We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

注：作業の流れの模式的な概要を図1に示されています。 1.細胞<ol><li>ジカウイルスの産生およびウイルス複製サイクルの分析のためのVero細胞を使用してください。 </li><li>完全な10％ウシ胎児血清（FBS）を含む増殖培地、2mMのL-グルタミン、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100単位/ ml）、および10mM HEPESを準備します。 </li><li> 5％CO 2で37℃で指定の完全増殖培地で培養Vero細胞。 </li></ol> 2.ジカウイルスの生産<ol><li> T-75フラスコ中の0.25％トリプシンを用いて80％の細胞密度でVero細胞を採取し、細胞を数えます。 <ol><li> T-75培養フラスコから培地を吸引し、2mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。 </li><li> 0.25％トリプシンの2ミリリットルを加え、37℃で5分間フラスコをインキュベートします。 </li><li>トリプシンを不活性化するために、増殖培地を含む血清の8ミリリットルを追加します。上下SUSにピペット保留細胞を15mlチューブに細胞を移すと。 </li><li>細胞の10μLを削除し、0.4％トリパンブルーの同量と混合。細胞計数チャンバースライドにプレミックスをロードし、生存細胞は自動細胞カウンターを用いてカウントし得ます。 </li></ol></li><li> T-160フラスコに30ミリリットルボリューム7万個の細胞の合計をシード。 </li><li>翌日、フラスコ当たり10ミリリットルの無血清培地中でジカウイルス接種物（0.1 MOI 0.01）感染症の適切な多重度を準備します。 </li><li> T-160フラスコから使用済み培地を外し、新たに調製したウイルス接種（10ミリリットル）を追加します。 </li><li> 4-6時間、5％CO 2で37℃で接種したフラスコをインキュベートします。静かにすべての時間で横向きにフラスコを傾けることによって、接種物を広げます。 </li><li>インキュベーションの終了時に、各フラスコのために暖かい血清添加増殖培地（30ml）で接種材料を交換してください。その後、次の96時間のためにウイルス培養を続けます。 </li><li>での進行を確認します位相差顕微鏡を使用し、40Xおよび200X倍率での必要に応じた画像（ 図2）を取る細胞単層にウイルスプラークの出現を観察することによりフェクション。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> 図2：様々な倍率のVero細胞の単層上ジカウイルスによって形成されたプラーク明視野画像は48 HPIでZikaウイルスプラークを示します。単分子膜上の丸い細胞病巣の存在に注意してください。 （スケールバー= 50μm）は<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="8"><li>収穫細胞培養上清を96時間の時点で、細胞破片を除去し、4℃で10分間、300×gで上清を遠心。 </li><li>慎重にペレット化破片や転送トンを乱すことなく上清を除去し15ミリリットルチューブO。 24,000×gで超遠心分離（オプション）は、ウイルス粒子を濃縮するために行うことができます。 </li><li> -80℃で複数のアリコート中のウイルス培養上清を保管してください。 </li></ol> 3.プラークアッセイによってジカウイルスの力価を測定<ol><li> 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの体積でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。 </li><li>翌日、無血清培地を使用して、T-160フラスコから採取したウイルス培養上清の10倍連続希釈液を準備します。各ウェルから使用済み培地を取り出して、三重にVero細胞上に準備された接種物の400μlを添加します。 </li><li> 37で接種したフラスコをインキュベート 4-6時間、5％CO 2とC°。優しくごとに1時間で横向きプレートを傾けることによって接種材料を広げます。 </li><li>インキュベーションの終わりに、血清添加培地（ウェル当たり2ml）で接種材料を交換してください。 </li><li> 48時間後の接種では、位相CONTRを用いてウイルス増殖巣を数えますAST顕微鏡。 1ml当たりのプラーク形成単位（P​​FU）のようなウイルス力価を計算します。プラークアッセイのために、図3を参照してください。 </li><li>修正プラークの明確な可視化のために20％エタノール中で調製した4％ホルムアルデヒドで細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液を染色します。 </li></ol> 4. Zikaウイルスゲノム複製アッセイ<ol><li> 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの容量でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。三重で無血清培地を用いて、低および高力価の、次の日、ウイルス接種物（400μL/ウェル0.01および0.1のMOI）を準備します。モック感染のために、無血清培地（400μL/ウェル）のみを使用します。 </li><li> 、手順3.4から3.2を繰り返します。 </li><li> 48および96時間の時点で、RNAおよび免疫細胞化学（ICC）のためのサンプルを収集。 <ol><li>収穫RNAサンプルについては、各ウェルに直接溶解溶液の400μlを添加し、溶解物を収集し、メディアを削除します。 </li><li> ICCのために、メディアおよびトンを削除鶏は、各ウェルに1mlのメタノールを添加することにより細胞を固定し、4℃で30分間プレートをインキュベートします。 </li><li>細胞溶解物から、製造者の指示に従ってRNA単離キットを用いて全RNAを単離します。分光光度計を用いてRNAを定量化します。 </li></ol></li><li>回収RNAからZIKVゲノムコンテンツを決定するために、二段階逆転写定量的PCR（RT-qPCRの）を実行します。 <ol><li> RNAを逆転写するために、最初の0.2ミリリットルチューブ内で単離されたRNAの5μgの、dNTPの1μL（10 mM）の、および1μlのランダムヘキサマー（250 ngの）から成る13μlの反応ミックスを設定します。 65℃で5分間チューブをインキュベートした後、1分間氷の上に置きます。続いて、逆転写酵素を1μl、5×鎖合成バッファー4μlの、0.1 Mジチオスレイトールの1μlを、反応ミックスにRNase阻害剤の1μlを添加します。 50℃、inactivで60分間、続いて25℃でさらに5分間チューブをインキュベート15分間70℃に加熱することにより反応を食べました。 </li><li> 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39;：DNAポリメラーゼおよびジカウイルスのための特定の10mM1μlの個々のプライマーについて[ジカウイルスパン-遺伝子型プライマーを（含む2倍の緑色の色素スーパーミックス12.5μlの得られたcDNAの1μLを使用して定量PCRを実行します; REV：5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;）、ジカウイルスアジア遺伝子型PRVABC59株プライマー（5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; REV：5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;）]、またはC型肝炎ウイルス（JFH RTQ F：5 「CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R：5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;）、またはのための細胞のハウスキーピング遺伝子GAPDH（5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3&#39;; REV：5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3 &#39;）、25μlの反応体積です。 </li><li>リアルタイムPCRシステムでは30秒15秒、60°C（40サイクル）の実行条件95°Cを用いてPCRを行います。 </li><li> Zを正規化するために、サイクル閾値（Ct）値に基づいて、GAPDH発現レベルを使用ウイルスゲノムの測定IKA。 GAPDHのそれと比較しZikaゲノムのデルタCT（のΔCt）値を計算し、2 のΔCt値を得ます。そして、指示された時点で、感染及び非感染細胞との間の正規化されたZikaゲノムコンテンツの比率を取ることによって、倍率変化を計算します。 ZIKVゲノムの複製の結果については、 図4を参照してください。 </li></ol></li><li>メタノール固定した細胞を使用してICCを実行します。 <ol><li> （PBS中0.1％のTriton-X 100、3％ヤギ血清、3％BSA）1×PBSで固定した細胞を3回洗浄し、ICCブロッキング緩衝液でブロックします。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で100と4℃で一晩インキュベート：1の希釈でマウスモノクローナル抗のdsRNA抗体J2（1μg/ ml）を使用してください。 </li><li> 1×PBSで細胞を洗浄し、1で二次抗体ヤギ抗マウスIgG-594（1μg/ ml）を追加しますブロッキングバッファー1,000希釈し、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>ヘキスト染料を使用して、核のために1×PBSおよび染色で細胞を洗浄し、100Xの倍率で蛍光顕微鏡（ 図4）を用いて細胞を観察します。 </li></ol></li></ol> 5.ジカウイルス感染に対するサイトカインライブラリをスクリーニング<ol><li> 12ウェルプレートを使用してあたり1×10 5個の細胞をナイーブVero細胞を播種します。細胞は（6時間後に播種）添付されると、生物学的重複で指示された濃度（2ミリリットル容量/ウェル）で各サイトカインを追加します。車両（PBS）単独の対照を含めます。 </li><li> 12時間後処理では、Zikaウイルス感染（ウェル当たり400μlの0.1のMOI）を行います。感染症（モック）なしの陰性対照ウェルを含めます。 </li><li> 4時間後の感染では、サイトカイン処理されたメディア（2ミリリットル）とのウイルス接種を交換してください。追加の44時間、37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 48時間の感染後に、位相差顕微鏡を用いてウイルスプラークをカウントし、40倍の倍率（ 図5）で感染させた細胞の代表的な画像を取得します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li><li>Lucey, D. R., Gostin, L. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus,+Colorado,+USA.">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li><li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza,+Kedougou,+and+Zika+viruses.">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li><li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li><li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report,+French+Polynesia.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li><li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013.">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere,+2015+[Letter].">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth.">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li><li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells.">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes.">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311 (2013).</li><li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome.">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li><li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy:+effects+on+fetus.">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li><li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy.">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、in vitroでジカウイルスを培養するための合理化されたプロトコルが提示されます。含む、ウイルス培養を拡大するための最適なエンドポイントを識別し、力価を測定し、ゲノムの複製を定量化する重要なステップを提供しました。ジカウイルスは、感染性物質の処理中に、生物学的安全手順が厳密に従うべきであり、人間の病原体である、そう。サル腎臓細胞株、ベロは、様々なウイルス学的アッセイを実証するために使用しました。 Zikaウイルス複製の動態は、様々な組織や種の細胞で異なる場合があります。先に説明したように15の追加の細胞株を使用することができます。ジカウイルスは、感染した胎児3の脳組織から単離された皮質神経前駆細胞14に感染することが示されています。このように、神経細胞にZIKV感染の病態生理を評価するには、追加の細胞特異的な洞察を提供することができます。アフリカやアジアの遺伝子型の神経毒性表現型の違いを調べることができますこの感染培養系を使用して。ここに記載のウイルス製造手順は、非ヒト霊長類またはげっ歯類モデル系におけるin vivo病原性の研究に向けて高力価ウイルスを生成するために有用であろう。 本研究ではVero細胞の使用に限定され、一方、ヒトおよび蚊由来の高力価産生細胞株を試験することができます。 CPEは、3日目に、細胞のわずか10〜30％で観察された場合、ウイルス生産の間、感染細胞を1に分割することができる：4密度培養は、さらなる4~5日間継続することができます。 7 日目の終わりには、完全なCPEを観察することができます。 ZIKVパン-遺伝子型と株特異的プライマーの効率を比較し、両方が低く、高力価のウイルス感染細胞にZikaウイルスゲノムを定量化する中で敏感であることを決定しました。さらに、本研究では、抗体に基づくプローブは、感染した細胞を同定するために検証されます。このdsRNA特異的な抗体に成功RECOジカウイルス感染細胞における細胞質ウイルスゲノムをgnized。これらの最適化された試薬は、翻訳、ゲノムの複製、アセンブリおよびビリオンの形態形成などのウイルス複製の様々な段階を分析するための有用なリソースとなります。 このインビトロ感染細胞培養系は、ジカウイルス特異的サブゲノムレプリコンを使用して、将来の研究および相補的DNA（cDNA）クローンから生成された感染性ウイルスに適用可能です。 Zikaウイルスの感染性cDNAクローンの開発は、遺伝的および分子生物学的手法を組み合わせることにより、NS1、およびNS4Bを含むウイルス遺伝子の機能研究を加速していきます。蛍光または発光ベースのレポーター遺伝子は、さらに、高含有量スクリーニングアッセイで細胞培養系を使用して製造するのに貴重なツールになるでタグ付けジカウイルスの確立。 両方のI型およびII型IFNは、抗Zikaウイルス活性を示しました。 IFN-α、IFN-βおよびIFN-γは、さらにEVすることができますジカウイルス感染症と関連疾患の予防、後露光、予防、および治療などの臨床現場でaluated。ジカウイルスについて陽性妊婦を含む高リスク群では、治療の最初の行としてインターフェロンで処理することができます。インターフェロンα治療は、妊婦18,19のために安全であることが示されています。 要約すると、Zikaウイルス増殖の様々な側面を研究するために使用することができる感染細胞培養系を記載し、概説されています。ここで説明されたプロトコルおよび試薬は、ジカウイルスおよび神経学的研究コミュニティを研究する人のための重要な資源です。

