We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

Not: iş akışının şematik taslağı Şekil 1&#39;de sunulmuştur. 1. Hücreler <ol><li> Zika virüs üretimini ve viral replikasyon döngüsü analizi için Vero hücreleri kullanır. </li><li> Tam,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 birim / ml), streptomisin ihtiva eden büyüme ortamı (100 birim / ml) ve 10 mM HEPES hazırlayın. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de belirtilen tam büyüme ortamı ile kültür Vero hücreleri. </li></ol> 2. Zika Virüs Üretimi <ol><li> T-75 balonuna% 0.25 tripsin kullanılarak% 80 hücre yoğunluğunda Vero hücreleri hasat ve hücreleri saymak. <ol><li> T-75 kültür şişelerinde ortamı aspire ve 2 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkayın. </li><li> % 0.25 tripsin 2 ml ilave edilir ve 5 dakika için 37 ° C &#39;de balon inkübe edin. </li><li> Tripsin etkisiz hale getirmek için bir büyüme ortamı içeren serum 8 ml ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı suspend hücreler 15 ml tüp hücreleri transferi vb. </li><li> hücrelerin 10 ul çıkarın ve% 0.4 tripan mavisi eşit miktarda karıştırın. hücre sayım odası slayt hazırlanan karışımı yükleyin ve otomatik kan sayım cihazının kullanıldığı sayımları canlı hücre elde. </li></ol></li><li> T-160 şişesi içine 30 ml hacim içinde 7.000.000 hücre toplam tohum. </li><li> Ertesi gün, şişesi başına 10 ml serum serbest kültür ortamı Zika virüs inokulum (0.1 İçişleri Bakanlığı 0.01) enfeksiyon uygun bir çokluğu hazırlar. </li><li> T-160 şişesi harcanan Ortamı çıkarın ve taze hazırlanmış viral inoculum (10 mi) ilave edin. </li><li> 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inoküle şişeleri inkübe edin. yavaşça her saatte yan şişeleri eğerek inokulum yayıldı. </li><li> İnkübasyonun tamamlanmasından sonra, her şişenin sıcak serum desteklenmiş büyüme ortamı (30 mi) ile inokulum değiştirin. Ardından bir sonraki 96 saat boyunca viral kültür devam ediyor. </li><li> içinde ilerlemesini doğrulamaBir faz kontrast mikroskobu kullanarak ve 40X ve 200X büyütmede gerektiği gibi görüntüleri (Şekil 2) almak hücre tek tabaka viral plakların görünümünü gözlemleyerek Fection. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> Şekil 2:. Çeşitli büyütme Vero hücrelerinin bir tek tabaka üzerinde Zika virüs tarafından oluşturulmuş Plaklar Aydınlık alan ve görüntüler 48 HPI de Zika virüs plakları göstermektedir. tek tabaka yuvarlak hücre odakları varlığını unutmayın. (Ölçek çubuğu = 50 um) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="8"><li> 96 saat zaman noktasında ve santrifüj 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de süpernatan hasat hücre kültürü süpernatanları hücre debrisini uzaklaştırmak için. </li><li> Dikkatle rahatsız pelet haline enkaz ve transfer t olmadan süpernatant kaldırmak15 ml tüpler o. 24.000 xg, ultra santrifüje (isteğe bağlı), viral parçacıklar konsantre gerçekleştirilebilir. </li><li> -80 ° C &#39;de birden fazla alikotları viral kültür süpernatanlarının saklayın. </li></ol> Plak Testi ile 3. Ölçme Zika Virüs Titre <ol><li> 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 ml hacim içinde oyuk başına 1 x 10 5 hücre Tohum naif Vero hücreleri. </li><li> Ertesi gün, serumsuz ortam kullanılarak T-160 şişesi toplanan virüs kültürü yüzen maddelerinin seri seyreltil 10 kat hazırlar. Her harcanan medyayı iyi çıkarın ve üç kopya halinde Vero hücrelerinde üzerine hazırlanan inokulum 400 ul ekleyin. </li><li> 37 aşılandı şişeler inkübe 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile ° C. yavaşça her bir saatte yana plaka eğerek inokulum yayıldı. </li><li> İnkübasyonun sonunda, serum takviye ortamla inokulum (oyuk başına 2 mi) değiştirin. </li><li> 48 saat sonrası aşılama at, bir faz Contr kullanılarak viral odağını saymakast mikroskop. ml başına plak oluşturucu birim (pfu) gibi viral titresi hesaplanır. Plak analizi için Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Düzeltmek ve plakların açık bir görünüm için% 20 etanol içinde hazırlanmıştır% 4 formaldehit hücreleri ve% 0.1 kristal mor çözelti leke. </li></ol> 4. Zika Viral genom replikasyonu Deneyi <ol><li> 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 mi hacminde göz başına 1 x 10 5 hücre