Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. Çözelti Hazırlanması ve çekti Cam İğne <ol><li> 20 mM Tris pH 8.8 içinde 4 mg / mL Tricaine (3-amino-benzoik asit etil ester, aynı zamanda adı etil 3-aminobenzoat) içindeki bir 25x stok çözeltisi yapmak ve bu çözelti, pH 4 mL mağaza tarafından 7. kısım en getirmek -20 ° C. NOT: anestetik Tricaine böylece kas seğirmesi ve hareketi 6 engelleme nöral voltaj bağımlı sodyum kanalları tercihen hareket eder. </li><li> E3 embriyo ortam içinde 0.17 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda Tricaine bir çalışma çözeltisi yapın. 7 NOT: Bu çözeltinin pH değeri sürüklenir olarak hazırlıksız bir şekilde çalışma çözeltisi Tricaine sağlayın. </li><li> Bir mikrodalga fırında çözelti ısıtılarak 50 ml bir tüp içinde E3 embriyo ortamı içinde% 1.5 bir son konsantrasyona kadar düşük erime noktası agaroz eritilir. bir su banyosu ya da tezgah üstü inkübatör ya 45 ° C - bu çözüm 42 muvazene edelim. Dikey için büyük yemekleri hazırlarken eğerIşık sayfalık görüntüleme (adım 4), agaroz E3 embriyo orta% 1 standart erime ek 25 ml yapmak. </li><li> OD 1.20 mm, ID 0.69 mm, uzunluğu 10 mm boyutları ile filaman kılcal damarlar ile borosilikat camını kullanın. </li><li> Keskin forseps bir çift ile Velocity 50, Zaman 225, Basınç 500. 120 çekin, Isı 600, break: kılcal damar Ekipman ve Kimyasalları, aşağıdaki ayarları kullanın Tablo açıklanan ısıtma filament iğne çektirmesi türüne çekilirse sadece noktadan iğne hangi o embriyolar yönlendirici ve aşırı agaroz kaldırmak için temiz ve keskin iğne oluşturmak için esner. Bir mikro-neşter ayrıca aşırı agaroz kaldırmak için kullanılabilir. </li></ol> Ters çevrilmiş veya Dikey Mikroskopi için Embriyolar 2. gömülmesi <ol><li> E3 embriyo orta uygun aşamaya embriyolar yükseltmek. 7 </li><li> binoküler dissec altında keskin forseps bir çift ile gerekli aşamada, dechorionate embriyolarting mikroskop. </li><li> Tricaine çözelti içinde en az 5 dakika boyunca dechorionated embriyolar inkübe edin. </li><li> erimiş agaroz çözelti, 45 ° C&#39;ye soğuduktan sonra, E3 orta minimum transfer 50 ml tüp içine doğrudan dechorionated embriyo transferi için bir cam Pasteur pipet kullanın. </li><li> orta montaj yaklaşık 1 ml ile embriyo çıkarın ve yak. 10 mm kuyucuklarda ile 35 mm cam tabanlı petri merkezi daire embriyo ile birlikte montaj orta 100 ul. </li><li> Montaj orta ayar gibi, dışa doğru (Şekil 1A) bakan kuyruğu ile agaroz çemberin kenarına embriyo taşıyın. Jel tamamen ayarlanana kadar istenilen yanal yönde embriyo korumak için kılcal iğne kullanın. görüntü arka gövde gelişimine, mümkün olduğunca yan bir yönde embriyo yönlendirmek için özen gösterin. Bu nedenle, dikkat Farkları bu pozisyonda embriyo muhafazaKılcal iğne ile ts. Not: gerekirse birden çok embriyo, bu noktada monte kaba ilave edilebilir. Bu durumda, ilk çanak içine agaroz düşük eritebilir aktarmak ve agaroz damla merkezine embriyolar ekleyin. Ardından, cam yüzük kenarlarına embriyoların dışarı itmek ve istenilen pozisyona yolunuzu. Altı embriyolar kadar Agaroz katılaşmış olur önce bu şekilde monte edilebilir. </li></ol> Arka Gövde Çevresi Fazla Agaroz 3. Kaldırma NOT: Bu kısım agaroz arka gövde çevresindeki bölge uzaklaştırılır prosedür açıklanmaktadır. Posterior vücut uzama durumunda, kuyruk büyümek-out normalde sağlamak için önemlidir. Embriyo tamamen agaroz ile dahil edildikten sonra agaroz kaldırarak, embriyo baş bölgesi ve yumurta sarısının yaklaşık yarısı tarafından kapalı bırakılır. <ol><li> Agaroz açılan donduktan sonra, petri di selTricaine çözelti ile sh. </li><li> iletilen ışık tabanı ile diseksiyon binoküler mikroskop altında, güçlü bir kontrast çalışması yoluyla açıkça görülebilir agaroz kesimler için izin veren şekilde ayna konumunu ve gelen ışığın açısını ayarlamak. </li><li> Kesme gerçekleştirmek için 1 (Şekil 1), sadece hücre gruplarının 5 (5. pozisyonuna oluşturucu kalp alanına posterior pozisyonda sarısı üzerinde agaroz orta yol kesmek için Kılcal iğne veya mikro-neşter kullanmak ön somite). </li><li> gösterildiği gibi şekillendirme kalbe komşu ilk kesim ve cama agaroz üzerinden tam bir şekilde başlayın. </li><li> Yukarı gördüm ve Şekil 1 gösterildiği gibi embriyo üzerinde uzun bir kesim yapmak için başlayan ederken aşağı yavaşça derin agaroz içinde kılcal veya mikro-neşter tutmak ve. embriyo ya da yumurta sarısı delmeden mümkün olduğunca embriyo yakın kesti. </li><li> Daha sonra, hale kesikler 2 ve 3 (Şekil 1 </strong&gt;), Embriyo karşı konumundan ve cam tüm yol aşağı gidiş kesim ile başlayan dipli çanak. ilk 5 Somitlerin teğet olacak şekilde arka gövdesinin tamamen ortaya dorsalward için izin, 2 kesim yapın. sarısı yüzeyi ile 90 ° açıyla 3 kesilir ve Heartfield&#39;le başlayarak olun. Not: tam blok (adım 3.6) halinde agaroz giderilmesinde yardımcı (Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi), cam dairenin kenarında kadar agaroz kesilmesi. Ancak, bu gerekli değildir. </li><li> kesikler 1 ve 3 kesiştiği noktada başlayarak, yavaş yavaş arka gövdesini çevreleyen agaroz kare çıkarmak için yukarı doğru kaldırarak ederken kesim 2 sonuna doğru yavaş bir çapraz kesim yapmak. Notlar: Bazı durumlarda, bu tek bir blok çıkacak ve işlem bir hareket içinde tamamlanır. Diğerlerinde, bu dis-lodge embriyoyu çevreleyen tüm agaroz birkaç deneme alabilir. </li><li> Keskin forseps bir çift ile, yerinden b kaldırmakEmbriyo ortamından agaroz kilitler. Bu süreçte yardımcı yemeğin yanına agaroz parçaları taşımak ve agaroz parçaları kaldırarak ederken destek olarak petri duvarını kullanmak için. