Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. 솔루션의 준비 및 뽑아 유리 바늘 <ol><li> 20 mM 트리스 pH가 8.8에 4 ㎎ / ㎖에서 Tricaine (3- 아미노 벤조산 에틸 에스테르라고도 에틸 3- 아미노 벤조 에이트)의 25 배 스톡 용액을 제조하고 그 용액의 pH에서 4 밀리리터 매장 제 나누어에서 가져 -20 ° C. 참고 : 마취 Tricaine함으로써 근육의 경련 및 운동 (6)을 차단하는 신경 전압 문이 나트륨 채널을 우선적으로 작용한다. </li><li> E3 배아 매체에 0.17 ㎎ / ㎖의 최종 농도 Tricaine의 작동 용액을 만든다. (7) 참고 :이 용액의 pH가 품으로 즉흥적 솔루션을 작업 Tricaine을 확인합니다. </li><li> 전자의 용액을 가열하여 50 ㎖ 튜브에서 E3 배아 배지에서 1.5 %의 최종 농도로 저 융점 아가로 오스를 녹인다. 물 목욕이나 벤치 탑 인큐베이터 중 하나에서 45 ° C -이 솔루션은 42 평형을 보자. 수직에 대한 많은 요리를 준비하는 경우빛 장 영상 (4 단계), 아가로 오스 E3 배아 매체에 1 % 표준 용융의 추가 25 mL로. </li><li> OD 1.20 mm, ID 0.69 mm, 길이 10mm의 크기와 필라멘트 모세 혈관과 붕규산 유리를 사용합니다. </li><li> 날카로운 집게 한 쌍으로, 속도 (50), 시간 (225), 압력 (500) (120)를 당겨, 열 (600), 브레이크 : 모세 혈관은 장비 및 시약, 다음 설정을 사용의 표에 설명 된 가열 필라멘트 바늘 풀러의 종류에 가져온 경우 단지 지점 과거 바늘되는이 배아를 배향하고 초과 아가로 오스를 제거하는 깨끗하고 날카로운 바늘을 만들 구부러. 마이크로 메스 또한 과량 아가 로스를 제거 할 수있다. </li></ol> 거꾸로 또는 수직 현미경을위한 배아 2. 퍼가기 <ol><li> E3 배아 매체에 적절한 단계로 배아를 올립니다. (7) </li><li> 양안 dissec 아래 날카로운 집게 한 쌍의 필수 단계에서, dechorionate 배아팅 현미경. </li><li> Tricaine 작업 용액에 적어도 5 분 동안 dechorionated 배아를 품어. </li><li> 용융 아가 용액을 45 ° C로 냉각되면, E3 매체의 최소한의 전송로 50 ㎖ 튜브에 직접 dechorionated 배아를 전송하는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. </li><li> 매체를 장착 약 1 ml의와 함께 배아를 제거하고 약 추가 할 수 있습니다. 10 밀리미터 마이크로 웰과 35mm 유리 바닥 페트리 접시의 중앙 원에 배아와 함께 매체를 장착 100 ㎕. </li><li> 설치 매체가 설정 될 때, 바깥쪽으로 (그림 1A)를 직면 꼬리 아가로 오스의 원의 가장자리로 배아를 이동합니다. 겔이 완전히 설정 될 때까지 원하는 횡 방향 배아를 유지하는 모세관 바늘을 사용한다. 이미지 후방 신체 발달, 가능한 한 측면 오리엔테이션에서 배아의 방향을주의하십시오. 따라서,주의 adjustmen하여이 위치에 배아를 유지모세관 바늘 TS. 주 : 필요한 경우, 여러 개의 배아이 시점에서 장착 접시에 첨가 될 수있다. 이 경우, 제 접시로 오스가 낮은 용융 전송하고 아가 드롭의 중심 배아를 추가한다. 그리고, 유리 링의 에지에 배아를 밀어 원하는 위치로 배향. 여섯 배아까지 아가로 오스가 응고되기 전에이 방법을 장착 할 수 있습니다. </li></ol> 후방 몸 주위 초과 아가로 오스 3. 제거 참고 :이 섹션은 아가로 오스는 후방 본체 주변 지역에서 제거하는 절차를 설명합니다. 후방 바디 연신의 경우에는 꼬리 성장 아웃 할 수있는 일반적으로 보장하는 것이 중요하다. 배아 완전히 아가가 포함 된 후, 아가 로스를 제거하여, 배아는 헤드 영역과 난황의 약 절반으로 둘러싸인 남겨진다. <ol><li> 아가 강하가 설정되면, 페트리 디 홍수Tricaine 작업 솔루션을 쉬. </li><li> 전송 된 광 염기 쌍안 해부 현미경 하에서 강한 콘트라스트가 동작을 명확하게 볼 수 아가 로스의 절단이 가능하도록 상기 미러 위치 및 입사광의 각도를 조정한다. </li><li> 절단 실행 1 (도 1) 바로 체절 (5) (5 차의 위치에 형성 심장 필드 후부 위치에서 난황 따라 아가 중도 절단 모세관 바늘 또는 마이크로 메스를 사용 전방 체절). </li><li> 그림과 같이 형성 마음에 인접한 초기 절단, 유리에 아가로 오스를 통해 전체 방법을 시작합니다. </li><li> 최대보고 그림 1과 같이 배 이상 긴 절단을 시작하면서 아래로 천천히 깊은 아가로 오스 내에서 모세관 또는 마이크로 메스를 유지하고. 배아 또는 노른자를 천공하지 않고 가능한 한 배아에 가깝게 잘라. </li><li> 다음에, 절단하게 2, 3 (도 1 </strong&gt;), 배아에 대한 위치에서 유리에 이르기까지 모든 방법을가는 컷으로 시작은 접시를 바닥. 이 제 5 somites 접선되도록 후방 본체의 전개 전체 dorsalward 허용 2 절단 만든다. 노른자면과 90 ° 각도로 삼을 잘라 HEARTFIELD에서 시작합니다. 주 : 완전한 블록 (단계 3.6)로 오스를 제거하는 에이즈 (도 1에 도시 된 바와 같이) 유리 원형의 가장자리까지 아가로 오스를 절단. 