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、貧しい妊娠1,4を成果に関連した重要なヒト病原体です。 ZIKVは、デング熱、西ナイル、セントルイス脳炎ウイルスなどの神経学的欠陥を引き起こす可能性が医学的に関連するフラビウイルスのセットに属します。ウイルス伝播の主なモードに加えて、性行為も5,6報告されている、蚊ベクターネッタイシマカによるものである、と。 ZIKVが原因蚊ベクトルの拡大地理的分布と先天性欠損症との強い相関関係に世界の主要な健康問題となっています。 ZIKVが最初Zika林におけるセンチネルアカゲザルから1947年に単離された、ウガンダ、最初の人間の場合は1952 7,8で報告されました。発熱、発疹、頭痛、結膜炎、および筋肉/関節痛などの軽度の症状を示すZIKVに感染する個人。感染した妊婦は胎児1にZIKVを送信することができます。 ZIKV感染はまた、ギラ ​​ン・バレー症候群、末梢神経自己免疫脱髄障害9に関連しています。 Zikaウイルスゲノムは、長さが約10.8キロベースであるプラスセンス一本鎖RNA分子から成ります。ゲノムの構造は、タンパク質コード領域に隣接する非コード領域（NCR）と、5&#39;NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCRとして編成されています6。単一のポリタンパク質（3419 AA）はコポリマーおよび翻訳後10より小さなペプチドに切断されている翻訳されています。 5&#39;NCRと3&#39;NCR RNAステム - ループ構造の両方は、ウイルスゲノムの翻訳および複製の開始に重要な役割を果たしています。ゲノムの構造部品はキャプシド、膜およびエンベロープタンパク質で構成されています。非構造タンパク質は、ゲノム複製のために重要です。 現在、Zikaウイルス株は、3つの主要な遺伝子型に分類されます。西アフリカ、東アフリカ、そしてアジア6,10-13。それは、後にさらに12を進化させ西アフリカとアジア、に東アフリカ系統普及ことが提案されています。アジアの遺伝子型は、アメリカの現在の集団発生の原因です。ジカウイルスは、蚊及び哺乳動物細胞の両方において培養することができます。一次皮膚線維芽細胞、未熟樹状細胞、皮質神経前駆細胞、およびベロ細胞がZikaウイルス感染10,14,15を受けやすいです。両方のI型およびII型インターフェロンは、皮膚線維芽細胞15でZIKV成長を抑制することが示されています。この研究の目的は、哺乳動物細胞培養系におけるアジア遺伝子型ZIKAウイルス株PRVABC59の産生およびアッセイのための段階的な詳細なプロトコルを提供し、薬剤開発プラットフォームとしてこの感染培養系の有用性を実証することです。このリソースは大幅にさらに私を解明するZikaウイルスおよび神経学的研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めていますウイルスの病原性のウイルスの病原性と進化のtsのメカニズム。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:355px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">HEPES</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Glutamax</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red&#160;&#160;</td>
			<td style="width:355px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-054-C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Stain 0.4%</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess &#8211; Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:355px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Countess-cell counting&#160; chamber slides</td>
			<td style="width:355px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:355px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Nanodrop 2000</td>
			<td style="width:355px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&#160;</td>
			<td>English &#38; Scientific Consulting Kft.</td>
			<td style="width:119px;">10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td>A11020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SUPERSCRIPT III RT&#160;</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18080085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td>
