Biz Susanne Lopes Rasmussen ve Solvej Kolbjørn Jensen teknik yardım ve klinik örnekleri işleme için teşekkürler. Bu proje finansman yenilikçi ilaç girişimi 2 ortak girişim Hibe Sözleşmesi N ° 115843 altında aldı EbolaMoDRAD Konsorsiyumu bir parçasıdır. Bu ortak girişim, Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı ve EFPIA destek alır.

Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi, Başkent Bölgesi onay verdi ve tüm yöntem tanımlamak burada bir inceleme tahlil kalkınma projeleri üzerinde Danimarka yasa uyarınca etik kurul sistemi tarafından muaf.
1. virüs Inactivation ve hızlı NA çıkarma için kan toplama camlı hazırlanması
Dikkat: Bu iletişim kuralı için kullanılan arabellek guanidinium thiocyanate (GITC) ve iyonik olmayan yüzey aktif, tahriş edici içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek. Arabellek döküldü, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Önce emici doku ile dökülen tampon kadar Sil. Daha sonra ve daha sonra su ile % 70 etanol ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın.
<ol><li>Kan toplama camlı hazırlamak için belirli ticari lizis arabelleği 1.6 mL tüp 25 G x 1 iğne ve 3 mL şırınga kullanarak kapak delme tarafından 4 mL EDTA Vakum tüpün içine enjekte et. Not: vakum tüpü kapağını çıkarmak değil. Vakum muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Camlı oda sıcaklığında arabellek kullanımı kadar içeren depolar. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 yıl boyunca stabildir.</li>
</ol>2. NA çıkarılması için arabellekleri hazırlanması
<ol><li>Arabellekleri bir NA çıkarma için hazırlamak için iki 1,8 mL, iki 4.5 mL ve bir 3,6 mL tüpler bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, manyetik cam parçacıkları (MGPs) bir temiz 1,8 mL tüp ve bununla MGPs. Resuspend MGP süspansiyon tamamen pipetting önce etiket için 960 µL tarafından. Not: MGPs hızlı tüp alt kısmında toplamak için eğilimindedir.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, yıkama arabellek 4 mL ben temiz 4.5 mL tüp tarafından ve WB-1 olarak etiketleyin. Dikkat: Yıkama arabellek ben tahriş edici guanidinium klorür içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından bir temiz 3.6 mL tüp yıkama arabelleğe II 1,5 mL ve WB-2 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından yıkama arabelleğe III temiz 4.5 mL Tüp 3 mL ve WB-3 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, elüsyon arabelleği için bir temiz 1,8 mL tüp 100 µL tarafından ve EB etiketleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bölünmemeli arabellekleri kullanmak kadar saklamak. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 ay boyunca stabildir.</li>
</ol>3. kan koleksiyonundan işaret ve bir virüs enfeksiyonu olan hastalarda
Dikkat: tam kan hastadan toplarken uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak. Eldiven ve gözlük giymek. Hasta yalıtım modunda ise, Biyogüvenlik seviye 4 yordamları izleyin.
<ol><li>Hastanın intravenöz tam kan toplamak için bir kelebek iğne ile küçük uzantısı boru ve bir kan toplama vakum tüpü lizis/bağlama arabellek içeren kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru bir konumda dinlenme ve kelebek iğne alt toplama tüp getirin. Kelebek iğne hastanın damar içine yerleştirin ve kan toplama vakum tüpü küçük uzantısı ekleyebilirsiniz. Not: Bu geri akış engeller.</li>
	<li>Kan toplama sonra 5 - 10 kez tüp saygısız tüp içeriği karıştırın. Not: otomatik olarak 1.6 mL lizis/bağlama arabellek içeren kan toplama tüp kalan boşlukta nedeniyle toplanan örnek hacmi 1.6 mL olacaktır.</li>
	<li>% 70 etanol kullanarak tüp dýþýna dezenfekte.</li>
	<li>Tüpler, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Not: Protokol burada duraklatıldı ve tam kan toplama tüpler-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C veya 37 ° C en az 1 ay7için saklanabilir.</li>
	<li>Doğrudan Basitleştirilmiş NA ayıklama yönteme geçin.</li>
</ol>4. tam kan çıkarılması NA Basitleştirilmiş
<ol><li>NA lizis/bağlama arabellek inaktive toplanan kandan, mix arındırmak için vakum saygısız tarafından tüp içeriğini el ile 5-10 x tüp.</li>
	<li>Tüpün kapağı dikkatli bir şekilde çıkarın ve boşaltma kapağı.</li>
	<li>MGPs (1 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Yeni bir kapak bir kullanılmayan kan toplama tüp örnek içeren tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı olduğundan emin olun ve kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat saygısız tüp içeriğini karıştırmak için kapağı yerleştirin.</li>
	<li>Tüp manyetik tutucu içinde yerleştirin ve kapağını tüp sıkıca kapalı sağlamak için bir parmak tutmak.</li>