Tohum saf Vero hücreleri. üç kopya halinde serumsuz ortam kullanılarak, düşük ve yüksek titresi, Ertesi gün, viral inokulum (400 ul / göz, 0.01 ve 0.1 arasında MOI) hazırlanması. sahte enfeksiyon için, serumsuz ortam (400 ul / göz) kullanın. </li><li> 3.4 adımları 3.2 tekrarlayın. </li><li> 48 ve 96 saat zaman noktalarında, RNA ve immunositokimya (ICC) için numune toplayın. <ol><li> hasat RNA örnekleri için, ortamı çıkartın ve sonra lizatları iyi doğrudan her lizis çözeltisi 400 ul ekleyin ve toplamak. </li><li> ICC, medya ve t kaldırmakTavuk her bir metanolün 1 mi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> hücre lizatından, üreticinin talimatlarına göre, bir RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole eder. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA sayısal olarak. </li></ol></li><li> Hasat RNA&#39;dan ZIKV genom içeriğini belirlemek için, iki aşamalı bir ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) uygulayın. <ol><li> RNA nın ters transkripsiyonunu için, ilk olarak, 0.2 ml tüp içinde izole edilmiş RNA 5 ug, dNTP (10 mM) 1 ul, 1 ul rastgele heksamer (250 ng) içeren bir 13 ul reaksiyon karışımı ayarlayın. 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir tüp inkübe ve daha sonra bir dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, ters transkriptazın 1 ul 5x iplik sentez tamponu 4 ul 0.1 M ditiyotreitol ve 1 ul ve reaksiyon karışımı RNaz inhibitörü 1 ul ekle. 50 ° C ve inactiv 60 dakika, ardından 25 ° C&#39;de ek 5 dakika boyunca tüp inkübe15 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısıtılarak reaksiyon yedi. </li><li> qPCR 2x yeşil boya süper karışımı 12.5 ul içeren DNA polimeraz ve Zika virüsü [için Zika virüs pan-genotip primerler (spesifik 10 mM bireysel primerlerin 1 ul sonuçlanan cDNA 1 ul kullanarak gerçekleştirin: 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39; ; Rev: 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), Zika virüsü Asya genotip PRVABC59 soyu primerler (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; Rev: 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], ya da hepatit C virüsü (JFH RTQ F: 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;) için veya hücresel ev bakıcısı geni GAPDH (: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; Rev: 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;), bir 25 ul reaksiyon hacmi içinde. </li><li> çalışma durumunu 15 sn için 95 ° C, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde 30 sn (40 döngü) 60 ° C ile PCR gerçekleştirin. </li><li> Z normalleştirmek için döngü eşiğe göre (Ct) değeri GAPDH ifade düzeyini kullanmakika viral genomun ölçümü. GAPDH kıyasla Zika genomunun delta Ct (ACt) değerini hesaplayın ve 2 ACt değerini elde. Daha sonra, belirtilen zaman noktalarında enfekte olan ve olmayan hücreler arasında normalize Zika genom içerik oranı alınarak kat değişimi hesaplamak. ZIKV genom çoğaltma sonuçları için bakınız Şekil 4. </li></ol></li><li> metanol sabit hücreler kullanılarak ICC gerçekleştirin. <ol><li> (PBS içinde% 0.1 Triton-X 100,% 3 keçi serumu,% 3 BSA) 1 x PBS ile sabitlenmiş hücreler üç kez yıkayın ve ICC bloke tamponu ile bloklayın. </li><li> bloke edici tampon içinde 100 ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe: 1 seyreltme fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 (1 ug / ml) kullanın. </li><li> 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve 1 de ikincil antikor keçi anti-fare IgG-594 (1 ug / ml) ekleyin: bloke tamponu içinde 1.000 seyreltme ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edin. </li><li> Hoechst boyası kullanılarak çekirdekleri için 1x PBS ve leke hücreleri yıkayın ve100X büyütmede bir floresan mikroskop (Şekil 4) kullanarak hücrelerin gözlemleyin. </li></ol></li></ol> Zika virüs enfeksiyonuna karşı sitokin kütüphane tarama 5. <ol><li> De 12 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 1 x 10 5 hücre naif Vero hücreleri tohumu. Hücreler (6 saat Ekim sonrası) birleştirildikten sonra, biyolojik çiftleri belirtilen konsantrasyonlarda (2 ml hacim / oyuk) her bir sitokin ekleyin. Araç (PBS) tek başına kontrol içerir. </li><li> 12 saat tedavi sonrası, Zika viral enfeksiyon (kuyu başına 0.1 400 ul İçişleri Bakanlığı) gerçekleştirin. enfeksiyon (sahte) olmadan negatif kontrol kuyuları yer alır. </li><li> 4 saat sonrası enfeksiyon, sitokin muamele ortam (2 mi) ile, viral aşının değiştirin. Ek 44 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 48 saat sonrası enfeksiyon, bir faz kontrast mikroskop kullanılarak viral plaklar sayısı ve 40X büyütmede (Şekil 5) ile enfekte hücrelerin temsili görüntüler elde. </li></ol>