그러나, 이것은 필요하지 않다. </li><li> 인하 1과 3의 교차점에서 시작, 천천히 후방 몸을 둘러싼 아가로 오스의 제곱을 제거하기 위해 위쪽으로 들어 올리는 동안 컷 2의 끝으로 천천히 대각선 컷을합니다. 주 : 일부 경우에, 이것은 하나의 블록에 출시되고 동작이 한 번에 완료된다. 다른 사람에서는 DIS-별장에 배아를 둘러싼 모든 아가로 오스를 여러 번 시도해야 할 수 있습니다. </li><li> 날카로운 집게 한 쌍으로, 빠질 B를 제거배아 매체로부터 아가로 오스의 잠금. 이 과정에 도움 접시 측으로 아가 로스 편을 이동시키고, 아가 로스 편을 들어 올리는 동안 지지체로서 배양 접시의 벽을 사용한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> 그림 1 : 설치 셋업의 다이어그램. (A) 다이어그램은 페트리 접시의 중앙 유리 링 내에 장착 된 배아의 위치를 나타낸다. 오른쪽에있는이 아가로 오스 dottted 빨간 선으로 표시 둘러싸을 통해 각각의 연속 컷 배아의 확대이다. (B)이 탑재 된 배아는 모두 반전 직립 목표에 대한 접근 용이성을 표시하는 측면도에 도시된다. (C) 배아가 수직 광 시트 영상 셋업 마운트 될 수있는 방법을 보여주는 유사한 digram. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">카스티하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK. <ol start="9"><li> 근육 경련이 완전히 그 시점에서 차단되지 않은 경우, 4 ㎎ / ㎖, pH가 7의 원액에서 Tricaine 방울을 추가합니다. </li></ol> 4. 수직 빛 시트 현미경을위한 배아의 설치 참고 :이 그 위에서 설명한 방법에 변화가 수직 지향 SPIM에 의해 시료의 이미징을위한 여러 목적의 접근을 허용합니다. 이 변화의 뒤에 아이디어는이 영상 목표를 쉽게 액세스 할 수 있도록, 접시의 바닥보다 약간 높은 샘플을 들어 올릴 것입니다. <ol><li> 장착 샘플 전에 코트 5mm의 높이 E3 배지에서 1 % 아가로 오스와 100mm 플라스틱 페트리 접시에 세트 할 수있다. </li><li> 접시의 중앙에 1 ml의 저 융점 아가 방울을 배치하고 설정할 수. </li><li> 그러나 2 항에서와 같은 저 융점 아가로 오스에 포함 된 배아는, 이번에는 50 ㎖ 튜브에서 배아를 제거의 아가로 오스 용액 (0.5 ㎖)의 작은 방울과 접시의 중앙에 떨어 ㎖로 1 위에이 작은 방울을 배치합니다. </li><li> 작은 방울의 중심 배아를 배치하고 겔이 설정 될 때까지의 올바른 방향을 유지하기 위해 모세관 바늘을 사용한다. </li><li> Tricaine 작업 용액으로 요리 홍수와 섹션 3에서와 같이하지만, 1 % 표준 아가로 오스의 쿠션을 통해 절단하지 않고 초과 아가로 오스를 제거합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 실장 기술은 배아가 현미경 및 여러 길이 스케일에서 후방 신체 신장을 다음 목표로 이상 장기 시간 경과 이미징 실험에 전송하는 동안 계속 유지 될 수 있습니다. 이 모두 수직 및 반전 현미경 셋업에서 촬상이 가능하고,이 제안은 상기 수직 배향 SPIM에 적응 될 수있는 방법에 대해 이루어지는 것을 또한, 다목적. 이 프로토콜의 중요한 단계는이 구조의 정상적인 개발을 허용하는 것이 중요하다 후방 몸을 둘러싼 과잉 아가로 오스의주의 제거하는 것이다. 노른자의 상단 주위에 아가로 오스를 제거 특히, 배아를 손상하지 여기에주의를 기울여야하는 것이 중요하다. 때때로,이 프로세스 중에 몰드로부터 배아를 잃을 수도로서 배아 주위에서 절단 아가 블록을 분리 할 때뿐만 아니라,주의를 기울여야한다. 이러한 이유로, 이것은 낮은 처리량 방법 그쪽은t는 달리 이미 3D 인쇄 플라스틱 금형을 이용하는 방법을 발행하는 동시에 많은 제브라 피쉬 배아의 장착에는 적합하지 않다. 8,9 그러나 배아이 실장 방법으로 매우 안정적이며, 따라서 더 쉽게 현미경으로 이송 될 수 있고, 후방 본체 신도 걸쳐 그들의 3 차원 방향을 유지한다. 다른 중요한 단계는 안테-후방 또는 배측 복부 - 틸트 회피 배아의 초기 횡 방향의 정확성이다. 어느 쪽의 경사는 추가 분석을 위해 뷰의 가장 편리한 각도 후방 신체 확장의 측면 비전을 배제합니다. 안테 - 후방 경사는 후방 몸에 가산 결과에 높은 Z의 스택과 낮은 시간 해상도에 따라서 시간이 경과의 인수를 의미합니다 수평면에 대하여 아래 성장이나됩니다. 이 방법은 적이있다rsatile하고는 상기 Fucci 라인 5, 10의 사용뿐만 아니라 멀티 스칼라 형태 계측 학적 분석 등으로 세포 분열 속도의 영상 허용했다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 5 단, 후방 몸체 축 연신 중에 tailbud의 극적인 전체 변위를 주어, 비교적 저배율의 목표는 이러한 전체 과정을 포착하기 위해 사용될 수있다. 인수 4 시간 (비디오도 1) - 관심의 영역에서 높은 배율 결과 (3) 내의 시야 범위를두고 있기 때문이다. 따라서, 상기 tailbud의 영상을 향상시키는 하나의 방법은 tailbud의 전체적인 움직임을 추적하고 포착 동안에 현미경 스테이지의 X, Y, Z 위치를 조정하는 자동 추적 알고리즘을 갖는 것이다. 여기에 설명 된 설치 방법으로 모든 축 차원에서 배아의 증가 된 안정성을 감안할 때, 그것은 의무가해야한다이러한 방식.

