Biz finansman ve destek için Max Planck Derneği, İnsan Frontier Bilim Programı (HFSP) ve Boehringer Ingelheim Fonds&#39;u teşekkür ederim.

1.. Malzeme Hazırlanması <ol><li> FEP boruların hazırlanması <ol><li> Tüpünden (aşağıda belirtilen adımlarda) sıvı yıkama ve künt uç kanül (Şekil 2B) ile bağlı bir şırınga kullanarak FEP tüp (Şekil 2A) temizleyin Not 1:.. Işlem boyunca kullan eldiven 2 Not: Önerimiz ca parçalar halinde borunun kesilmesi. 1 m uzunluğunda ve paralel olarak, bu temizleme. <ol><li> İlk arka arkaya 1 M NaOH ile tüp yıkayın. Daha sonra 0.5 M NaOH ile doldurulmuş bir 50 ml santrifüj tüpüne tüp transferi ve 10 dakika için ultrasonicate. </li><li> GKD 2 O. ile küçük bir lavabo için polimer tüp transferi İlk GKD 2 O ile ve daha sonra% 70 EtOH ile tüp yıkayın. </li><li> Daha sonra% 70 EtOH ile yeni bir santrifüj tüpüne FEP tüp aktarın. Yine, 10 dakika boyunca bu santrifüj tüpü ultrasonicate. </li></ol></li><li> Parçalar halinde temizlenmiş FEP tüp KesmeGerekirse, yaklaşık 3 cm (zebra balığı ve montaj görüntülemede kullanım için tipik bir uzunluk) ve düzeltin. GKD 2 O (Şekil 2C) ile dolu yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne temizlenmiş FEP tüpleri saklayın. </li></ol></li><li> Tricaine stok çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 97.9 ml GKD 2 O. 400 mg Tricaine (MS-222) çözülmesiyle% 0.4 Tricaine stok solüsyonu hazırlayın Toz tamamen çözülene sonra, 2.1 ml 1 M Tris (pH 9.0) ile 7.0 &#39;a pH ayarlamak. Işıktan çözüm koruyun. -20 ° C&#39;de saklayın tümbölenleri </li></ol></li><li> % 3 metilselüloz hazırlanması <ol><li> Aşağıda tarif edildiği gibi FEP tüplerin iç kaplama için% 3 metilselüloz çözeltisi hazırlayın. Yaklaşık olarak 60-70 ° C bir cam şişe içerisinde E3 11 kadar ısıtın ve metilselüloz tozun uygun miktarda ekleyin. Bir karıştırma çubuğu ilave edin ve 4 ° C&#39;de karışmaya En kısa sürede çözelti 30 ° C&#39;nin altına kadar soğutulur gibi, nihai c Tricaine çözeltisi eklemeoncentration 100 mg / L. 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca karıştırmaya devam edin. </li></ol></li><li> % 1.5 hazırlanması ve E3 içerisinde% 0.1 agaroz <ol><li> Bir cam şişeye E3 belirli bir hacim içinde düşük erime noktasına sahip agaroz tozun uygun miktarda çözülür. Bir mikrodalga karışımı ısıtın ve agaroz çözüm homojen görünene kadar kalan kristaller olmadan, arada bir sallayın. </li><li> 1.5 ml&#39;lik tepkime tüpleri içinde% 0.1 agaroz solüsyonun 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın. Alikoları, 4 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Kat plastik Petri için% 1.5 solüsyonu kullanın. Agaroz tabakasının kalınlığı ca olmalıdır. 