<ol>
	<li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li><li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Zika+Pandemic:+Enhancing+Preparedness.">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li><li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly.">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li><li>Schuler-Faccini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Association+Between+Zika+Virus+Infection+and+Microcephaly.">Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).</li><li>Foy, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus,+Colorado,+USA.">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li><li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza,+Kedougou,+and+Zika+viruses.">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li><li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li><li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report,+French+Polynesia.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li><li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013.">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere,+2015+[Letter].">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth.">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li><li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells.">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes.">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311 (2013).</li><li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome.">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li><li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy:+effects+on+fetus.">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li><li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy.">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, in vitro Zika virüsü kültürü için bir aerodinamik protokol sunulmuştur. Virüs kültürü genişleyen titresi ölçmek ve sağlanan genom replikasyonu ölçülmesi için en uygun uç noktalarının belirlenmesi de dahil olmak üzere kritik adımlar. Zika virüsü enfeksiyon ajanlarını işlerken, biyogüvenlik prosedürleri sıkı takip edilmelidir, bir insan patojeni, yani. Bir maymun böbrek hücre çizgisi, Vero çeşitli virolojik ölçümlerde göstermek için kullanılmıştır. Zika viral replikasyon kinetiği, çeşitli doku ve tür hücrelerde farklı olabilir. Daha önce tarif edildiği gibi, 15 ek hücre çizgileri de kullanılabilir. Zika virüsü bulaşmış fetus 3 beyin dokularından izole edilmiş ve kortikal nöral projenitör hücreleri 14 enfekte ettiği gösterilmiştir. Böylece, nöronal hücrelerde ZIKV enfeksiyonu patofizyoloji değerlendiren ek hücre spesifik bilgiler sağlayabilir. Afrika ve Asya genotiplerin Neurovirulent fenotip farklılıkları araştırılabilirBu bulaşıcı kültür sistemi kullanılarak. Burada tarif edilen viral üretim prosedürü, aynı zamanda, insan olmayan primat ya da kemirgen modeli sistemlerinde in vivo patojen çalışmalarına yönelik yüksek titresi virüs üretmek için yararlı olacaktır. Iken, bu çalışmada Vero hücrelerinde kullanım ile sınırlıdır, ve insan sivrisinek kökenli hücre çizgileri üretmek yüksek titre test edilebilir. CPE 3. gününde hücrelerin sadece% 10-30&#39;unda görülmektedir ise viral üretim sırasında, enfekte hücreler 1 bölünebilir: 4 yoğunluk ve kültürleme ek 4-5 gün devam edilebilir. 