Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. Herstellung von Lösungen und Pulled Glasnadel <ol><li> Machen Sie eine 25x Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, die auch als Ethyl-3-aminobenzoat) bei 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 und bringen diese Lösung bei pH 7. Aliquot von 4 ml und an einem -20 ° C. HINWEIS: Das Anästhetikum Tricaine wirkt bevorzugt auf neuronalen spannungsgesteuerten Natriumkanäle dadurch blockiert Muskelzuckungen und Bewegung 6. </li><li> Machen Sie eine Arbeitslösung von Tricaine bei einer Endkonzentration von 0,17 mg / ml in E3 Embryo Medium. 7 HINWEIS: Stellen Sie die Tricaine Arbeitslösung unvorbereitet wie der pH-Wert dieser Lösung driftet. </li><li> Man löst den niedrigschmelzender Agarose bis zu einer Endkonzentration von 1,5% in E3 embryo-Medium in einem 50 ml-Röhrchen, indem die Lösung in einer Mikrowelle erhitzt wird. entweder in einem Wasserbad oder Benchtop-Inkubator 45 ° C - Lassen Sie diese Lösung auf 42 ins Gleichgewicht. Wenn die Vorbereitung große Gerichte für vertikaleLichtbogen-Bildgebung (Schritt 4), zusätzlich 25 ml 1% Standard Schmelzen Agarose in E3 Embryo Medium. </li><li> Verwenden Sie Borosilikatglas mit Filament Kapillaren mit Abmessungen von 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, Länge 10 mm. </li><li> Wenn Kapillaren von der Art der Heizung Faden Nadel Abzieher beschrieben in der Tabelle von Geräten und Reagenzien gezogen wird , verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 600, Pull 120, Geschwindigkeit 50, Zeit 225, Druck 500. Mit einem Paar scharfe Zange, Pause die Nadel gerade hinter dem Punkt, an dem es biegt sich für orientierende Embryonen eine saubere und scharfe Nadel zu schaffen und überschüssige Agarose zu entfernen. Ein Mikroskalpell kann auch verwendet werden, um überschüssige Agarose zu entfernen. </li></ol> 2. Einbettung von Embryonen für Inverted oder Upright Mikroskopie <ol><li> Heben Sie die Embryonen in E3 Embryo Medium auf die entsprechende Bühne. 7 </li><li> Bei der erforderlichen Stufe dechorionate Embryonen mit einem Paar von scharfen Pinzette unter einem Binokular dissecting Mikroskop. </li><li> Inkubieren Sie die dechorionated Embryonen für mindestens 5 min in der Tricaine Arbeitslösung. </li><li> Sobald die geschmolzene Agarose-Lösung auf 45 ° C abgekühlt ist, verwenden, um eine Glaspasteurpipette den dechorionated Embryo direkt in das 50 ml-Röhrchen mit minimaler Übertragung von E3 Medium zu übertragen. </li><li> Entfernen Embryo zusammen mit etwa 1 ml Medium Montage und fügen Sie ca.. 100 &amp; mgr; l mit einem 10 mm Mikrotiterplatten-Medium zusammen mit dem Embryo mit dem zentralen Kreis einer 35 mm Glasboden-Petrischale Montage. </li><li> Da die Montagemedium setzt, um den Embryo an den Rand des Kreises der Agarose mit dem Schwanz nach außen (Abbildung 1A) gegenüber zu bewegen. Verwenden Sie die Kapillarnadel den Embryo in der gewünschten seitlichen Ausrichtung zu halten, bis das Gel vollständig eingestellt. Um das Bild zu hinteren Körperentwicklung, achten Sie darauf, den Embryo in eine seitliche einer Orientierung wie möglich zu orientieren. Daher halten den Embryo in dieser Stellung durch vorsichtiges adjustments mit der Kapillare Nadel. HINWEIS: Mehrere Embryonen kann an dieser Stelle auf die Montageschale gegeben werden, falls erforderlich. Wenn dies der Fall ist, übertragen, das niedrigschmelzende Agarose in die Schale erste und die Embryonen in der Mitte der Agarose Tropfen hinzu. Drücken Sie dann die Embryonen aus zu den Rändern des Glasring und orientieren in die gewünschte Position. Bis zu sechs Embryonen können auf diese Weise montiert werden, bevor die Agarose verfestigt wird. </li></ol> 3. Entfernen von überschüssiger Agarose Rund um den Hinterleib Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Verfahren, mit dem Agarose aus dem Bereich entfernt wird, um den hinteren Körper umgibt. Im Falle von posterior Körperdehnung, ist es wichtig, dass der Schwanz