2 mm. Agaroz katılaştıktan sonra kurumasını önlemek için bir tabakanın üstünde yer E3 orta ekleyin. Kaplanmış çanak 4 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol></li><li> Zebrabalıkları hazırlanması <ol><li> Protokollere 11,12 göre 28.5 ° C&#39;de Zebra balığı (Br.rerio) yetişkin ve embriyo tutmak ve bunları işlemek. </li><li> Öğleden sonra erkek ve dişi balık kurmak ve bir bölücü kullanarak ayırın. Balık çiftleşme zaman aşımına üzere aşağıdaki sabah bölücü çıkarın. </li><li> E3 ile dolu bir tabak içinde embriyolar toplayın ve bir stereo mikroskop kullanarak onları incelemek. </li><li> 24 hpf (ya da ilgi gelişim aşamasında) de, floresan ifade Zebrafish embriyoyu seçmek ve taze E3 ile yeni bir çanak olumlu olanları aktarabilirsiniz. </li><li> Dikkatle iki keskin forseps (Şekil 2D ve 2E) kullanılarak embriyolar dechorionate. Onu açık gözyaşı ve onu koparmak için koryon ve ikinci forseps kapmak ve tutmak için ilk forseps kullanın Not 1:. Bir stereomikroskopta yardımı ile bu adımı gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Çok katmanlı Montaj <ol><li> FEP tüp kaplanması <ol><li> Bir şırıngaya bir künt uç kanül takın. Bir temizlenmiş bir ucunda içine yaklaşık 3 mm dikkatle yerleştirin ve kanül parçası kesilmiş. Kullanın eldiven ve tüpün herhangi bir eğilme veya sıkma kaçının: FEP tüp (Şekil 2F ve 2G) Not 1. </li><li> % 3 metilselüloz içine FEP tüpün serbest ucunu Dip ve solüsyon ile tüp doldurun. </li><li> Yavaş yavaş şırınga iterek metilselüloz bırakın. Çözüm atın. </li><li> . Tekrar E3 Not 1 kullanılarak 2.1.2 ve 2.1.3 adım: kaplanmış tüpler hemen monte etmek için kullanılması gerekmektedir. </li></ol></li><li> Agaroza zebrafish aktarılması <ol><li> Bir ısı bloğu 70 ° C,% 0.1 agaroz bir kısım kadar ısıtın. Vortex Reaksiyon tüpü kısaca ve 38 ° C (Şekil 2H) ayarlanmış bir ısı bloğu aktarın. </li><li> Isı bloğu dışarı reaksiyon tüpü alın ve kısa bir süre soğumasını bekleyin. Yine 133-200 mg / L ve vorteks bir son konsantrasyonda (Şekil 2I) için Tricaine ekleyin. </li><li> Dechorionated Zebra balığı embriyolarının birini ve transfe seçin. r bir cam Pasteur pipet (Şekil 2J ve 2K) kullanılarak önceden ısıtılmış% 0.1 agaroz ile reaksiyon tüpüne 1 Not: Mümkün olduğunca az ek E3 aktarmak için çalışın. </li></ol></li><li> Zebra balığı Montaj <ol><li> Şırınga bağlı FEP tüp (Şekil 2L) ile embriyonun sürebilir. . Borusunun ya da sonuna yakın konumlandırılmış embriyo ve baş tüpün açılması yönünde işaret ile,% 0.1 agaroz tamamen dolu olmalıdır Not 1: balık yukarı çekmeden önce bazı agarozun almak için emin olun. Not 2: kabarcıklarını önlemek için şırınga çok yavaşça çekin Not 3:. içeriği (Şekil 2M ve 2N) sızmasını önlemek için yatay olarak tüp tutun. </li></ol></li><li> Tüpü takma <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. Çok katmanlı Zebra balığı embriyolarının için montaj. A) Fluorinated Etilen Propilen hazırlık. Yatak önce kablo tambur (HİP) borular) bağlı bir kör uç kanül ile bir şırınga. C) Bir temizlenir ve FEP tüp. D, 24 hpf E) dechorionation kesti erimiş bir reaksiyon tüpü içerisindeki agaroz% 0.1 bir ısı bloğu aktarılması ederken zebra balığı embriyolarının. F) künt uç kanül tüp takılması. G) kanül ve tüp ekli şırınga. H) bir kısım. I) vorteks FEP tüp. M, N) içine agaroz çevreleyen ile erimiş agaroz embriyo. L) Emme içine embriyo bir cam pipet kullanılarak dechorionated embriyo agaroz. J) Uptake. K) Transfer FEP tüp içinde zebra balığı embriyo . <strong&gt; O), bir agaroz kaplı çanak kullanımı ile boru takma) numune ve kanül. P arasındaki boru kesme. Q) embriyo takılı tüp. R) bir metal tutucu son numune hazırlama içine. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">için tıklayın Daha büyük resmi görmek.</a> <ol><li> Kanül (Şekil 2O) kapalı tüp kesmek için jilet kullanın. </li><li> Yavaşça tüp (Şekil 2P) takmak için plastik tabak içinde% 1.5 agaroz bütün kat boyunca balık içeren tüpün ucunu sopa Not 1:. Kabarcıklarının oluşumunu önlemek ve tutarak düz fiş yüzey elde etmek deneyin . tüp tam olarak dik agaroz yüzeye Not 2: biraz güzel bir fiş almak için tüp döndürün. </li><li> Kurumasını önlemek için E3 ile 1.5 ml reaksiyon tüpünde monte numune tutun. Numune, ngörüntülü hazır ow. Görüntüleme önce, balık fişi (Şekil 2. Çeyrek ve 2R) üstüne sağ oturuyor olup olmadığını kontrol edin. Ayrıca, montaj ortamı içinde aynı konsantrasyonda görüntüleme odasının içine ortama eklemek Tricaine emin olun. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Swoger, J., Muzzopappa, M., L&#243;pez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies.">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb. Prot. 2010 (5), (2010).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy.">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Jin, S. -. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -. N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li><li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+histone+variant+H2A.F/Z+and+a+transgenic+H2A.F/Z:GFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development.">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Gibi hafif levha mikroskobu gibi ileri mikroskopi teknikleri birkaç gün boyunca yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntü verilerini kaydetmek için olanak, aynı zamanda geliştirmek için örnek montaj teknikleri gerektirir. Zebra balığı gelişme hafif levha mikroskopi için montaj çok katmanlı ayrıntılı bir protokol mevcut. Yöntemi uygulamak için basittir ve günlük olarak laboratuarımızda kullanın. FEP borular Bizim montaj strateji anahtar bileşenleri, polimer, florinlenmiş etilen propilen (FEP) yapılmış tüplerdir. Biz öncelikle çünkü suya benzer ve bu nedenle ideal su daldırma hedefleri ve sulu ortam gerektiren numune hafif sac mikroskopisi için uygun olan 1,338 onun kırılma indeksi, FEP kullanmaya karar verdi. 0.8 mm iç çapa ve 0.4 mm duvar kalınlığı çok iyi gelişen zebrafish uygun olan borular, 1.6 mm için uygun tipik bir numune tutucu ile birlikte kullanılabilirkılcal damarlar ve sunulan montaj yöntemi için ilk tercihtir. Biz bizim ev inşa kurulumları yanı sıra ticari sistem Carl Zeiss Mikroskobu &quot;Lightsheet Z.1&quot; in iyice test edilmiş ve FEP tüpler, uzun vadeli istikrar sunan optik performansı üzerinde sadece minimal bir etkiye sahip ve nonfluorescent 10 olduğu bulundu. Bununla birlikte, örneğin, numune temizlenmiş farklı bir kırılma indisine ihtiyaç örnekleri ile uygulamalar için uygun değildir. Tüpler gibi FEP yapılmış folyolar çapları ve kalınlıkları, çeşitli mevcuttur. Buna ek olarak, FEP 260 ° C&#39;de eritilmiş ve böylece özel olarak yapılan numune montaj destek için neredeyse sınırsız olanaklar sunmaktadır edilebilir. Polimer borular temizleme