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Şekil 1: Montaj Set-up Diyagramları. (A) Diyagram, bir petri çanağı içinde merkezi bir cam halka içinde monte edilen embriyo konumunu göstermektedir. Sağ tarafta agaroz dottted kırmızı çizgilerle gösterilen çevreleyen yoluyla birbirini izleyen kesim ile embriyo bir zoom. (B) monte embriyolar hem ters ve dik hedefleri için erişim kolaylığı göstererek yan görünümde diagrammed olduğunu. (C) embriyolar dikey ışık levha görüntüleme set-up için monte edilebilir gösteren benzer bir digram. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">cl Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya ick. <ol start="9"><li> kas seğirmesi tam bu noktada bloke değilse, 4 mg / ml, pH 7 stok çözeltisinden Tricaine damla ekleyin. </li></ol> 4. Dikey Işık sayfalık Mikroskopi için Embriyolar montajı NOT: Bu yukarıda özetlenen yönteme bir varyasyon dikey odaklı SPIM tarafından örneklerin görüntüleme için birden hedeflerin erişim sağlar olduğunu. Bu varyasyon arkasındaki fikir, iki görüntüleme hedeflerinin kolay erişim sağlamak için, çanak alt biraz daha yüksek örnek asansör etmektir. <ol><li> montaj örneği önce, kaplama 5 mm bir yüksekliğe E3 ortam içinde% 1 agaroz ile 100 mm&#39;lik bir plastik Petri tabağı ve set sağlar. </li><li> çanağın merkezine 1 mi, düşük erime noktasına sahip agaroz bir damla yerleştirin ve ayarlamak için olanak sağlar. </li><li> Ancak bölüm 2&#39;de gibi düşük erime noktalı agaroz yerleştirme embriyolar, bu kez 50 ml tüp embriyo kaldırmakagaroz çözeltisi (0.5 mi) daha küçük bir damla ve çanağın ortasında açılan ml 1 üstünde, bu küçük bir damla yerleştirin. </li><li> küçük bir damla merkezinde embriyo yerleştirin ve jel set kadar onun doğru yönünü korumak için kılcal iğne kullanın. </li><li> Tricaine çalışma solüsyonu ile çanak sel ve 3. bölümde olduğu gibi ancak% 1 standart agaroz yastık yoluyla kesmeden aşırı agaroz çıkarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu montaj tekniği embriyoların mikroskop ve çoklu uzunluk ölçeklerinde arka gövde uzama aşağıdaki amaçlayan üzerinde uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme deneyleri transferi sırasında hareketsiz tutulması sağlar. her iki dik olarak ters çevrilmiş mikroskop set up üzerinde görüntüleme sağlar ve bir öneri, bu daha dikey yönlendirilmiş SPIM uyarlanabilir nasıl yapılması ile Ayrıca, çok yönlüdür. Bu protokol kritik bir adım, bu yapının normal gelişimini sağlayan önemli olan arka gövdesini çevreleyen aşırı agaroz dikkatli çıkarılmasıdır. Sarısı üst etrafında agaroz çıkarmadan, özellikle embriyo zarar değil burada dikkat çekmek için önemlidir. bazen bu işlem sırasında kalıp embriyo kaybetmek mümkün olduğu gibi, embriyo etrafında kesilmiş agaroz blok sökerken Buna ek olarak, dikkat edilmelidir. Bu nedenlerden dolayı, bu düşük verimli bir yöntem that aksine önce 3D baskılı plastik kalıp yöntemleri kullanarak geçme için, aynı anda çok sayıda zebra balığı embriyoların montajı için uygun değildir. 8, 9 Ancak embriyolar bu montaj yöntemi ile son derece kararlı olan ve bu nedenle çok daha kolay mikroskop nakledilebilir ve arka vücut uzama boyunca 3B yönünü korur. Diğer önemli adım herhangi bir antero-posterior veya dorso-ventral tilt kaçınarak, embriyonun ilk yanal yönde doğruluğu. Ya eğim daha fazla analiz için görüş en uygun açı arka gövde uzantısı, lateral vizyon engel olacaktır. ön-arka eğim arka vücutta ilave sonucunda yüksek z yığınlar ve daha düşük zaman çözünürlüğü ile böylece zaman ihmaller edinilmesini anlamına gelecektir yatay düzleme, göre aşağı yukarı büyüyen ya da olacak. Bu yöntem, ziyaretinde birrsatile ve Fucci hattı 5, 10 kullanımı yanı sıra çok skaler morfometrik analizi gibi hücre bölünmesi oranlarının görüntüleme için izin verdi. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, 5 Ancak arka gövdesi ekseninin uzama sırasında tailbud dramatik genel değiştirmesine verilen, sadece nispeten düşük büyütme amaçları gibi tüm süreci yakalamak için kullanılabilir. Edinimi 4 saat (Video Şekil 1) - ilgilenilen bölgede daha yüksek büyütme sonuçları 3 içinde görüş alanını terk olmasıdır. Bu nedenle, daha fazla tailbud görüntülenmesinde geliştirmek için tek yönlü tailbud genel hareketini izlemek ve satın alma sırasında mikroskop sahne x, y, z konumunu ayarlayabilirsiniz otomatik izleme algoritması sahip olmaktır. Burada tarif edilen montaj yöntemi ile tüm eksenel boyutta embriyo artan kararlılık göz önüne alındığında, bu açık olmalıdırBöyle bir yaklaşım.

