</ol> 4. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein &#34; Schriftsteller &#34; Inhibitor <ol><li>Zellen mit dem Inhibitor (10 µM SAHA) zu behandeln oder DMSO für 3 h</li>
	<li>Ernte 4 Millionen Zellen für jede Behandlung.</li>
	<li>Führen ein standard SSE für die Proben mit dem Inhibitor hinzugefügt, um die Puffer.</li>
</ol> 5. Sequentielle Extraktion folgende DNA Salzschäden <ol><li>Behandlung von Zellen mit 1 µM Doxorubicin für 1 h.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium auf die Zellen und lassen sie wieder für 3 h.</li>
	<li>8 Millionen Zellen zu ernten, und führen Sie die grundlegenden SSE.</li>
</ol> 6. Nicht-sequenziellen Salzgewinnung <ol><li>12 Millionen Zellen ernten und waschen mit PBS.</li>
	<li>Kluft Zellen, so dass es 2 Millionen Zellen pro Mikro Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Neu in 500 µL Puffer A und 10 min. inkubieren</li>
	<li>Isolieren Sie die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g.</li>
	<li>In 200 µL der einzelnen mRIPA Puffer + NaCl pellets wieder auszusetzen.</li>
	<li>Homogenisieren jede Probe durch Pipettieren 15-Mal mit einer Pipettenspitze 1 mL.</li>
	<li>Inkubation auf Eis für 3 min.</li>
	<li>Isolieren das Chromatin durch Zentrifugation bei 6500 X g und übertragen den Überstand um Rohre zu reinigen. Hinzufügen von 70 µL Farbstoff zu laden und ausführen 30 µL auf einem SDS-Page-Gel für die western-Blot Analyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. 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J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Charakterisierung von Protein und Chromatin-Interaktionen durch Salz Extraktionen ist eine gängige Methode, die beschäftigt war für Jahrzehnte14,15; jedoch wurde es nicht systematisch vor optimiert, um den vollen Nutzen zu offenbaren. Wir zeigen, wie diese sequenziellen Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Veränderungen im Chromatin Bindung zu unterscheiden, wenn das Protein oder die Umwelt geändert wird. SSE ist sehr anpassungsfäh...