7. günün sonunda tam bir CPE gözlenebilir. ZIKV pan-genotip ve suşa özel primerler etkinliği karşılaştırıldığında hem düşük hem de yüksek titresi virüs enfekte edilmiş hücrelerde Zika viral genomu miktarının hassas olduğu saptanmıştır. Bundan başka, bu çalışmada, bir antikor-bazlı prob enfekte hücreleri tanımlamak için doğrulanır. Bu dsRNA&#39;nın özgü antikor başarıyla recoZika virüs ile enfekte olmuş hücrelerde gnized sitoplazmik viral genomların. Bu optimize edilmiş reaktifler gibi çeviri, genom replikasyonu, montaj ve viryon morfolojilerinden gibi viral replikasyon çeşitli aşamalarında incelemek için yararlı bir kaynak olacaktır. Bu in vitro olarak enfeksiyon, hücre kültür sistemi Tamamlayıcı DNA (cDNA) klonları elde Zika virüs özel alt genomik replikonlar ve bulaşıcı virüs kullanılarak gelecek çalışmalara uygundur. Zika, viral enfeksiyon cDNA klonlarının geliştirilmesi genetik ve moleküler biyolojik teknikler birleştirerek NS1 ve NS4B&#39;nin dahil olmak üzere viral genlerin fonksiyonel çalışma hızlandıracaktır. Bir flüoresan veya lüminesans bazlı raportör gen ile etiketlenmiş Zika virüsünün kurulması yüksek içerik tarama tahlillerinde hücre kültür sistemi kullanmak daha yapımında değerli bir araç olacaktır. Hem tip I ve tip II IFN&#39;ler anti Zika viral etkinlik sergiledi. IFN-α, IFN-β ve IFN-γ başka ev olabilirZika virüsü enfeksiyonu ile ilişkili hastalıklara karşı profilaktik sonrası maruz profilaktik ve tedavi klinik ortamlarda aluated. Zika virüsü için pozitif hamile kadınlar da dahil olmak üzere, yüksek risk grupları, tedavi ilk satırı olarak interferonlar ile tedavi edilebilir. İnterferon-α tedavisi hamile kadınlar 18,19 için güvenli olduğu gösterilmiştir. Özet olarak, Zika viral büyüme çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilen bir bulaşıcı hücre kültür sistemi tarif ve özetlenmiştir. protokol ve burada açıklanan reaktifler Zika virüs ve nörolojik araştırma topluluğu incelemek isteyenler için önemli kaynaklardır.

Zika Virüsü (ZIKV) mikrosefali ve kötü gebelik 1,4 çıktıları ile ilişkili önemli bir patojendir. ZIKV gibi Dengue, Batı Nil, ve St Louis ensefalit virüsleri gibi nörolojik bozukluklara neden olabilir tıbben ilgili flavivirüslerin kümesine aittir. Viral başlıca bulaşma ek olarak, cinsel iletim de 5,6 rapor edilmiştir, sivrisinek vektörü Aedes aegypti tarafından ve. ZIKV nedeniyle sivrisinek vektör genişleyen coğrafi dağılımı ve doğum kusurları ile güçlü korelasyon büyük bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir. ZIKV ilk Zika ormanda bir sentinel rhesus maymun 1947 yılında izole edilmiştir, Uganda ve ilk insan olgusu 1952 7,8 bildirildi. ateş, döküntü, baş ağrısı, konjunktivit ve kas / eklem ağrısı gibi hafif belirtileri olan mevcut ZIKV ile enfekte bireyler. Enfekte hamile kadınlar gelişmekte olan fetus 1&#39;e ZIKV iletebilir. ZĐKV enfeksiyonu da Guillain-Barre sendromu, periferik sinir oto-immün demiyelinasyon hastalığı 9 ile bağlantılı olmuştur. Zika viral genomun uzunluğu yaklaşık 10.8 kilobaz olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA molekülü içerir. genomun yapısı, bir protein-kodlama bölümünü eteklendiren kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCR) ile 5&#39;NCR-Cı-prM-e-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3&#39;NCR olarak düzenlenmiş 6. Tek bir poliprotein (3419 aa) o eş ve post-translasyonel 10 daha küçük peptidler halinde bölünmüş olan çevrilmiştir. 5&#39;NCR ve 3&#39;NCR RNA kök döngü yapıları Hem viral genomun çeviri ve replikasyon başlamasından kritik bir rol oynar. genomun yapısal bileşenleri kapsid, membran ve zarf proteinlerinin oluşmaktadır. yapısal olmayan proteinleri genom replikasyonu için kritik öneme sahiptir. Şu anda, Zika viral suşları üç ana genotipler ayrılır: Batı AfrikaDoğu Afrika ve Asya 6,10-13. Bu teklif edildiğini daha sonra daha 12 gelişti Batı Afrika ve Asya&#39;ya yayıldı Doğu Afrika soy. Asya genotip Amerika&#39;da mevcut salgınlar sorumludur. Zika virüsü sivrisinek ve memeli hücrelerinde hem de kültürlenebilir. Primer dermal fibroblastlar, olgunlaşmamış dendritik hücreler, kortikal nöral projenitör hücreleri, Vero hücreleri, Zika viral enfeksiyona 10,14,15 duyarlıdırlar. Hem tip I ve tip II interferonlar cilt fibroblastlar 15 ZIKV büyümesini sınırlamak için gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, bir memeli hücre kültür sistemi, üretim ve Asya genotip ZIKA virüs tipi PRVABC59 deneyleri için aşamalı bir ayrıntılı protokol sağlamak ve ilaç geliştirme ortamı olarak, bu enfeksiyon kültür sisteminin kullanılmasını göstermek için vardır. Bu kaynak büyük ölçüde daha i aydınlatmak için Zika viral ve nörolojik araştırma toplum yararına potansiyeline sahipViral patogenez ve viral virulans evrimi ts mekanizmaları.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:355px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">HEPES</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Glutamax</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red&#160;&#160;</td>