후방 바디 신장 배아 몸 축 큰 부분을 형성하기 위해 연장되는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 이는 다중 셀 동작 개별 조직의 형태 형성 수준을 생성하는 역할을 배위하는 복잡한 형태 형성 공정의 일례이다. 이러한 차동 조직 변형은 전체 구조 수준에서 후방 본체의 신장을 생성하도록 함께 작용한다. 이러한 프로세스 제어 및 개발 과정에서 조정하는 방법을 이해하려면, 우리는 (분자, 세포, 세포 집단과 조직의 수준에서 즉) 여러 규모에서 이러한 프로세스를 수행 할 수 있어야하고, 전체 구조의 형태 형성에 직접 연관에 . 자신의 광학 투명성과 작은 크기는 최소 침습 광 이미징의 응용 프로그램에 대해 허용하는 제브라 피쉬 배아는 거실에 적합 접근 이미징 후방 신체 신장에 이상적입니다전자 영상. 한 이것은 분자 레벨에서 후방 본체 개발을 밝혀왔다 최근 공보의 시리즈에 의해 입증 된 2 단 전지 4뿐만 아니라 세포 집단 및 전체 기관의 수준에서 3 간 조직 행동. (5) 이러한 공 초점, 다 광자 현미경 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)와 같은 고급 이미징 기술은 광 독성 광 표백 효과의 감소와 개발 프로세스의 장기 영상을 가능하게한다. 실제 샘플의 장착을위한 견고한 방법이 세 가지 목표를 달성하기 위해 필요하다 : 1) 충분한지지가 현미경 및 수집 동안 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지하기 위해, 2) 샘플의 이동 충분한 자유의 생장을 허용하는 정상 (STABLE)에 영향을주지 않고 후방 바디 영역opment, 그리고 마지막으로 3) 장착 방법의 다양성에 어느 정도의 다양한 영상 셋업에 영상을 허용합니다. 이 프로토콜은 제브라 D. 레 리오의 개발을 이미징 실장 기술을 소개한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서 머리와 난황 낭 영역이 거의 아가 로스에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 이와 같이,도 아가 표준 광 이미징 기술에 의해 촬상 가능으로 현상 신체의 다른 영역의 장기 촬상에 적합한 방법이다. 이 바꾸는 방향에서 배아를 탑재하는 것도 가능하지만,이 프로토콜은, 횡 방향으로 배아의 장착을 보여줍니다. 그것은 또한, 수직 반전 및 수직 빛 시트 현미경 설정하는 방법을 적용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