protokolü iyi optik kalitesini sağlamak için çeşitli adımlar içerir neden olan, steril olmayan temin olma eğilimindedirler. Metilselüloz ile kaplama artan Zebrafish embriyo hiçbir parçası polimerine yapışır sağlar. % 0.1 agaroz için karar agaroz ve metilselüloz 10 farklı konsantrasyonda büyüme oranı ve hareketsizlik kapsamlı testler dayanmaktadır. % 0.1 yukarıda agaroz konsantrasyonları zaten 24 hpf zebrafish büyüme oranı üzerinde ciddi bir etkisi gösterdi. Ayrıca biz anestezi uyuşturucu Tricaine düşük dozlarda kullanın. Tricaine bloklar aksiyon potansiyelleri, böylece beyin ve kaslar arasındaki sinyal iletimini engeller ve kas kasılmaları 16 bastırır. 133-200 mg / L &#39;lik bir konsantrasyon 24-72 HPF arasında zebrabalıkları yeterli immobilizasyon sağlar. Ancak, Tricaine ve diğer anestezi ilaçlar biz kardiyak ödem gibi göstermek doza bağımlı yan etkileri test. Ayrıca Tricaine gerekli doz embriyonun gelişim aşaması ile değişir. Bu nedenle görüntülü gelişim aşamaları için gerekli miktara Tricaine konsantrasyonunu azaltılması önerilir. En iyi performan sağlamakce ve yan ürünler zehirli oluşumunu engellemek, taze hazırlanmış ya da çözülmüş Tricaine stok çözeltisi kullanılmıştır ışıktan korundu ve 30 ° C&#39;nin üzerinde ısıtılmaması olmalıdır FEP tüpler içinde gömme da özel ihtiyaçları için hesap için montaj orta kolay değişimine olanak sağlar. Kalbin time-lapse görüntüleme için, biz% 3 metilselüloz ve 100 mg / L Tricaine yerine% 0.1 agaroz ve montaj için 200 mg / L kullanmanızı öneririz. Metilselüloz,% 0.1 agaroz ve böylece kendi başına daha yüksek hareketsizlik sağlayan ve az Tricaine embriyo doğumdan sağlamak için kullanılması gereken daha fazla viskozdur. Tricaine 30 ° C nin üzerindeki sıcaklıklara duyarlı olduğu ve aynı zamanda performansı ve embriyo olası seğirmesi azalma yol açan, görüntüleme odası içindeki ortam ile seyreltilebilir. Bu nedenle, monte numune dalmış olduğu görüntüleme ortamda da Tricaine kullandığınızdan emin olun. Deneyleriniz yüksek kullanımını gerektiriyorsasıcaklıklar, sürekli bir perfüzyon sistemi ile ya da iki el ile bir zaman-nokta arasında bir tüpü ve bir şırınga ile ya da görüntüleme odası içindeki orta alışverişi önerilir. Kritik adımlar Numune montaj sürecinde önemli adımlar tüpe numunenin emme ve agaroz fişin sokma bulunmaktadır. Emme sonradan değiştirmek için zahmetlidir embriyonun başlangıç ​​konumunu tanımlar. Çoklu örnekler bağlamaya hazır olmalı ve montaj kaliteli bir stereo ile izlenmelidir. Örnek yönlendirme tatmin edici değilse bu genellikle embriyo katlanmış olarak, numune hazırlanması ve pistonu sonraki hareketlerinden kaçınmak hızını değiştirerek yardımcı olabilir. % 1.5 agaroz tıpası,% 0.1 agaroz sızmasını önlemek için gereklidir. Tüp içinde tıkacın yüzey gelişimi sırasında numune yönünü etkilememektedir düz olmalıdır. İyi bir sörf elde etmek içinas, agaroz tabakaların farklı kalınlıkları test edilmesi gerekir ve boru yüzeye normal agaroz koymak gerekmektedir. Tüpü biraz Döner ve tüp çekerek dikkatlice çanak fişi serbest bırakır. Montajının kaliteli görüntüleme önce bir stereo ile kontrol edilmelidir. Multiview görüntüleme Işık sac mikroskobu biri büyük avantajı multiview görüntüleme, numuneyi döndürmek çoklu açılardan z-yığınları kazanmak ve daha sonra kayıt ve onları kaynaştırmak için yeteneğidir. 