Arka gövde uzama embriyo vücut eksenine büyük bir kısmını oluşturmak üzere uzandığı tarafından embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Bu, birden fazla hücre davranışları Bireysel dokular düzeyinde morfonogenezi oluşturmak için koordineli hareket hangi kompleks morfogenetik işlemin örneğidir. Bu diferansiyel doku deformasyonları sonra bütün yapı düzeyinde posterior vücudun uzamasını oluşturmak için birlikte hareket. Bu süreçler kontrollü ve gelişme sırasında koordine nasıl anlamak için, (moleküller, hücreler, hücre popülasyonlarının ve dokuların düzeyinde yani), birden ölçeklerde bu süreçleri takip etmek gerekir ve tüm yapının morfonogenezi doğrudan ilişkilendirmek için . optik şeffaflık ve küçük boyutlu minimal invaziv ışık görüntüleme uygulaması için izin verdiği Zebra balığı embriyolar liv için uygundur yaklaşımlar görüntüleme arka gövde uzaması için idealdire görüntüleme. 1 Bu moleküllerin seviyesinde arka gövde gelişimi üzerine ışık tutmuştur son yayınların bir dizi kanıtlanmıştır, 2 adet tek kişilik hücreler, 4 yanı sıra hücre popülasyonu ve tüm organ seviyesinde 3 ve inter-doku davranışları. 5 Böyle konfokal, çoklu foton mikroskopi ve seçici düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) gibi gelişmiş görüntüleme teknikleri hafif toksisite ve fotoğraf ağartma etkisini azalan gelişim süreçleri uzun vadeli görüntüleme sağlayan vardır. Canlı örneklerin montajı için sağlam teknikler üç hedeflere ulaşmak için gerekli olan: 1) Yeterli destek mikroskop ve satın alma sırasında nakil sırasında doğru yönde örnekleri korumak için, 2) numune hareketinin yeterli özgürlüğü büyümesi için izin vermek için normal devel etkilemeden arka vücut bölgesiopment ve nihayet 3) montaj yönteminin çok yönlülüğü içinde belirli bir dereceye kadar farklı görüntüleme set-up üzerinde görüntüleme izin vermek. Bu protokol zebrabalıkları D. rerio gelişimini görüntüleme için bir montaj tekniği tanıttı. Bu teknik uzatmak ve normalde geliştirmek için arka gövde bölgeyi terk ederken baş ve yolk kesesi bölgeleri neredeyse tamamen, agaroz dahildir şekilde embriyoların montaj içerir. Bu şekilde, aynı zamanda, agaroz, standart ışık görüntüleme teknikleriyle sokulmuşlardır gelişmekte vücudun diğer bölgelerinde uzun süreli görüntüleme için uygun bir yöntemdir. değiştirici yönlerde embriyolar monte edilmesi de mümkündür, ancak bu protokol, bir yanal yönde embriyoların monte gösterir. Ayrıca, dik ters ve dikey ışık sayfalık mikroskobu kurulumları yöntemi uyarlamak nasıl gösterecektir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