			<td style="width:355px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-054-C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Stain 0.4%</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess &#8211; Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:355px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Countess-cell counting&#160; chamber slides</td>
			<td style="width:355px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:355px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Nanodrop 2000</td>
			<td style="width:355px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&#160;</td>
			<td>English &#38; Scientific Consulting Kft.</td>
			<td style="width:119px;">10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td>A11020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SUPERSCRIPT III RT&#160;</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18080085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:355px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:119px;">4471088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:355px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Vero Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:355px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Zika viral strain PRVABC59</td>
			<td style="width:355px;">Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">IL-6</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-06&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">IL-1 alpha&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01A&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">TNF-alpha</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">300-01A&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Interferon alpha A&#160;&#160;</td>
			<td style="width:355px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Interferon beta</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Interferon gamma</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:33px;width:569px;">Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI</td>
			<td style="width:355px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Visit Nikon for Request</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons

Zika Virüsü (ZIKV), mikrosefali, göz kusurları, ve bozulmuş büyüme gibi fetal gelişim anomalileri bağlı ortaya çıkan bir patojendir. ZIKV Flaviviridae ailesinin bir RNA virüsüdür. ZIKV esas sivrisinekler tarafından iletilir, ama aynı zamanda fetal dikey geçiş yanı sıra cinsel temas için maternal tarafından yayılır. Bugüne kadar, virüs tarafından enfekte olanlar korumak için hiçbir güvenilir tedavi veya aşı seçenekleri vardır. tekrarlanabilir etkili Zika virüsü enfeksiyon hücre kültür sisteminin geliştirilmesi ZIKV çoğaltma gibi aşı ve ilaç geliştirme moleküler mekanizmalarının incelenmesi için kritik önem taşır. Bu bağlamda, virüs üretimi ve büyüme analizi için bir memeli hücresi bazlı in vitro Zika virüs kültür sistemi açıklayan bir protokol burada rapor edilmektedir. viral titresi ölçmek için bir hücre tek ve plak deneyi ile ilgili Zika virüsünün plakların oluşumu ile ilgili ayrıntılar sunulmaktadır. Viral genomun replikasyonu kinetiğive çift kollu bir RNA genomu replicatory ara belirlenir. Bu kültür platformu, interferon-a (IFN-α) tanımlanmasında ortaya çıkan küçük sitokin kümesinin bir kütüphanede karşı ekran için kullanılmıştır, IFN-β ve Zika viral büyüme potent inhibitörleri olarak, IFN-γ. Özetle, bir in vitro enfeksiyon Zika viral kültür sistemi ve çeşitli virolojik deneyler büyük ölçüde daha viral patogenez mekanizmaları ve viral virulans evrimini durulaştırmada araştırma toplum yararına potansiyeline sahip bu çalışmada, ortaya konmuştur. Antiviral IFN-alfa ayrıca enfekte hamile kadınlar da dahil olmak üzere yüksek riskli toplumlarda Zika virüs enfeksiyonları için profilaktik, maruziyet sonrası profilaktik ve tedavi seçeneği olarak değerlendirilebilir.

