Biz Refakatçi deneyleri onu yararlı tavsiyeler Dr. Claudia Cremers teşekkür ederim. Ken Wan HdeB saflaştırma onun teknik yardım için kabul edilmektedir. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından sağlanan bir doktora sonrası araştırma bursu ile desteklenmektedir (JCAB için) Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve JCAB ve UJJ-UD Sağlık hibe RO1 GM102829 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. Ekspresyonu ve periplazmik HdeB saflaştırılması Not: HdeB E. ifade edildi polimiksin lizizi sonrasında periplazma plazmid pTrc- hdeB 10 ve saflaştırılmış barındıran E. coli hücreleri. <ol><li> E. bir gecede kültürü hazırlayın 200 ug / ml ampisilin (LB Amp) içeren 30 ml LB plazmidden pTrc- hdeB 10 barındıran E. coli hücreleri. 0.7 OD 600nm ulaşılana kadar LB Amp dört adet 1 L kültürlerinin aşılanması ve 37 ° C &#39;de büyümek ve 200 rpm&#39;de. Daha sonra, HdeB ifadesinin sağlanması ve 30 ° C&#39;ye kadar bir büyüme sıcaklığı azaltmak için 300 uM IPTG ilave edin. </li><li> 30 ° C&#39;de protein ekspresyonu 5 saat sonra, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 8000 x g&#39;de Hücreler tekrar A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCI, pH 7.5) ve santrifüj ml tampon 100 hücre pelletini yıkayın. </li><li> Daha sonra, tekrar süspansiyon80 hücre peleti mi, 1 mg / ml polimiksin sülfat içeren bir tampon. Dış membran etkin bozulması için, hafifçe 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile süspansiyon karıştırılmıştır. </li><li> sitoplazmik bölümünü ve hücre artıkları çıkarmak için 4 ° C&#39;de 15,000 x g&#39;de 20 dakika süre ile süspansiyon santrifüj. Bu ~ çözünür HdeB ihtiva eden 60 ml süpernatant sonuçlanır. </li><li> 6 kDa MW bir diyaliz membranı kullanılarak B tamponu (20 mM Tris / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) 150X birim karşı gece boyunca periplazmik özü ihtiva eden üst sıvıyı Dialyze cut-off. 3 kDa&#39;lık bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanarak 15 ml proteinleri konsantre edilir. 0.2 mikron gözenek filtre kullanarak protein çözüm Filtre. </li><li> 2.5 ml / dakika bir akış oranı ile 5 kolon hacmi tampon B ile dengelenmiş olan bir anyon değiştirme kromatografisi kolonuna (kolon hacmi 5 mi) üzerine protein uygulanır. Protein kolonuna yüklenir sonra, 10 dakika ile için tampon B ile sütun yıkama/ Dakika 2.5 ml&#39;lik bir akış oranı. 2.5 mL / dakika 6 bir akış oranı ile 50 dakika arasında bir zaman süresi içinde tampon B içinde 0.5 M NaCI, 0 ila bir doğrusal gradyan ile elüte HdeB. </li><li> % 15 SDS-PAGE kullanılarak HdeB ihtiva eden fraksiyonlar tanımlar. 5 ul 5x indirgenmiş SDS yükleme tamponu ile 20 ul örnek karıştırın. Yük 10 jel üzerine ul Tris-glisin tamponu (14.4 g / L glisin, 2.9 g / L Tris, 1 g / L sodyum dodesil sülfat, pH 8.3) &#39;de çalışır. Bromophenol bant jel (~ 45 dk) tabanına yakın göç kadar 150 V jel çalıştırın. </li><li> Havuz Tüm HdeB içeren fraksiyonlar, 4 L HdeB depolama tamponuna karşı gece boyunca 4 ° C&#39;de diyalize (50 mM Tris / HCI, 200 mM NaCI, pH 8.0) ve bir moleküler ağırlığa sahip santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 300 uM proteini konsantresi cut-off 3 kDa. Sönümleme katsayısı ε 280nm = 15595 M kullanılarak 280 nm&#39;de HdeB konsantrasyonunu belirlemek -1 cm -1. 