Zebra balığı embriyolar nedeniyle erişilebilirlik ve optik şeffaflık kolaylığı karmaşık morfogenetik süreçleri incelemek için ideal bir deneysel sistem sunuyoruz. Özellikle, arka gövde uzama çoklu doku deformasyonları vücut ekseninin büyük bir kısmı oluşumunu yönlendirmek için birlikte hareket hangi embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Uzun vadeli time-lapse görüntüleme ile bu süreci gözlemlemek için yeterli destek mikroskop ve iktisap transferi sırasında doğru yönde örnekleri korumak için izin veren bir montaj tekniği kullanmak gerekir. Buna ek olarak, montaj aynı zamanda normal gelişimini etkilemeden arka gövde bölgenin büyümesi için yeterli hareket özgürlüğü sağlamak zorundadır. Son olarak, çeşitli görüntüleme set-up üzerinde görüntüleme izin montaj yönteminin çok yönlülüğü de belirli bir ölçüde olması gerekir. Burada, arka gövde elongatio gelişimini görüntüleme için bir montaj tekniği sunmakn Zebra balığı D. rerio içinde. Bu teknik uzatmak ve normalde geliştirmek için arka gövde bölgeyi dışarı çıkarken, baş ve yolk kesesi bölgeleri neredeyse tamamen agaroz dahildir şekilde embriyoların montaj içerir. Biz bu dik, ters ve dikey ışık sayfalık mikroskopisi set-up için adapte edilebilir gösterecektir. Bu protokol posterior vücut için görüntüleme için embriyolar montaj odaklanırken, kolayca zebrabalıkları gelişmenin birden yönlerini canlı görüntüleme için adapte edilebilir.