			<td style="width:355px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:355px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:119px;">4471088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:355px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Vero Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:355px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Zika viral strain PRVABC59</td>
			<td style="width:355px;">Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">IL-6</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-06&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">IL-1 alpha&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01A&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">TNF-alpha</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">300-01A&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Interferon alpha A&#160;&#160;</td>
			<td style="width:355px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Interferon beta</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:569px;">Interferon gamma</td>
			<td style="width:355px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:33px;width:569px;">Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI</td>
			<td style="width:355px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Visit Nikon for Request</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、眼の欠陥、および成長障害などの胎児の発育異常にリンクされている新興病原体です。 ZIKVは、 フラビウイルス科のRNAウイルスです。 ZIKVは主に蚊によって送信されるだけでなく、胎児の垂直感染への母体だけでなく、性的接触によって広げることができます。現在までに、ウイルスに感染したものを保護するために利用可能な信頼性の高い治療法やワクチンのオプションがありません。再現性のある、効果的なジカウイルス感染細胞培養系の開発はZIKV複製だけでなく、薬物およびワクチン開発の分子メカニズムを研究するために重要です。この点で、ウイルス産生および増殖の分析のために哺乳動物細胞に基づくインビトロジカウイルス培養系内を記述するプロトコルはここで報告されます。ウイルス力価を測定するための細胞単層およびプラークアッセイにジカウイルスによってプラークの形成の詳細が提示されています。ウイルスゲノムの複製動態二本鎖RNAゲノムreplicatory中間体が決定されます。この培養プラットフォームはZikaウイルス増殖の強力な阻害剤として、インターフェロン-α（IFN-α）、IFN-βおよびIFN-γの識別結果としてのサイトカインの小さなセットのライブラリーに対してスクリーニングするために利用されました。要約すると、in vitroでの感染Zikaウイルス培養系と様々なウイルス学的ア ​​ッセイが大きく、さらにウイルスの病原性とウイルスの病原性の進化のメカニズムの解明に研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めているこの研究で実証されています。抗ウイルスIFN-αは、さらに感染した妊婦を含む高リスク集団におけるジカウイルス感染症の予防、露光後、予防、および治療の選択肢として評価することができます。

Zikaウイルス株（PRVABC59; GenBank登録番号KU501215）アジア遺伝子型のは、この研究12で使用しました。 80％コンフルエントでVero細胞をデノボ Zikaウイルス感染を調べるために使用しました。ウイルス産生およびその後のウイルス学的特徴付けのために、初期継代（P3）ジカウイルスを用いました。ウイルスプラークは、感染の二日目に観察されました。最初に感染した細胞から放出さZikaウイルス子孫は、単層培養（ 図2）上に表示斑の形成をもたらし、隣接するセルに分散させることができます。 Zikaウイルス感染の細胞変性効果（CPE）は、このような細胞ならびに溶解性の細胞死の丸めや剥離などの形態学的変化によって特徴付けられます。 ウイルス力価を測定するために、T-160フラスコから回収したウイルスを含有する無細胞上清を、10-FOLに供しましたD段階希釈し、12ウェルプレートフォーマットでVero細胞の単層に添加した （ 図3）。 48時間後、接種の時点は、二次感染から生じるプラークをカウント避けるために、エンドポイントとして使用しました。 30-100プラークを有するウェルを正確力価を得るために、計数のために選択しました。 RT-qPCRのアッセイは、ジカウイルスのゲノムの複製を推定するために利用されました。高度に保存されたZIKV NS5領域に特異的な汎遺伝子型プライマー対は3,16が含まれていました。