normalerweise wachsen-out kann zu gewährleisten. Durch das Entfernen der Agarose nach der Embryo durch Agarose vollständig aufgenommen wurde, wird der Embryo durch den Kopfbereich und etwa die Hälfte der Dottersack eingeschlossen gelassen. <ol><li> Nachdem die Agarose Tropfen gesetzt hat, überfluten die Petri-dish mit der Tricaine Arbeitslösung. </li><li> Unter einem Sezieren Binokular mit einer Durchlichtbasis, passen Sie die Spiegelposition und der Winkel des einfallenden Lichts, so dass der starke Kontrast für die Schnitte in der Agarose ermöglicht, durch den Betrieb deutlich zu sehen. </li><li> Zur Durchführung geschnitten 1 (Abbildung 1), verwenden Sie die Kapillar - Nadel oder die Mikro-Skalpell die Agarose auf halbem Weg entlang der Dotter zu schneiden, aus einer Position posterior nur zur Formherzfeld in die Position des somite 5 (5. anterioren Somiten). </li><li> Starten Sie den ersten Schnitt neben dem Inneres bilden, wie gezeigt, und die vollständige Weg durch die Agarose auf das Glas. </li><li> Halten Sie die Kapillare oder Mikroskalpell tief in der Agarose und langsam sah nach oben und unten , während beginnen einen langen Schnitt über den Embryo zu machen , wie 1 gezeigt Abbildung. Schneiden Sie so nah an der Embryo wie möglich, ohne den Embryo oder Eigelb Punktierung. </li><li> Als nächstes stellen Schnitte 2 und 3 (Abbildung 1 </strong&gt;) Aus der Position gegenüber dem Embryo beginnt und mit dem Schnitt bis auf das Glas ganzen Weg Bodenschale. Machen Sie 2 geschnitten, so dass sie tangential zu den ersten 5 Somiten ist, so dass eine uneingeschränkte dorsalwärts des hinteren Körpers entfaltet. Machen Sie 3 schneiden in einem Winkel von 90 ° mit dem Eigelb Oberfläche und ausgehend von der Heartfield. HINWEIS: Das Schneiden des Agarose , bis der Rand des Glaskreis hilft bei der Entfernung der Agarose als kompletter Block (Schritt 3.6) (wie in Abbildung 1 gezeigt). Jedoch ist dies nicht notwendig. </li><li> Beginnend an der Kreuzung der Schnitte 1 und 3 machen einen langsamen Diagonalschnitt gegen Ende des Schnitts 2, während sich langsam nach oben, um das Anheben des quadratischen Agarose rund um den hinteren Körper zu entfernen. Anmerkungen: In einigen Fällen wird dies in einem Block freigegeben werden und der Betrieb wird in einem Arbeitsgang abgeschlossen. In anderen Fällen kann es mehrere Versuche, dis-lodge alle Agarose rund um den Embryo nehmen. </li><li> Mit einem Paar scharfe Zange, entfernen Sie das verdrängt bSchlösser von Agarose aus dem Embryo Medium. in diesem Prozess zu unterstützen, die Agarose-Stücke auf die Seite der Schale bewegen und die Wand der Petrischale als Träger verwenden, während die Agarose-Stücke herausheben. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Abbildung 1: Diagramme von Montage - Set-ups. (A) Das Diagramm zeigt die Position des montierten Embryo innerhalb der Mitte Glasring einer Petrischale. Auf der rechten Seite ist ein lautes Summen des Embryos mit jedem aufeinanderfolgenden Schnitt durch die mit dottted roten Linien Agarose gezeigt umgibt. (B) Die montierten Embryonen ist in der Seitenansicht diagrammed Anzeige der Leichtigkeit des Zugangs für Kehr- und aufrecht Ziele. (C) Ein ähnliches digram zeigt , wie Embryonen können für vertikale Lichtbogen Abbildungsaufbauten montiert werden. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="9"><li> Wenn Muskelzucken nicht vollständig an diesem Punkt blockiert wird, fügen Tropfen Tricaine aus der Stammlösung von 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montage von Embryonen für vertikale Lichtbogen-Mikroskopie Hinweis: Dies ist eine Variante der oben beschriebenen Methode, dass für den Zugriff mehrerer Ziele umrissenen ermöglicht Abbilden von Proben durch vertikal orientierte SPIM. Die Idee hinter dieser Variante wird die Probe geringfügig höher als der Boden der Schale zu heben, um einen einfachen Zugang von zwei Abbildungsziele zu ermöglichen. <ol><li> Vor Montage zu probieren, Mantel eine 100 mm Petrischale aus