	<li>Tüp ile manyetik sahibi tüm MGPs tüp mıknatıs ile tarafında toplanan emin olmak için el tarafından birkaç kez çevirin. Not: Manyetik tutucu uzun bir mıknatıs ve bir lastik bant ile değiştirilebilir.</li>
	<li>Tüp kapağını kaldırmak ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak veya içeriği 50 mL toplama tüp içine dökme tarafından sadece tüp içeriğini atın. Not: 50 mL toplama tüp aerosoller kapaklı tüp kapatarak kaçının.</li>
	<li>WB-1 (4 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>Kapağı güvenli bir şekilde bir parmak ile sıkılır tutmak manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-2 (1,5 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp birkaç saniye için el ile saygısız resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-3 (3 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>EB hazır aliquot dökün (100 µL) doğrudan kan toplama tüp içine.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs EB içinde kan toplama tüp bir parmak ile 5 - 10 kez dokunarak resuspend. Not: Burada protokol duraklatılmış ve tüpler-20 ° C'de depolanan</li>
	<li>Bir damlacık (5-8 µL) resuspended MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet (herhangi bir aşağı akım tanılama NA amplifikasyon tahlil lamba/RT-lamba veya qPCR/RT-qPCR deneyleri kullanılan gibi) kullanarak aşağı akım NA amplifikasyon tepki karışıma aktarın. Not: NAs MGPs için sopa, aşağı akım NA amplifikasyon tepki MGPs kullandığınızdan emin olun. Kullanmadan önce MGP süspansiyon karıştırın. Karıştırma sonra MGPs tüp alt kısmında toplayacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood.">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li><li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015.">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li><li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease.">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve basit el ile başucu NA çıkarma yöntemi lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan virüs aşağı akım moleküler tespiti için açıklar. Açıklanan NA çıkarma yöntemi doğrudan lizis/bağlama arabellek (Tablo reçetesi)7içeren vakum kan toplama tüplerde toplanan tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen için geliştirilmiştir. Bu belirli bir arabellek EBOV7 inaktive ve yöntem kritik bileşenidir. Kan toplama sonra tam inactivation örnek sağlamak için en az 20 dk7 tüp kuluçka öneririz. Başucu EBOV inactivation BSL-4 koşulları gibi sıkı koruma koşullar altında herhangi bir EBOV pozitif örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve normal BSL-2 şartlar altında ele alınması örnekleri sağlar. Büyük olasılıkla diğer risk grubu dört patojenleri gibi Lassa virüs, Marburg virüsü ve Kırım Kongo kanamalı ateşi virüs de bu arabellek tarafından inaktive ama bu almak için kalır.
Açıklanan NA ayıklama yöntemi hastalar hastanede tecrit koğuşuna ya da bir sahra hastanesi yanında yapılması için geliştirilen ve bu nedenle, santrifüjler, Isıtma blok veya elektrik gibi hiçbir Labaratuar donanımları gerektirir. O NA çıkarma yöntemi tüpler MGPs veya yıkama arabellekleri, manyetik tutucu ve tek kullanımlık pipetler sabit bir birimi içeren gerektirir. Arabellek içeren tüpler öncesi hazırlanması protokol kolaylaştırır, çünkü pipetler gereksinimini ortadan kaldırır ve bunun yerine, bölünmemeli arabellekleri doğrudan örnek tüpler içine dökülür. Manyetik tutucu NA içeren MGPs yakalar ve yıkama adımları kolay bir kullanım aracılık eder. Bir manyetik tutucu kullanılamaz durumda manyetik tutucu sıradan bir mıknatıs ve bir lastik bant ile yerine; Ancak, manyetik tutucu tüp bırakarak ve içeriği mıknatıs ve lastik bant uygularken dökülüp, uygulamalı riskini azaltır. Lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan örnek viskozite nedeniyle, tek kullanımlık pipetler tüpünden süpernatant/sıvı/yıkama arabellekleri kaldırmak için kullanılır. Tek kullanımlık pipetler bir doğrudan tüp İçindekiler bir atık toplama tüp içine dökerek yerine ama tüp dışında herhangi bir damlacıklar yaratmak için değil unutmayın. Damlacıkları oluşturduysanız, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Bu nedenle, ilk dökülen Eğer dökülme emici bir doku ile silin. Ardından, % 70 etanol ile ve sonra bol su ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın. Bu (atık toplama tüp ve tek kullanımlık pipetler de dahil olmak üzere) lizis/bağlama arabellek ile temas oldu tüm atık içerir. Bunun yerine, ayrı bir atık konteyner tüm atık toplama ve sadece % 70 etanol kapsayıcıyla dýþýna dezenfekte.