汎遺伝子型プライマー（プライマーの配列は、プロトコルセクション4.4.2に記載されている）のゲノム上の位置に基づいてZikaウイルス株のPRVABC59特異的プライマーをも試験しました。プライマー対の両方が、感染した細胞（ 図4）からZikaウイルスゲノムの増幅に感度の同様のレベルを示しました。陰性対照として、C型肝炎ウイルス特異的プライマーはまた、17を試験しました。重要なINCRZIKVウイルスゲノムコンテンツに容易に低MOIは堅牢ウイルス感染を示唆し、感染細胞の高い（ 図4）の両方で48および96時間の時点の間で観察されました。フラビウイルスゲノムの複製の間に、二本鎖（ds）RNA replicatory中間体は、センスおよびアンチセンスゲノムRNAとの間の塩基対の形成によって生成されます。特異的に認識するdsRNAのための抗体プローブは、ウイルス感染細胞（ 図4）を検出しました。ウイルスdsRNAは、ゲノムの複製コンパートメントを示唆する細胞質に局在していました。免疫細胞化学染色は、48および96時間の時点の間に、ウイルス感染した細胞の拡大を明らかにしました。 感染ジカウイルス培養系を使用して、サイトカインの小さなライブラリーを抗ウイルス活性（ 図5）を決定するためにスクリーニングしました。細胞を、12時間、種々のサイトカインで前処理した後、ジカウイルスを感染させました。タイプI I<html> nterferon、IFN-αは、試験した用量[10国際単位（IU）、100 IU 1,000 IU]の広い範囲にジカウイルスに対して強力な抗ウイルス活性を示しました。 IFN-βは、同様に強力な阻害効果を示しました。 II型IFN-γは、抗Zikaウイルス活性を示しました。 TNF-αのサイトカイン、IL-1及びIL-6は、指示された薬物濃度でZIKVを阻害しませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig1.jpg" /> 図1：。 ジカウイルス産生およびアッセイのワークフローの概要ウイルス産生のためには、ZIKVは、T-160組織培養フラスコ中でVero細胞に接種されます。 48または96 HPIで、無細胞ウイルス上清を回収して、下流の分析のために-80℃で保存しました。ウイルス力価は、限界希釈アッセイによって測定されます。ジカウイルス接種物は、その後、ウイル​​ス複製の動態を研究し、薬剤化合物をスクリーニングするために使用されます。href = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig3.jpg" /> 図3：。 ジカウイルス産生を測定するためのプラークアッセイナイーブVero細胞をウイルス力価を測定するために使用しました。明視野画像は、種々の希釈（スケールバー=50μm）をでウイルスプラークの密度を示しています。注：1：100希釈の画像を正確にカウントすることができる明確なプラークを示し<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig4.jpg" /> 図4： ジカウイルスの複製を評価するためのアッセイ。 </strong&gt;（A）のグラフは、RT-qPCRにより測定さジカウイルスゲノムの内容を示しています。汎遺伝子型（ZIKV GEN）とPRVABC59-株（ZIKV UNI）プライマーの両方が同等の感度と特異性を示しました。予想されるように、C型肝炎ウイルス（HCV）プライマーは、任意の産物を増幅しませんでした。 （B）のグラフは、感染していないモック対照のそれに比べて低いと高力価感染した細胞中で示された時点でZikaウイルスの増殖速度を示します。平均値と標準偏差が与えられています。 （C）は、ウイルスの複製を調査するための免疫細胞化学分析。ジカウイルス感染細胞を特異的dsRNAを抗体で染色しました。 96 HPIで細胞のほとんどが感染しているのに対し、48 HPIで、感染した細胞は、いくつかのクラスタです。ヘキスト染色は、核の可視化（スケールバー= 50ミクロン）のために使用しました。 BF：明視野像。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig5.jpg" /> 図5： インターフェロンは強力な抗Zikaウイルス活性を実証するには、（A）のグラフは、ビヒクル対照と比較し、様々なサイトカインによりZikaウイルスの増殖の調節を示します。平均値と標準偏差をバ​​ーグラフに示されています。インターフェロンは、ジカウイルス複製（p値&lt;0.05）の統計的に有意な阻害を示しました。 （BおよびC）を有するまたはサイトカイン治療なしジカウイルス感染細胞の位相差画像。感染した細胞によって形成されたウイルスプラークは、病巣として見ることができます。インターフェロン処理したウェルは、ウイルスプラークを持っていないことに注意してください。 ZIKV感染なしのモックコントロールは、陰性対照として含まれています。 （スケールバー=50μm）を<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54767/54767fig5large.jpg" target="_blank">大きく表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のバージョン。

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Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

20.7K ビュー.  Cedars-Sinai Medical Center. Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

免疫・感染学

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

ジカ特定診断エピトープの探索

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...