3D uzayda z-yığınları kayıt kurulan bir yöntem mutemet belirteçleri 17 olarak numuneyi çevreleyen floresan boncuk kullanılarak boncuk-tabanlı kaydı. Bu yöntem, bununla birlikte bu gibi% 1.5 agaroz gibi katı bir montaj ortamı üzerine dayanır ve bu sayede çok katmanlı Burada yer montaj ile uyumlu görünmektedir. Ancak, pek çok alternatif çözümler uygulamaya bağlı olarak çalışır. İlk olarak, floresan boncuk olabilirsatın alma esnasında görüş alanında olması gerekir agaroz fiş, içine dahil edilebilir. İkinci olarak, aşama pozisyonları flüoresan boncuklar ile bir% 1.5 agaroz kolonu kullanılarak, gerçek deney önce kalibre edilebilir. Üçüncü olarak, flüoresan işaretçileri çekirdekler gibi alternatif birbirlerine göre z-yığınlarının konumunu belirlemek için kullanılabilir. Buharlaşma Tipik ışık mikroskobu levha kurulumları orta buharlaşma açık bir örnek odası, kaçınılmaz yol kullanın. Orta montaj orta buharlaşmanın engellenmesi için numunenin hayatta kalması, ve optik ve numune arasında doğru kırılma için gerekli olduğundan, buharlaşmasını önlemek için, aşağıdaki önlemlerden bir veya daha fazla alarak tavsiye. İlk olarak, odacık içindeki ortam sürekli bir perfüzyon sistemine göre değiş tokuş edilebilir. İkinci olarak, orta elle doldurulmuş olabilir. Üçüncü olarak, hazne bir kapak ya da esnek bir folyo ile kaplı olabilir. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; Oksijen kaynağı Polimer FEP kimyasalların büyük bir çeşitlilik dayanacak şekilde geliştirilmiştir ve dolayısıyla sağlam bir kimyasal olarak atıl ve gaz geçirgen olmayan dir. Çok katmanlı oksijen montaj durumunda sadece agaroz fiş ve agaroz-hava ara yüzeyi boyunca nüfuz ama polimer boru destek olmadan% 1.5 agaroz montaj ile karşılaştırıldığında çok katmanlı montaj oksijen kaynağı ciddi düşük ise bu gösterilecek olmaya devam etmektedir. Zebra balığı morfolojisi tabakalı monte etkilenir önce Ancak,% 1.5 agaroz içinde montajı sadece yaklaşık iki saat için kullanılabilecek uzun süreli görüntüleme için, genel olarak üstün bir çözüm gibi görünmektedir. Gelişiminin erken aşamaları Görüntüleme Montaj çok katmanlı şimdi Zebrafish daha eski 24 hpf time-lapse ışık sayfalık mikroskobu için standart gömme tekniği haline gelmiştir. Bunun yanı sıra, biz de erken evre embriyo görüntüleme için polimer tüpleri kullanın. Embryos kendi chorions kalır ve 1 mm&#39;lik bir iç çapa sahip bir tüp içinde FEP monte edilmiş ve E3 ile doldurulur. Zebra balığı serbestçe koryon içinde gelişebilir ve hala iyi ışık levha mikroskobu kullanılarak görüntülü olabilir. Görünüm Sunulan katmanlı örnek montaj zebrabalıkları ile gerçek-zamanlı gelişimsel biyoloji hafif sac mikroskobu tam potansiyelini ortaya çıkarır. Bu kolay gibi optik projeksiyon tomografi (OPT) ve diğer organizmalar gibi diğer mikroskopi teknikleri için kabul edilebilir. Biz standart boy FEP tüpler özel ihtiyaçlarına uygun örnek montaj teknikleri doğru sadece ilk adım olduğuna inanıyoruz.