NAS'ın normalde MGPs bir Isıtma adımı sırasında eluted ama bu Isıtma adım elektrik ve ekipman kullanımı ortadan kaldırmak için Basitleştirilmiş NA ayıklama kuralında kaldırıldı. Bu nedenle, NAs olan, bu nedenle, aşağı akım NA algılama tahlil için olumlu bir NA algılama eklemeniz gerekir MGPs sopa eğilimindedir. MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet üzerinden bir damlacık aşağı akım tepki karışımının aktarılır. Bu ek bir yüzgeci ucu pipet kullanarak normal bir ek olarak kesin değildir; Ancak, unprecise yanı sıra NA/MGPs lamba, RT-lamba, qPCR veya RT-qPCR reaksiyon karışımı değil tepki inhibe veya floresan sinyal bizim in-house teşhis tahlil etkisi. Yine de, bu tahlil tahlil farklı olabilir ve biz aşağı akım her NA test doğrulanır ve testin duyarlılığı Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi kullanarak test öneririz. NA çıkarma yöntemi nispeten duyarlı ve bir DNA veya RNA virüsü 3.000 kopya/mL kolayca ayıklanır ve aşağı akım moleküler testlerde, qPCR gibi algılanan gibi düşük içeren tam kan örnekleri var. Klinik örneklerinde viral yük bir enfeksiyon akut faz sırasında genellikle çok yüksektir ve genellikle EBOV gibi kanamalı ateşi virüsler, Lassa virüs ve Kırım Kongo kanamalı ateşi virüs, 10'dan fazla5 kopya/mL9 içeren ,10,11. Bu nedenle, virüsler Bu örneklerdeki kolayca bu NA çıkarma yöntemi kullanarak tespit edilebilir. Ancak, MPLB inactivation EBOV7, vaksinia ve ineklerde dışındaki virüs virüs8 gösterilmesini kalır.
Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi hastane yalıtım Wards veya alan ayarları'nda gerçekleştirilen ve bakım noktası moleküler teşhis için idealdir. Ancak, yöntem yüksek üretilen iş NA çekimi açık bir tüp için yakışıklı-üstünde işleme nedeniyle geçerli değildir. Yüksek işlem hacmi NA çekimi gerekiyorsa, Inaktif tam kan örnekleri, NA ayıklama robotlar7kullanarak kolayca saf. Bir diğer dezavantajı lizis/bağlama arabellek [% 20-30 Polietilen glikol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil eter ve % 30-50 guanidinium thiocyanate (GITC)]17 ve yıkama arabellek gibi zararlı kimyasalları kullanımı olduğunu ben (% 30-50 guanidinium bir akış başlık dışında açık bir tüp içinde klorür)17 . Yoğun biçimde lizis/bağlama arabellek vakum tüpü içinde ve kan 1:1 (v/v) koleksiyonu ile yer alıyor, tüp açılmadan önce konsantrasyonu azalır. Açılış vakum tüplü ve ekleme/kaldırma MGPs veya yıkama arabellek bir kaç saniye içinde gerçekleştirilir ve bu nedenle, aerosoller zehirlenmesinden riski azdır. Yıkama arabellek çıkarıldıktan sonra-ben, tüp sizden hiçbir zararlı diğer reaktifler iletişim kuralında kullanılır.