Kunststoff mit 1% Agarose in E3 Medium bis zu einer Höhe von 5 mm und stehen lassen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von 1 ml mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in die Mitte des Tellers und stehen lassen. </li><li> Einbetten von Embryonen in niedrigschmelzender Agarose, wie in Abschnitt 2. Dieses Mal jedoch, entfernen Sie den Embryo aus dem 50-ml-TubeAgarose mit einem kleineren Tropfen Lösung (0,5 ml) und legen diese kleinen Tropfen auf dem 1 ml in der Mitte der Schale fallen. </li><li> Verwenden Sie die Kapillarnadel den Embryo in der Mitte des kleinen Tropfen zu platzieren und zu pflegen ihre korrekte Ausrichtung bis Gel festgelegt ist. </li><li> Fluten die Schale mit Tricaine Arbeitslösung und entfernen Sie das überschüssige Agarose, wie in Abschnitt 3, jedoch ohne durch das Polster von 1% Standard-Agarose-Schneiden. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Diese Befestigungstechnik ermöglicht Embryonen noch während der Übertragung an das Mikroskop und über an folgenden hinteren Körperdehnung mehrere Längenskalen dem Ziel eines langfristigen Zeitraffer-Imaging Experimente gehalten werden. Darüber hinaus ist es vielseitig, dass sie für die Bildgebung auf beiden aufrechten und der inversen Mikroskopie Aufbauten erlaubt, und ein Vorschlag gemacht wird, wie dies weiter vertikal ausgerichtet SPIM angepasst werden. Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll ist die sorgfältige Entfernung von überschüssigem Agarose rund um den hinteren Körper, zu ermöglichen, dass die normale Entwicklung dieser Struktur wichtig ist. Es ist wichtig, darauf zu achten, hier nicht in den Embryo zu beschädigen, insbesondere wenn um die Oberseite des Dotters die Agarose zu entfernen. Außerdem muss darauf geachtet werden, wenn der Schnitt Agaroseblock aus der ganzen Embryo zu entfernen, wie es manchmal ist es möglich, den Embryo aus der Form während dieses Prozesses zu verlieren. Aus diesen Gründen ist das eine niedrige Durchsatzverfahren That ist nicht geeignet für die Montage von vielen Genaktivität im Gegensatz gleichzeitig zu bereits veröffentlichten Verfahren unter Verwendung von 3D-Druck Kunststoff-Formen. 8, 9 sind jedoch Embryonen durch diese Befestigungsmethode sehr stabil und können daher mit dem Mikroskop viel einfacher, und behalten ihre 3D - Orientierung im gesamten Körper posterior Dehnung transportiert werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Genauigkeit der anfänglichen seitlichen Ausrichtung des Embryos, und auf Vermeidung antero-posterior oder dorso-ventralen Neigung. Entweder Neigung wird die seitliche Sicht des hinteren Körperstreckung entgegen, die am bequemsten Blickwinkel für die weitere Analyse ist. Die anteroposteriore Neigung wird zusätzlich Ergebnis im hinteren Körper wächst nach oben oder unten in Bezug auf die horizontale Ebene, die den Erwerb von höheren Stacks in z bedeuten und damit zeit Verfehlungen mit einer geringeren Zeitauflösung. Diese Methode ist versatile und ist für die Bildgebung der Zellteilung Raten bei der Verwendung der Fucci Leitung 5, 10 sowie mehreren skalaren morphometrische Analysen erlaubt. Allerdings 5 kann die dramatische Gesamtverschiebung des Schwanzknospen während der Verlängerung der hinteren Körperachse, nur eine relativ geringe Vergrßerung Ziele ergibt , verwendet werden , den gesamten Prozess zu erfassen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Dies liegt daran , höhere Vergrößerung Ergebnisse in der Region von Interesse das Sichtfeld innerhalb von 3 verlassen - 4 h Erwerb (Video Abbildung 1). Daher besteht ein Weg, um die Abbildung des Schwanzknospe verbessern, ist eine automatische Tracking-Algorithmus zu haben, die die Gesamtbewegung des Schwanzknospe verfolgen und die x, y, z-Position des Mikroskoptisches während der Akquisition einzustellen. Gegeben hier beschrieben, um die erhöhte Stabilität des Embryos in allen axialen Abmessungen mit dem Befestigungsverfahren sollte geeignet sein, umein solcher Ansatz.