Yukarıda özetlenen protokol uzun vadeli time lapse görüntüleme için zebra balığı embriyolarının montajı için çok yönlü bir teknik ayrıntıları. Bunun bir örneği, Şekil 2A ve / görüntü, Şekil 1 &#39;animasyon gösterilir. Embriyolar mRNA photoconvertible floresan protein kikumeGR kodlayan 1 hücre aşamasında enjekte edilmiştir. 10X objektif bir ters konfokal mikroskop, yukarıda tarif edilen ve 12 saat boyunca görüntülenmiş olarak 15 hücre gruplarının aşamasında da monte edilmiştir. gösterildiği gibi ortaya çıkan konfokal yığınları maksimum görüntülenecek tahmin edildi. Bu film açık arka vücut film süresince serbest hareket edebilen ve normal kültür koşullarında serbestçe koryon gelişmeye bırakıldı embriyolar görülen morfolojik içindeki değişiklikleri gösterir olduğunu gösterir. Ek bir örnek olarak F ŞEKIL 2B&#39;de gösterilmiştirve hareketli / video Şekil 2. Burada, embriyolar histon 2B mCherry proteini (yani çekirdek etiketler) ve EGFP kodlayan mRNA&#39;ların kombinasyonu ile 16 hücre aşamasında enjekte edilmiştir: CAAX kutusu (yani zarların etiketler; detayları referans için bakınız 5). Şekil 1B diagrammed Onlar daha sonra suya daldırma 25X amacı ile dik bir multiphoton mikroskop görüntülendi. Çıkan tailbud oluşumu sırasında hücresel davranışları görselleştirmek için 10 hücre gruplarının aşamasından 3 saat alınmıştır. Hücreler normalde tailbud formları gibi aktif çıkıntıları ve yön hareketleri getirici görülebilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig2.jpg" /> Şekil 2: 10 x büyütme Arka Gövde Uzama Time-lapse Görüntüleme örnekleri. (A) Ardışık kareeksenel uzama sürecini kapsayan temsili bir film. Embriyolar resmin sağ tarafına posterior lateral görünümde gösterilir. (B) tailbud oluşumu sırasında bireysel hücre davranışlarını gösteren bir yüksek büyütme film ardışık çerçeveler. Embriyolar sağa posterior lateral görünümde gösterilir. Noktalı çizgiler oluşturan tailbud özetlemektedir. Küçük renkli çizgiler çekirdeklerin parçaları tek tek hücre hareketlerini takip etmek göstermektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210video1.jpg" /> Animasyon / Video Şekil 1: Bir KikumeGR mRNA Arka Gövde Uzama Time-lapse Film Konfokal Mikroskop ile Zebra balığı Embriyo Enjekte. Embriyo ve sol poster anterior gösterilirsağa IOR. Çıkan 10X büyütmede 10 dakika aralıklarla alındı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210video2.jpg" /> Animasyon / Video Şekil 2: İki foton Mikroskopi tarafından görüntülenmistir Nükleer mCherry ve Membran-GFP Etiketli balığı Embriyo, Arka Gövde Uzama Time-lapse film. Embriyo sola sağa ve posterior anterior gösterilir. Çıkan 25X büyütmede 2 dakika aralıklarla alındı. Renkli çizgiler her izlenen hücre için son on zaman adımları için hücrelerin parçaları gösterir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development at JoVE.com

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Görüntüleme.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Video: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biyoloji

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Nörobilim

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Biyomühendislik

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope

Source: Upadhyay S., et.al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60321/" target="_blank">A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This article describes a method to mount live zebrafish embryos for long term imaging. This method is cost effective and easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on Inverted Microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Katmanlı Agar Montajı: Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Ters Mikroskop ile Uzun Süreli Görüntüleme İçin Hazırlanması

Source: Upadhyay S., et.al. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2020).
This ...