20133,6,12,13,14,15,16 EBOV patlak beri pek çok hızlı bakım noktası moleküler testleri ve aygıtlar geliştirilmiştir . Ancak, çoğu bu testler, hala bulaşıcı malzeme, BSL-3 Biyogüvenlik kabini ve Pipetler, santrifüj ve Isıtma blok veya elektrik gibi en az, bir laboratuar donanımları, bir yukarı-stream işleme gerektirir. Biyogüvenlik kabinleri kullanımını karmaşıklaştırır ve hızlı tanı uzatır. Basitleştirilmiş NA ayıklama yöntemi ile kombine virüs inactivation tüpler doğrudan koleksiyonuna kan ile açıklanan başucu virüs inactivation Biyogüvenlik kabinleri, elektrik ve laboratuvar olanakları ortadan kaldırır. Ayrıca, hastanın yanında gerçekleştirilen ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aygıt bir lamba reaksiyon ile birlikte basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi çünkü güvenli bir başucu moleküler tanı 40dakika içinde elde edilebilir.

Virüs salgını durumlarda hastaların hastane yalıtım wards veya hızlı tanı gerekli olduğunda, sınırlı zaman güvenli, basit ve doğru bakım noktası moleküler tanı hasta bakım ve risk çevreleme için zorunludur. İki son virüs salgınları, Ebola virüsü (EBOV) Batı Afrika'da (2013) ve Güney Amerika (2015), Zika virüs geliştirilmiş bakım noktası moleküler tanı testleri, Ters transkripsiyon döngü-aracılı İzotermik gibi ilgi arttı amplifikasyon (RT-lamba)1,2 ve recombinase polimeraz amplifikasyon (RPA)3,4. RT-lamba ve RPA Basitleştirilmiş örnek hazırlıkları üzerinde gerçekleştirilebilecek hızlı, hassas ve belirli moleküler testlerdir. Zika virüs için RT-lamba Zika virüs olmayan saf tam kan örneklerinde 30 dk1içinde tespit edebilen bir yanal akışı tahlil (LFA), ile birlikte; Ancak, bir risk grubu 4 patojen sınıflandırılır ve çok bulaşıcı, EBOV örnekleri Biyogüvenlik altında ele alınması gerekir 4 (BSL-4) koşulları düzey ve güvenli herhangi bir tanı yöntemleri uygulanmadan önce inaktive olur.
Örnek2,3,4,5, lizis arabellekleri eklenmesi gibi EBOV için Basitleştirilmiş inactivation yöntemleri salgını sırasında kullanılması; Ancak, bu yöntemler ile Laboratuar donanımları, BSL-3 Biyogüvenlik kabinleri, santrifüj, Isıtma blokları ve Pipetler, en azından gibi BSL-4 koşulları altında işlem gerektirir. Bu ekipman yalıtım koğuşlarında ya alan hastaneler mevcut değil normal. Bu zorluğu aşmak için bavul3' te gerçekleştirin teşhis için yapılan girişimleri ve birkaç taşınabilir cihazlar ve makineleri gelişmiş [Örneğin, nükleik asit (NA) çıkarılması için taşınabilir bir aygıta] olmuştur6. Ancak, EBOV-pozitif örnekleri hala bu cihazların kullanılabilmesi için önce inaktive gerekir.
Biz daha önce bir hızlı başucu virüs inactivation yöntemi EBOV7, vaksinia virüs ve ineklerde virüs8 için buna ek olarak bir ticari lizis/bağlama arabellek tarafından sıradan vakum kan toplama tüpler için doğrudan için izin bildirdin hastanın transfer kan inactivation arabellek7içine. Bu doğrudan ve anında inactivation kapalı bir sistem içinde BSL-4 koşullar7gibi herhangi bir sıkı koruma kullanarak örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve örnekleri normal BSL-2 şartlar altında ele alınabilir. Bu inactivation Yöntem robotlar ve el arıtma kitleri7gibi birkaç NA emme tesisleri ile uyumludur; Ancak, bu yöntemler laboratuvar donanımları, robotlar, santrifüj ve elektrik, her zaman mevcut alan ayarları veya hastane yalıtım wards değil gibi gerektirir.