제브라 피쉬 배아 인해 접근성과 광 투과성의 용이성 복잡한 형태 형성 과정을 연구 할 수있는 이상적인 실험 시스템을 제공합니다. 특히, 후방 본체 신도 여러 조직 변형 몸 축의 큰 부분의 형성을 유도하기 위해 함께 작용하는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 장기간 시간 경과 화상이 과정을 관찰하기 위해 충분한 지원 현미경 및 취득을 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지할 수있게 장착 기술을 활용하는 것이 필요하다. 또한, 장착은 정상적인 발달에 영향을주지 않고 후방 바디 영역의 생장에 대한 충분한 이동 자유를 제공한다. 마지막으로, 다양한 영상 셋업에 영상을 수 있도록 장착 방법의 다양성에 어느 정도가 있어야합니다. 여기서, 우리는 후방 바디 elongatio 개발을 이미징 실장 기술을 제시n은 제브라 피쉬 D. 레 리오한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서, 헤드 및 난황 낭 영역이 거의 아가에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 우리는이 똑바로 반전 및 수직 빛 시트 현미경 셋업에 대해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 후방 몸 이미징을위한 배아를 장착에 초점을 맞추고 있지만, 쉽게 제브라 피쉬 개발의 여러 측면의 라이브 영상에 대해 적용 할 수 있습니다.