Embriyogenez sırasında karmaşık olayları ve etkileşimleri anlamak için, gelişimsel biyoloji araştırma daha tüm organizmalarda in vivo görüntüleme için tek hücre ve organların mikroskop hareket olduğunu. Geleneksel mikroskopi teknikleri, genellikle uzun bir süre boyunca hızlı olayları takip etmek mekansal ve zamansal çözünürlük sunan başarısız ve genellikle ağartma veya numune 1 fototoksik etkilere neden olabilir. Biz ve diğerleri hafif levha mikroskobu (Şekil 1) Zebra balığı 2-4 in vivo görüntüleme için ideal bir teknik bulundu. Algılama eksenine dik lazer ışığı ince bir tabaka, numunenin aydınlatma yüksek uzamsal çözünürlük hem de en aza foto-toksisite 5 hızlı optik kesit sunmaktadır. Aynı zamanda, sayesinde bu eşsiz optik düzenlemesi için, Petri kapları veya kültür odası kullanılarak geleneksel bir numune montaj teknikleri uygun değildir. Tipik ışığındasac mikroskop üç öteleme motorlar ve bir dönme motorlu tam da yerleştirilmiş olabilir şekilde örnek, tutun, açık ve herhangi bir yönden baktı. Geçtiğimiz örneklerinde hafif levha mikroskobu için genellikle bir cam kapiller 6,7 içine agaroz% 1-2 gömülü edilmiştir. Bu durumda gömülü örnek ile katılaşmış agaroz silindir görüntüleme için su gibi bir ortam ile doldurulur numune odasına cam kılcal dışarı sıkılır. Agaroz suya yakın bir kırılma indeksine sahiptir ve bu nedenle su-düzeltilmiş aydınlatma ve algılama optik kolaylaştırır in vivo hafif sac mikroskobu için uygundur. Numune katı agaroz içinde hapsedilmiş ve kısa bir süre için de görüntülü olabilir, ancak birkaç saat boyunca 7,8 görüntülerken, belirli morfogenetik değişiklikler ve embriyonun büyümesi güçlü hasar görür. Diğer uygulamalar için çözümler invaziv olmayan uzun vadeli time-lapse Zebra balığı, 9 geliştirilmiş olmasına rağmen<html> Işık sac mikroskobu görüntüleme potansiyel geleneksel% 1.5 agaroz gömülmesini kullanılarak istismar edilemez. Bu nedenle Zebra balığı embriyolarının 10 in vivo hafif levha mikroskopisi için yeni bir montaj strateji geliştirdi. Numune, optik bakımdan saydam, polimer, florinlenmiş etilen propilen (FEP) yapılmış bir tüp içinde 200 mg / L Tricaine ile% 0.1 agaroz içinde monte edilir. Gömülü embriyo nedeniyle orta düşük viskoziteli normal geliştirir. Aynı zamanda, boru FEP deneyin süresi için ortam ve örnek sınırlar. Burada geleneksel protokolü üzerinde avantajları yansıtan yeni montaj tekniği ve mevcut verilerin ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz yöntem Zebra balığı gelişimi ile sürekli olarak iki günden fazla bir süre içinde yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip görüntülü edilebilir olduğunu göstermektedir. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Işık mikroskobu tabaka ilkesi. Fluorinatlı etilen propilen (FEP) yapılmış bir tüp içinde monte edilen bir zebra balığı çevrilmiş ve bulgulama hedefi odak düzlemi üzerinden döndürülebilir. Lazer ışığı (ışık levha) ince bir tabaka tespit objektif odak düzlemi içine aydınlatma amacı ile projelendirilen ve numunenin sadece ince bir optik bölümü aydınlatır. Yayılan floresans sinyali bulgulama amaç ile toplanmış ve bir kamera çipi üzerine kaydedilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

Işık sac mikroskobu Zebrafish embriyonik gelişimini incelemek için ideal bir görüntüleme tekniğidir. Nedeniyle minimal fotoğraf toksisitesine ve ağartma için, özellikle birkaç gün öncesine kadar çok saat süren uzun vadeli time-lapse görüntüleme için uygundur. Ancak, uygun bir örnek montaj strateji hapsi ve numunenin normal gelişimini hem de sunuyor ihtiyaç duyulmaktadır. Çok katmanlı montaj, optik açık tüpler düşük konsantrasyon agaroz kullanarak yeni bir gömme tekniği, şimdi bu sınırlama üstesinden gelir ve gerçek-zamanlı gelişimsel biyoloji hafif sac mikroskobu tam potansiyelini ortaya çıkarır.