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş el ile NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki moleküler tespiti için açıklar. NA çıkarma yöntemi bir mıknatıs/manyetik tutucu dışında herhangi bir donanım gerektirmez. Santrifüjler blok veya elektrik Isıtma, NA çıkarma için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler, hastane yalıtım Wards veya düşük kaynak ayarları ile) kullanılır. NA çıkarma yöntemi hızlı ve basit ve doğrudan testlerde herhangi bir aşağı akım NA, qPCR, RT-qPCR, lamba veya RT-lamba gibi kullanılabilir. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aleti ile birleştirildiğinde, başucu tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1081">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:544px;">Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td>
			<td style="width:251px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368861</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plus Blood Collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">362725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUER LOK syringe (3 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butterfly needle with small-bore extension tubing</td>
			<td style="width:251px;">J&#248;rgen Kruuse A/S</td>
			<td style="width:119px;">121714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Virkon&#160;</td>
			<td>Nomeco A/S</td>
			<td style="width:119px;">849265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">03246752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">3038505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag&#8482;-5 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette (3.5 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#8482; Samco&#8482; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

Hızlı tanı bir enfeksiyonu salgını yönetimi, risk çevreleme ve hasta bakımı için önemlidir. Biz daha önce Ebola virüsü hızlı başucu inactivation güvenli nükleik asit (NA) testleri için kan örnekleme sırasında için bir yöntem bir ticari lizis/bağlayıcı arabelleğe doğrudan vakum kan toplama tüpler içine ekleyerek göstermiştir. Bu başucu inactivation yaklaşımı kullanarak, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş başucu NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki tespiti için geliştirdik. NA çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir.
Kan lizis/bağlayıcı arabelleğe toplandıktan sonra içeriği el ile tüp lanetleme tarafından karışık ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe. Manyetik cam parçacıkları (MGPs) tüp eklenir ve içeriği el ile toplama tüp saygısız karıştırılır. MGPs sonra bir manyetik tutucu veya bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak kan toplama tüp tarafında toplanır. MGPs üç kez yıkanır ve toplama tüp içine doğrudan elüsyon arabellek eklenmesinden sonra NAs qPCR veya izotermal döngü amplifikasyon (lamba), reaksiyon gelen MGPs kaldırılması olmadan gibi NA testler için hazırız. NA çıkarma yöntemi herhangi bir laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir ve kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler ve hastane yalıtım wards) kullanılır. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir alet ile birleştirildiğinde, bir tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

Burada sunulan iletişim kuralı basit ve etkili ve geniş lizis/bağlama arabellek inaktive bulaşıcı tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen herhangi bir moleküler tahlil için uygulanabilir. Kan inactivation ve NA çıkarma için iş akışı kan toplama camlı7 (Şekil 1A), kan toplama7 (Şekil 1B), ( NA ayıklama hazırlanması da dahil olmak üzere Şekil 1' de gösterilen Rakamlar 1 c - 1 H) ve aşağı akım NA Analizi (Şekil 1I).
Basitleştirilmiş NA ayıklama Protokolü nedeniyle MGPs elüsyon adımından kaldırılmaz ve bu nedenle, NAs MGPs için sopa eğilimindedir. Herhangi bir aşağı akım moleküler analizi, qPCR veya lamba analizi, gibi doğrudan MGPs üzerinde (Şekil 1I ve Şekil 2) olumlu bir sonuç sağlamak için yapılması gerekiyor.
NA ayıklama yöntemi ile viral yük 130-3.000 kopya/mL elde edilebilir ve ya qPCR ya da RT-qPCR (Şekil 3) kullanılarak analiz gibi düşük verimli ve RNA veya DNA-virüs-pozitif tam kan örnekleri var.