Posterioren Körper Dehnung ist ein wesentlicher Prozess bei der Embryonalentwicklung, durch die der Embryo ein großer Teil der Körperachse zu bilden, erstreckt. Es ist ein Beispiel eines komplexen morphogenetic Prozess, bei dem mehrere Zellverhalten koordinativ die Morphogenese auf der Ebene der einzelnen Gewebe zu erzeugen, wirken. Diese unterschiedlichen Gewebedeformationen dann zusammen wirken, um die Dehnung des hinteren Körpers an der gesamten Strukturebene zu erzeugen. Um zu verstehen , wie diese Prozesse werden gesteuert , und während der Entwicklung koordiniert, müssen wir in der Lage sein , diese Verfahren bei mehreren Skalen zu folgen (dh auf der Ebene von Molekülen, Zellen, Zellpopulationen und Gewebe) , und dieses an die Morphogenese der gesamten Struktur direkt zu beziehen . Zebrabärbling-Embryonen sind für die Bildgebung hintere Körperdehnung ideal als ihre optische Transparenz und die geringe Größe ermöglicht die Anwendung der minimal-invasiven Bildgebung Licht nähert sich gut für Live-Bildgebung. 1 Dieses wurde durch eine Reihe neuerer Publikationen belegt worden , die Licht auf hintere Körperentwicklung auf der Ebene von Molekülen vergossen haben, 2 Einzelzellen, 3 und inter Gewebe Verhaltensweisen, 4 sowie auf der Ebene der Zellpopulation und ganze Organ. 5 Advanced Imaging-Techniken wie konfokale Multiphotonenmikroskopie und selektive Ebene Beleuchtung Mikroskopie (SPIM) ermöglichen die langfristige Darstellung von Entwicklungsprozessen mit einer verminderten Wirkung von Licht Toxizität und Photobleaching. Robusten Techniken für die Montage von lebenden Proben benötigt werden drei Ziele zu erreichen: 1) eine ausreichende Unterstützung für das Mikroskop während der Übertragung Proben in der richtigen Ausrichtung zu halten und während der Aufnahme, 2) eine ausreichende Bewegungsfreiheit der Probe für das Auswachsen zu ermöglichen von der hintere Körperbereich ohne seine normale Entwick beeinflussenwicklung und schließlich 3) ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montageverfahrens Bildgebung auf verschiedenen Imaging-Setups zu ermöglichen. Dieses Protokoll stellt eine Montagetechnik zum Abbilden der Entwicklung der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen so dass der Kopf und yolk sac Regionen fast vollständig in Agarose enthalten, während Verlassen der posterior Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Als solches ist es auch ein geeignetes Verfahren für die Langzeit-Bildgebung von anderen Regionen des Entwicklungs Körper als die Agarose Bildgebung durch Standardlichtabbildungstechniken ermöglicht. Dieses Protokoll veranschaulicht in einer seitlichen Ausrichtung von Embryonen Befestigungs, obwohl es auch möglich ist, Embryonen in alternativen Orientierungen zu montieren. Es wird weiter zeigen, wie das Verfahren zur aufrechten, umgedreht und vertikale Lichtbogen-Mikroskopie-Setups anzupassen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35-1.5-10-C</td>
			<td>35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td>&#160;Sutter&#160;</td>
			<td>BF 120-94-10</td>
			<td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>P-715</td>
			<td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps&#160;</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&#160;</td>
			<td>11252-30&#160;</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller&#160;</td>
			<td>Sutter&#160;</td>
			<td>P97</td>
			<td>Heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 Apo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

Zebrabärbling-Embryonen bieten eine ideale experimentelle System komplexe morphogenetischen Prozesse zu untersuchen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und optische Transparenz. Insbesondere ist hintere Körperdehnung ein wesentlicher Prozess in der embryonalen Entwicklung, durch die Verformungen mehrere Gewebe zusammen, um die Bildung eines großen Teils der Körperachse zu lenken handeln. Um diesen Prozess durch langfristige Zeitraffer-Bildgebung zu beobachten, ist es notwendig, eine Montagetechnik zu verwenden, die ausreichende Unterstützung ermöglicht es, Proben in der richtigen Ausrichtung während der Übertragung an das Mikroskop und den Erwerb zu halten. Darüber hinaus muss die Montage bieten auch ausreichende Bewegungsfreiheit für das Auswachsen des hinteren Körperbereich ohne seine normale Entwicklung zu beeinflussen. Schließlich muss ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montage Methode, um Bildgebung auf verschiedenen Abbildungsaufbauten ermöglichen. Hier präsentieren wir eine Montagetechnik für die Abbildung der Entwicklung des hinteren Körpers Elongation in der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen, so dass der Kopf und Dottersack Regionen sind fast vollständig in Agarose enthalten, während das Weglassen der hinteren Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Wir werden zeigen , wie sich dies für aufrecht, umgekehrt und vertikale Lichtbogen - Mikroskopie - Set-ups angepasst werden. Während dieses Protokoll Embryonen für die Bildgebung bei der Montage für den hinteren Körper konzentriert, könnte es leicht für die Live-Bildgebung von mehreren Aspekten der Zebrabärblingentwicklung angepasst werden.