Zebra balığı damarları Kalkınma Multiday Görüntüleme Uzun süreli ışık mikroskobu tabaka için çok katmanlı montaj stratejisinin avantajlarını göstermek için 13 zebrafish: Biz (GFP kdrl) Tg dpf 1 kullanın. Amaç, görüntü 2 gün boyunca bütün zebrabalıkları damar geliştirilmesidir. Zebra balığı embriyo metilselüloz kaplı polimer tüp içine agaroz 0.1% olarak monte edildi. Burada, Zebra balığı montaj orta ile sınırlı değildir ve normal gelişebilir. Onun kafası kuyruk (Şekil 3) uzanır ve damar filizlenmesi engelsiz görünür, yükseltir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Şekil 3.. Zebrafish damar gelişiminin Multiday görüntüleme. Bir multila bir damar13 Zebra balığı iki gün boyunca hafif bir tabaka mikroskobu engelsiz gelişir: Yer (GFP kdrl) Tg&#39;sinden dpf&#39;e 1 monte. Bir 488 nm lazer ışığı floresan levha heyecan ve sinyal 10X/0.3 W objektif ve bir EMCCD kamera kullanılarak tespit edildi. Z-yığınlar dört bitişik pozisyonlarda her 10 dk edinilmiş ve ardından Fiji 15 ile dikilmiştir. Zaman noktalarında bir alt maksimum yoğunluğu projeksiyonları gösterilmiştir. Ölçek çubuğu:. 500 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> Erken Zebra balığı Embriyo Görüntüleme Burada, döllenmeden sonraki ilk gün boyunca erken Zebrafish embriyojenezin hafif levha mikroskopi için bir montaj desteği olarak FEP tüplerin yeteneği göstermektedir. 8 HPF Tg (H2A: GFP) 14 Zebra balığı embriyo bir i olan bir E3 dolu tüp içinde onun bozulmamış koryon ile monte edildi1 mm çapında nner. Bu koryon hafif bir sıkıştırma ile sonuçlanır. Embriyonik dönemde tüm gelişim süreçleri montaj etkilenmeyen ve optimal ışık levha mikroskobu kullanılarak görülebilir. Bu örnekte, 12 saatlik bir kurs (Şekil 4) üzerindeki numune görüntülenmiş. % 1.5 agaroz içinde koryon olmadan geleneksel monte kullanırken örneğin yumurta sarısı ve orta hat boyunca doku kalınlaşma artan uzama gibi erken embriyojenez sırasında tipik şekil değişiklikleri, baskı olacaktır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Erken Zebrafish embriyojenezin Şekil 4 Görüntüleme A Tg (H2A: GFP). 14. Zebra balığı erken embriyojenezin geçer. A 488 nm lazer ışığı sac heyecanlı GFP ve floresan sinyal tespit edildiBir 10X/0.3 W ve objektif bir EMCCD kamera ile. İki açılardan Z-yığınlar 12 saatlik bir kurs boyunca her 3 dakikada elde edildi. Geçen zaman bir alt kümesi normalize maksimum yoğunluğu çıkıntılar gösterilmiştir. Hiçbir anestezik kullanılan olarak satın alma sırasında embriyo seğirmesi 19 hpf sonuçlarına Görünür hareket bulanıklığı,. Ölçek çubuğu:. 150 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir. 

Video: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Biyoloji

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Kronik Deneyleri Montaj Elektrotlar veya mikrodiyaliz Problar Işık tedavi Diş Yapıştırıcı Reçine Uygulama

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em&gt; Toto yılında</em&gt; Gürüntülenmesi<em&gt; C. elegans</em&gt; Gelişme

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...