DNA-Verordnung in eukaryotischen Zellen ist eine komplizierte und anspruchsvolle System, die durch ein Sortiment von Proteinen hochstrukturiert ist, die Antworten auf die intrazelluläre und extrazelluläre Stimuli zu koordinieren. DNA ist Histon Octamers zur Form Nukleosomen, gewickelt, lose verteilt entlang DNA oder in engen Spulen1verdichtet werden können. Diese strukturelle Anordnung der DNA und Histonen bekannt als Chromatin, die durch ein Netz von Proteinen, die lesen, schreiben und löschen Post translationale Modifikationen (PTM) auf Histone2geregelt ist. Einige Histon PTMs, wie Acetylierung, ändern die Ladung der Aminosäure, die sie auf, abgelagert werden Wechselwirkungen zwischen Histonen und DNA-2zu verändern. Histon-PTMs dienen auch zur transkriptionellen Regulierungsbehörden, Chromatin Remodelers, DNA-Schäden reparieren Maschinen und DNA-Replikation Maschinen auf bestimmte Regionen des Genoms3zu rekrutieren.
Die meisten Methoden zur Untersuchung Chromatin Wechselwirkungen Sonde kleinen Interaktionen oder große genomweite Analysen beinhalten. In Vitro Bindung Studien nutzen oft einzelne rekombinante Domains mit Histon-Peptide oder DNA in Tests wie Elektrophorese Mobilität Verschiebung Assays (EMSA), Isotherm Titration Kalorimetrie, Fluoreszenz-Polarisation und Peptid Pulldowns. Da diese Tests in der Regel auf eine einzelne Protein-Domäne konzentrieren, sie erleichtern das Verständnis von einem kleinen Stück des Puzzles, aber lassen Sie sich nicht uns zu verstehen, die kooperative Art der multidomain Proteine, geschweige denn ihre Rolle in Multi-protein -komplexe. Eine weitere Schicht der Komplexität wird durch die heterogene Zusammensetzung der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe hinzugefügt. Diese Heterogenität Protein macht in Kombination mit der dynamischen Natur der Chromatin-Landschaft, eine Herausforderung, um die in Vivo an Chromatin in VitroInteraktionen der Chromatin Proteine binden zu rekapitulieren.
In-Vivo -Methoden haben bedeutende Fortschritte gemacht; Allerdings sind sie oft teuer, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll. Chromatin Immunopräzipitation gefolgt durch Sequenzierung (ChIP-Seq) ist sehr nützlich für die Bestimmung der Lokalisierung von Proteinen und Histon-Modifikationen in das Genom, aber es erhebliche Optimierung4 erfordert. Proteine sind oft vernetzt, Chromatin, Interaktionen zu bewahren; Allerdings können künstliche Interaktionen produzieren und kann dazu führen, dass Epitop Maskierung5. Darüber hinaus erfordern die Immunperoxidase (IP) hochspezifische Antikörper und umfassende Optimierung von DNA zu scheren und IP-Bedingungen von ChIP-qPCR mit einer bekannten Bindungsstelle, die oft nicht verfügbar- a-prioriist. Nach der Optimierung von ChIP Bedingungen Verarbeitung der Proben ist aufwändig und erfordert mehrere Wochen bis Monate, zu sequenzieren und analysieren. Obwohl dieses Verfahren von unschätzbarem Wert für die Ermittlung der Lokalisierung von Chromatin Proteine gebunden über das Genom, die Kosten und Zeitaufwand machen es unerschwinglich zur Verwendung dieser Methode zum Generieren von Hypothesen darüber, wie kleine Veränderungen globalen Bindungseigenschaften beeinflussen kann .
In diesem Artikel beschreiben wir wie ein sequentielle Salzgewinnung (SSE) Assay verwendet werden kann, global verbindliche Profile von Chromatin-gebundene Proteine untersuchen und unterscheiden, wie Änderungen in einem Protein, komplexe oder globale PTM Profil Interaktionen verändern können. Obwohl Salz Extraktionen allgemein und allgemein verwendete Technik sind, zeigen wir, wie diese sequenziellen Methode äußerst reproduzierbare und vielseitig ist. SSE erlaubt uns zu charakterisieren, wie eine einzelne Untereinheit eines Komplexes oder sogar einer einzelnen Domäne, die Anlage insgesamt Affinität für Schüttgut Chromatin beiträgt. SSE kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob die Bindung eines Proteins ist beeinflusst durch Änderungen im Chromatin Landschaft, bietet interessante Hypothesen für Histon Mark targeting, die mittels ChIP-Seq und andere Genom breite Studien bestätigt werden können.
Wir ursprünglich diese Methode von Wu Et Al., prüfen der Funktion des Polybromo1 angepasst (PBRM1) in der Bindung der PBAF Chromatin Fertighausbau6,7. Mit dieser Technik, wir die Rolle des PBRM1 für Chromatin Bindung innerhalb der PBAF Chromatin Umbau komplexer und dann bestimmt den relative Beitrag der sechs einzelnen Bromodomänen zu dieser Funktion7.
Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode, um Chromatin Bindung in verschiedene Zelltypen zu beurteilen, die relative Bindungsaffinität von ähnlichen Chromatin bearbeiten komplexe, untersuchen die Verschiebung eines Proteins aus Chromatin durch einen chemischen Inhibitors erkunden zu optimieren und Ermittlung die Auswirkungen von Chromatin Bindung nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Aufklärung der Bindungseigenschaften von Chromatin-targeting Proteinen kann aufgrund der komplexen Natur des Chromatins und der heterogenen Natur der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe sehr anspruchsvoll sein. Um diese Hürden zu überwinden, haben wir einen sequenzielle Salzgewinnung (SSE) Assay für die Bewertung der relativen verbindliche Affinitäten der Chromatin-gebundene komplexe angepasst. Dieser Assay einfach und unkompliziert einsetzbar von nicht-Experten bewerten die relative Differenz verbindliche Affinität von zwei verwandte komplexe, die Veränderungen in Affinität eines Komplexes als eine Untereinheit verloren ist oder eine einzelnen Domäne wird inaktiviert und die Veränderung der Bindungsaffinität nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft. Durch das nacheinander wieder aufhängen Bulk Chromatin in steigenden Mengen von Salz, können wir die Elution eines bestimmten Proteins aus Chromatin Profil. Diese Profile können wir bestimmen, wie Änderungen in einem Chromatin-modifizierende komplex oder Änderungen an der Chromatin-Umwelt bindender Wechselwirkungen auswirken. Kupplung SSE mit anderen Tests in Vitro und in Vivo , bestimmen wir die Rollen der einzelnen Domänen und Proteinen auf die Funktionalität eines Komplexes in einer Vielzahl von Chromatin-Umgebungen.

In diesem Beitrag zeigen wir die Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der häufig verwendeten sequentielle Salzgewinnung (SSE) Methode, die wir aus der Literatur6angepasst haben. In Abbildung 1vergleichen wir die Reproduzierbarkeit der SSE, Proteine nicht sequenziell zu kassieren, indem die Elution Muster von ARID1a und PBRM1 zu erkennen. Wir beobachten immer wieder, dass ARID1a, BAF-Untereinheit elutes in erster Linie bei 200 mM NaCl...

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K Aufrufe.  Purdue University. Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Serie: Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Forschung

Genetik

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly defined states of chromatin organization. The dynamic architecture of the nucleus is controlled by multiple mechanisms and shapes the transcriptional output programs. It is, therefore, important to determine locus-specific chromatin accessibility in a reliable fashion that is preferably independent from antibodies, which can be a potentially confounding source of experimental variability. Chromatin accessibility can be measured by various methods, including the Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) assay, that allow the determination of general chromatin accessibility in a relatively low number of cells. Here we describe a FAIRE protocol that allows simple, reliable, and fast identification of genomic regions with a low protein occupancy. In this method, the DNA is covalently bound to the chromatin proteins using formaldehyde as a crosslinking agent and sheared to small pieces. The free DNA is afterwards enriched using phenol:chloroform extraction. The ratio of free DNA is determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or DNA sequencing (DNA-seq) compared to a control sample representing total DNA. The regions with a looser chromatin structure are enriched in the free DNA sample, thus allowing the identification of genomic regions with lower chromatin compaction.

The plasticity of nuclear architecture is controlled by dynamic epigenetic mechanisms including non-coding RNAs, DNA methylation, nucleosome repositioning as well as histone composition and modification. Here we describe a Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) protocol which allows the determination of chromatin accessibility in a reproducible, inexpensive, and straightforward manner.

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...