NA çıkarma yöntemi, lamba veya RT-lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aygıt için virüs-pozitif tam kan örnekleri kullanarak, bir tanı kan Collection (Şekil 4) 40 dk içinde elde edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig1.jpg"> Resim 1 : İş akışı tam kan örneklerinin Basitleştirilmiş NA çıkarılması için. Bir iğne ve şırınga kullanarak lysis/bağlama arabellek vakum kan toplama tüpler(a)hazırla. (B) toplamak bir kelebek iğne kullanarak kan. (C) yer kan toplama tüp bir tutucu kapağı çıkarın ve MGPs tüpün içine dökün. (D) tüp yeni bir kapak ile kapatın ve içeriği el ile tüp saygısız karıştırın. (E) tüp manyetik tutucu saygısız tarafından kan toplama tüp tarafında MGPs toplamak. (F) Kaldır tek kullanımlık bir pipet kullanarak süpernatant. (G) yıkama veya elüsyon arabellek doğrudan kan toplama tüp içine dökün ve paneller D - Fgösterilen eylemler tekrarlayın. (H) Bu panel gösterir MGPs doğrudan kullanıma hazır bir qPCR RT-qPCR, lamba veya RT-lamba tepki. (ben) Transfer bir damlacık (5-8 µL) MGPs, 1,5 mL tek kullanımlık pipet kullanarak bir PCR veya lamba tepki tüp için. A ve Bpaneli: Bu rakam Rosenstierne ve ark. değiştirildi 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58001/58001fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig2.jpg"> Resim 2 : NA algılama 28 virüs-pozitif tam kan örneklerinin Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemiyle çıkarılan. Tam kan örnekleri (1.6 mL) test negatif bir virüs çivili için her iki DNA-virüs [Epstein - Barr virüsü (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 kopya/mL)] veya bir RNA virüsü [Hepatit C virüsü (HCV) (6.0 x 105 - 103 kopya/mL x 3.0)] ya da dang virüs (DENV) (1.7 x 108 - 1.7 x 106 kopya/mL). NAS'ın yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak elde ve ayıklanan NAs yinelenen içinde belirli şirket içi qPCR, RT-PCR, lamba veya RT-lamba, ile ya da ezelî MGPs analiz edildi. X-ekseni = NA algılama metodu, y-eksen örnekleri qPCR/lamba içinde olumlu yüzdesi =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58001/58001fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig3v2.jpg"> Şekil 3 : Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi duyarlılığını. Yöntem kavramının bir kanıtı, virüs negatif tam kan farklı RNA veya DNA virüs hazırlıklar tanımlanmış bir viral yük içeren çivili ve NAs Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak elde. (A)negatif tam kan (1.4 mL) ile 10 kat dilutions Guéckédou/Gine (2.0 x 106 kopya/mL) son patlak üzerinden hazırlanan tanılama amacıyla (ENIVD), hazırlanan EBOV standart 200 µL çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir MX3005P termal cycler kullanma bir kurum içi EBOV özgü RT-qPCR7 tarafından analiz edildi. (B) tam kan (1.2 mL) bir HCV kim standart serum örneği 10 kat dilutions 400 µL ile çivili (1.2 x 106 IU/mL). Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house HCV özgü RT-MX3005P termal cycler kullanarak qPCR tarafından analiz edildi. (C) tam kan (1.2 mL) 400 µL EBV (2.0 x 104 kopya/mL, 8,0 103 kopya/mL x, 103 kopya/mL x 2.7 ve 9,3 x 102 kopya/mL) farklı konsantrasyonları ile çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house EBV özel qPCR tarafından analiz edildi. (D) tam kan (1.2 mL) ile 10 kat dilutions BK virüs (1.3 x 104 kopya/mL) 400 µL çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house BK özel qPCR tarafından analiz edildi. X-ekseni (kopya/mL veya IU/mL), çivili tam kan örneğinde bir virüs son konsantrasyonu = y-eksen Ct-değeri (ortalama ± SD) =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58001/58001fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58001/58001fig4v2.jpg"> Şekil 4 : Basitleştirilmiş NA çekme ve RT-lamba ya da lamba izotermal bir taşınabilir aygıtta. (A)EBOV-pozitif tam kan örnekleri bölümü virüs & mikrobiyolojik özel tanılama, Serum Institut stats, Danimarka olmaması nedeniyle negatif tam kan 1.4 mL EBOV farklı dilutions 200 µL ile çivili yapıldı. tanılama amacıyla (ENIVD) hazırlanan standart. Çivili örnekleri Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak bir NA çıkarma yapıldı ve EBOV özgü RT-lamba reaksiyon tarafından analiz edildi. Bir negatif kontrol, bir negatif tam kan örneği dahil edildi. X-eksen EBOV son konsantrasyonu çivili tam kan örneğinde (kopya/mL), y=-eksen pozitif için min =. (B) kavramının bir kanıtı için tam kan (1.6 mL) aliquots 7 hastalardan tanısı olumlu EBV (13.000-500 kopya/mL) virüs bölümü & mikrobiyolojik özel tanılama, Serum Institut stats, Danimarka, için bir NA uygulandı Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak ayıklama ve taşınabilir pil tahrik Genie II izotermal aygıtta EBV özel lamba reaksiyon tarafından analiz edildi. Bir negatif kontrol türedi B19-pozitif örnek dahil edildi. X-ekseni EBV viral yük bir hasta örneğinde (kopya/mL), y=-eksen pozitif için min =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58001/58001fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K Görüntüleme.  Statens Serum Institut. Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Video: Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em&gt; Trichinella</emKas Samples&gt; Larva

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...