Bir Zika viral suşu, Asya genotip (PRVABC59 GenBank erişim numarası KU501215) Bu çalışmada 12 kullanılmıştır. % 80 birleşme Vero hücreleri de novo Zika viral enfeksiyon araştırmak için kullanıldı. Viral üretiminde ve daha sonra virolojik karakterizasyonu için, erken geçit (P3) Zika virüsü kullanılmıştır. Viral plaklar enfeksiyon ikinci gününde gözlendi. Başlangıçta enfekte olan hücre serbest Zika, viral yavrularıyla tek tabakalı kültürü (Şekil 2) görünür plakların oluşumuna neden komşu hücreler, yayılabilir. Zika viral enfeksiyonun sitopatik etki (CPE) gibi yuvarlama ve ayrılma hücrelerin hem de parçalayıcı hücre ölümü gibi morfolojik değişiklikler ile karakterizedir. viral titresi ölçülmesi için, T-160 şişelerinde hasat virüs içeren hücresiz süpernatan 10-fol tabi tutuldu veD seri seyreltme ve 12 kuyucuklu bir plaka biçiminde Vero hücreleri tek tabaka üzerine eklenir (Şekil 3). 48 saat sonra aşılama zaman noktası, ikincil enfeksiyon kaynaklanan lekeleri sayan önlemek için bir son nokta olarak kullanılmıştır. 30-100 plaklar ile kuyu doğru titreye elde etmek saymak için seçildi. RT-qPCR deney Zika virüsünün genomu çoğaltma tahmin etmek için kullanılmıştır. Son derece korunmuş ZIKV NS5 bölge için özel bir pan-genotip primer çifti 3,16 dahil edildi. pan-genotipik primerler genomik yere göre Zika virüs tipi PRVABC59 özgü primerler (primerlerinin sekansları protokolü bölüm 4.4.2 verilmektedir) de test edilmiştir. Primer çiftleri her iki enfekte olmuş hücrelerde (Şekil 4) Zika viral genomu amplifiye duyarlılık benzer seviyeleri göstermişlerdir. Bir negatif kontrol olarak, hepatit C virüsü özgü primerleri, 17 test edildi. Önemli bir artırımZIKV viral genomun içeriğine kolaylığı, düşük ve İB sağlam viral enfeksiyon öne hücreler enfekte yüksek (Şekil 4) her ikisi de 48 ve 96 saat zaman noktalarında arasında gözlenmiştir. Flavivirüs genom replikasyonu esnasında, çift sarmallı (ds), RNA replicatory ara anlamda ve anti-sens RNA, genomik arasındaki baz çiftleştirmesi oluşumu ile üretilir. Özel olarak tanıyan dsRNA için bir antikor probu, virüs tarafından enfekte hücreleri (Şekil 4) tespit edilmiştir. Viral dsRNA genom çoğaltma bölmeleri düşündüren sitoplazmada lokalize edildi. Immünsitokimya boyama 48 ve 96 saat zaman noktalarında sırasında virüs bulaşmış hücrelerin genişlemesini ortaya koymuştur. Bulaşıcı Zika virüsü kültür sistemi kullanılarak, bir sitokin küçük bir kütüphane (Şekil 5) anti-viral aktivitesini belirlemek için elenmiştir. Hücreler 12 saat boyunca farklı sitokinler ile önceden muamele edilmiş ve daha sonra Zika virüsü ile enfekte edildi. Tip I<html> IFN-α nterferon, test edilen dozlarda [10, uluslararası ünitedir (IU), 100 IU 1000 IU] geniş bir aralıkta Zika virüsüne karşı güçlü antiviral aktivite göstermiştir. IFN-β da güçlü bir inhibe edici etki göstermiştir. Tip II IFN-γ, aynı zamanda, anti-Zika viral etkinlik sergiledi. TNF-α, IL-1 ve IL-6, belirtilen ilaç konsantrasyonlarında ZIKV inhibe etmemiştir Sitokinler. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig1.jpg" /> Şekil 1:. Zika virüs üretimi ve deney akışı genel hatları virüs üretimi için, ZIKV T-160 doku kültürü şişelerinde Vero hücreleri üzerinde aşılanır. 