Das Protokoll oben skizzierte Details eine vielseitige Technik zur Montage von Genaktivität für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung. Ein Beispiel hierfür ist in 2A und in animierter / Video - 1 gezeigt. Die Embryonen wurden in der 1-Zell-Stadium injiziert mit mRNA, die das Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein kikumeGR kodiert. Am 15 Somiten Stadium wurden sie wie oben beschrieben montiert und für 12 h auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit einem 10X-Objektiv abgebildet wird. Die resultierenden konfokalen Stapel wurden maximal wie gezeigt projiziert angezeigt werden. Dieser Film zeigt deutlich, dass der hintere Körper frei während der gesamten Dauer des Films zu verschieben erlaubt und zeigt ähnliche Veränderungen in der Morphologie wie in Embryonen gesehen, die frei über ihre Chorion in normalen Kulturbedingungen erlaubt zu entwickeln. Ein weiteres Beispiel ist in der B ild 2B gezeigtund animierte / Video 2. Hier wurden die Embryos in der 16 Zelle injiziert Stufe mit einer Kombination von mRNAs Histon 2B-mCherry Protein (dh Etiketten , die Kerne) und eGFP: CAAX - Box (das Etiketten - Membranen, Details siehe Referenz 5). Sie wurden dann , wie in 1B schematisch dargestellt mit einem Eintauchen in Wasser 25X Ziel an einer aufrechten Multiphotonen- Mikroskop abgebildet wird . Die Bilder wurden für 3 Stunden von der 10 somite Bühne genommen, um zelluläre Verhalten während Schwanzknospen Bildung sichtbar zu machen. Die Zellen können aktive Vorsprünge und Richtungsbewegungen wie die Schwanzknospe Formen normal zu erzeugen, zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispiele für Zeitraffer-Imaging von posterior Körper Dehnung bei 10 X Vergrößerung. (A) aufeinanderfolgenden Frameseines repräsentativen Film, den Prozess der axialen Dehnung abdeckt. Embryonen werden in Seitenansicht mit posterior auf der rechten Seite des Bildes angezeigt. (B) aufeinander folgende Rahmen einer höheren Vergrößerung des Films einzelnen Zellverhalten während Schwanzknospen Bildung. Embryonen werden in Seitenansicht mit posterior nach rechts gezeigt. Die gepunkteten Linien umreißen die Bildung Schwanzknospe. Kleine farbige Linien zeigen Spuren von Kernen einzelnen Zellbewegungen zu folgen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210video1.jpg" /> Animierte / Video Abbildung 1: Zeitraffer-Film von posterior Körperdehnung eines KikumeGR mRNA injizierte Zebrabärbling Embryo durch konfokale Mikroskopie. Embryo mit anterior der linken und Poster gezeigtenior nach rechts. Die Bilder wurden in Intervallen von 10 min bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210video2.jpg" /> Animierte / Video Abbildung 2: Zeitraffer-Film von posterior Körperdehnung eines Nuklear mCherry und Membran-GFP Labelled Zebrafischembryo Abgebildete durch Zwei-Photonen - Mikroskopie. Embryo mit anterioren nach rechts und posterior auf der linken Seite gezeigt. Die Bilder wurden in 2-Minuten-Intervallen bei 25X Vergrößerung. Farbige Linien zeigen Spuren von Zellen für die letzten zehn Zeitschritte für jede Zelle verfolgt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Aufrufe.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Serie: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...