위에서 설명한 프로토콜은 장기간의 시간 경과 이미징을위한 제브라 피쉬 배아의 장착을위한 다양한 방법을 자세히 설명합니다. 이것의 예는도 2a 및 / 비디오 애니메이션도 1에 도시된다. 배아는 mRNA의이 photoconvertible 형광 단백질 kikumeGR을 인코딩으로 1 세포 단계에서 주입 하였다. 10 배 목표와 거꾸로 공 초점 현미경에 상술 한 바와 12 시간 동안 몇 군데로 15 체절 단계에서 그들은 장착되었다. 도시 된 바와 같이 생성 된 촛점 스택이 최대로 표시 될 것으로 예상되었다. 이 영화는 분명히 후방 본체 무비의 지속 시간에 걸쳐 자유롭게 이동시키고, 정상 배양 조건에서 자유롭게 융모막의 개발을 허용 배아에서 본 형태의 유사한 변화를 보여준다 것을 보여준다. 추가적인 예 F의 igure의 (b)에 도시및 애니메이션 / 비디오 그림 2. 여기서, 배아 히스톤 2B-mCherry 단백질 (즉 핵 라벨) 및 eGFP는 코딩 된 mRNA의 조합으로 16 세포 단계에서 주입했다 : CAAX 박스 (즉, 세포막을 라벨; 사항 참조 참조 5). 도 1b에 도시 된 바와 같이 그들은 다음 침수 25X 목표와 수직 광자 현미경에 몇 군데 있었다. 이미지 형성시 tailbud 셀룰러 동작을 시각화하기 위해 10 체절 단계에서 3 시간 동안 수행 하였다. 셀은 일반적으로 tailbud 형태 활성 돌기 및 방향 운동을 생성하도록 볼 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig2.jpg" /> 그림 2 : 10 X 배율에서 후방 바디 신장의 시간 경과 영상의 예. (A) 연속 프레임축 연신 공정을 덮는 대표 동영상. 배아는 이미지의 우측을 후방으로 측면도로 도시되어있다. (B) tailbud 형성시에 개별 셀의 행동을 도시하는 고배율 동영상의 연속 프레임. 배아 우측 후방으로 측면도로 도시되어있다. 점선이 형성 tailbud을 설명합니다. 작은 컬러 라인은 핵의 트랙 개별 세포의 움직임을 따라 보여줍니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="비디오 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210video1.jpg" /> 애니메이션 / 비디오 그림 1 : KikumeGR의 mRNA의 후방 바디 신장의 시간 경과 영화는 공 초점 현미경으로 Zebrafish의 배아를 주조. 배아 왼쪽 포스터 앞쪽으로 도시오른쪽에 IOR. 이미지는 10 배 배율에서 10 분 간격으로 촬영 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="비디오 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210video2.jpg" /> 애니메이션 / 비디오 그림 2 : 두 광자 현미경에 의해 촬영 핵-mCherry 및 멤브레인-GFP 레이블 된 제브라 피쉬 배아의 후방 바디 신장의 시간 경과 영화. 배아 왼쪽 오른쪽 전치부와 같다. 이미지는 25X 배율에서 2 분 간격으로 촬영 하였다. 컬러 라인은 각 추적 셀 지난 10 시간 단계는 세포의 트랙을 표시합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K 조회수.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

비디오: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

생물학

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

신경과학

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

생체공학

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope

Source: Upadhyay S., et.al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60321/" target="_blank">A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This article describes a method to mount live zebrafish embryos for long term imaging. This method is cost effective and easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on Inverted Microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Layered Agar Mounting: 도립 현미경을 사용한 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 준비

Source: Upadhyay S., et.al. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2020).
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