48 veya 96 &#39;de HPI, hücre içermeyen virüs süpernatan hasat ve alt analiz için -80 ° C&#39;de saklandı. Virüs titresi sınırlayıcı seyreltme testi ile ölçülür. Zika virüsü aşı daha sonra, virüs replikasyonu kinetiği okuyan ve ilaç bileşiklerin taranması için kullanılır.= &quot;Https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot; href&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54767/54767fig3.jpg" /> Şekil 3:. Zika virüs üretimini ölçmek için bir plak deneyi Naif Vero hücreleri virüs titresi ölçmek için kullanılmıştır. Parlak alan görüntüleri çeşitli dilüsyonları (Ölçek çubuğu = 50 um) viral plakların yoğunluğunu betimliyor. Not: 1:. 100 seyreltme görüntü doğru sayılabilir farklı plaklar gösteren <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54767/54767fig4.jpg" /> Şekil 4: Zika virüs replikasyonunu değerlendirmek için deneyler. </strong&gt; (A) Grafik RT-qPCR ile ölçülen Zika virüsü genomik içeriği gösterir. Her ikisi de pan-genotip (ZIKV GEN) ve PRVABC59-suşu (ZIKV UNI) primerleri eşit duyarlılık ve özgüllük göstermiştir. Beklendiği gibi, hepatit C viral (HCV) primerleri herhangi bir ürün büyütmemiştir. (B) Grafik enfekte yalancı kontrol ile karşılaştırıldığında, düşük ve yüksek titre enfekte olmuş hücrelerde belirtilen zaman noktalarında Zika viral büyüme kinetiklerini göstermektedir. Ortalama değerleri ve standart sapmaları yer almaktadır. Viral replikasyonu araştırmak için (C) İmmünositokimya deneyi. Zika virüs enfekte edilmiş hücreler, özellikle dsRNA antikor ile boyandı. 96 HPI hücrelerin çoğu enfekte ise 48 HPI de, enfekte olmuş hücreler, birkaç kümeler halinde bulunmaktadır. Hoechst boyası çekirdeklerinin görselleştirme (Ölçek çubuğu = 50 um) için kullanılmıştır. BF:. Aydınlık alan görüntüsü <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54767/54767fig5.jpg" /> Şekil 5:. İnterferonlar güçlü bir anti-viral aktivite gösteren Zika (A) grafik, araç kontrolü ile karşılaştırıldığında çeşitli sitokinler tarafından Zika viral büyüme modülasyonu gösteren. Ortalama değerleri ve standart sapma, çubuk grafikte gösterilmiştir. İnterferonlar Zika virüs replikasyonu (p değeri &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı inhibe ettiği görülmüştür. (B ve C) veya sitokin tedavisiz Zika virüs ile enfekte olmuş hücre Faz kontrast görüntüleri. enfekte olmuş hücreler tarafından oluşturulan viral plakların odakları olarak görülebilir. interferon ile tedavi edilen kuyular viral plaklar yok unutmayın. ZIKV enfeksiyonu olmadan sahte kontrol negatif kontrol olarak dahil. (Ölçek çubuğu = 50 um) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig5large.jpg" target="_blank">bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü.

Watch this Scientific Journal Video about Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons at JoVE.com

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

20.7K Görüntüleme.  Cedars-Sinai Medical Center. Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Video: Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...