100 ul hacimde ve flaş ücretsiz hazırlayınsıvı azotta ze. Not: HdeB en az 6 ay boyunca -70 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 2. Şaperon Aktivite Deneyi Malat Dehidrogenaz Unfolding Termal Kullanma (MDH) Not: termal farklı pH değerlerinde domuz mitokondriyal malat dehidrojenaz (MDH) açılma agregasyonu üzerinde saflaştırıldı HdeB etkisi aşağıda tarif edildiği gibi gözlenmiştir. Listelenen tüm protein konsantrasyonları monomer konsantrasyonunun bakın. <ol><li> MDH hazırlanması için, bir gece boyunca 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı 4 ° C&#39;de diyaliz MDH ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 100 um proteini konsantresi kDa. NOT: MDH amonyum sülfat çözeltisi olarak teslim edilir olarak MDH dikkatli diyaliz gereklidir. </li><li> birikimlerin çıkması için, 4 ° C&#39;de 20,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj protein. ε &lt;(280 nm&#39;de absorbans ile MDH konsantrasyonunu belirleyinalt&gt; 280 nm = 7,950 M-1 cm-1). MDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma. </li><li> Sıcaklık kontrollü numune tutucu ve bir karıştırıcı ile donatılmış bir floresan spektrofotometrede 1 ml kuartz küvet yerleştirin. Set λ eski / em 350 nm. </li><li> küvete ve ayarlamak için: (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde önceden ısıtılmış (43 ° C) tampon D (150 mM potasyum fosfat, 150 mM NaCl), uygun hacimleri ekleme 43 ° C&#39;ye kadar bir küvet taşıyıcısına sıcaklık. toplam hacmi 1000 ml. </li><li> 0.5 uM MDH ilave edildi tampon 12.5 uM HdeB (ya da seçenek olarak bir tampon kontrol HdeB depolama, aynı hacimde tampon) ekleyin. ışık saçılması izleme başlayın. MDH açılma yeterli olacak şekilde 360 ​​saniye boyunca reaksiyon inkübe edin. </li><li> HPO 4 2 M tamponsuz K 2 0,16-0,34 hacmi eklenerek 7 pH değerini arttırmak ve yeniden devamBaşka bir 440 sn için ışık saçılması Cording. </li><li> nötralizasyon sonra belli bir zaman noktasında hastabakıcı yokluğunda kaydedilen MDH agregasyon derecesini ayarlamak% 100 (burada MDH maksimal ışık saçılması gözlendi 500 saniye sonra). Her belirtilen pH değeri HdeB yokluğunda MDH ışık saçılması sinyaline HdeB etkinliğini normalleştirmek. </li></ol> Analitik Ultrasantrifügasyon tarafından HdeB-LDH Kompleks Oluşumunun 3. Algılama (AUC) Not: HdeB tek başına ya da termik olarak laktat dehidrojenaz (LDH) açılma ile kompleks içinde çökelme hızı deneyleri analitik ultrasantrifüj kullanılarak yapıldı. <ol><li> 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı bir gece boyunca 4 ° C &#39;de LDH diyaliz, LDH hazırlanması ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 200 uM protein yoğunlaştırmak kDa. NOT: LDH dikkatli diyaliz LD olarak gereklidirH, amonyum sülfat solüsyon olarak iletilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20,000 x g&#39;de 20 dakika süre ile agrega santrifüj LDH kaldırın. 280 nm&#39;de absorbans ile LDH konsantrasyonunu belirlemek (ε 280 nm = 43.680 M-1 cm-1). LDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma. </li><li> 41 ° C&#39;de 15 dakika süre ile tampon D 30 uM HdeB varlığında ve yokluğunda (sırasıyla pH 4 ve 7), 3 uM LDH inkübe edin. Not: komple agregasyonda yükseltilmiş sıcaklıkta LDH inkübasyon ve HdeB hiç şaperon etkisi gözlemlenebilir. </li><li> Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Sonra, standart sektörünü içeren hücrelerin içine yük numuneleri 1.2 cm uzunluğunda bulunan 2 kanallı centerpieces şeklinde. ultrasantrifüjdeki içine hücreleri yükleyin ve önceki çökelme, en az 1 saat boyunca 22 ° C&#39;ye kadar dengeye getirin. </li><li> Sıkma 22 ° C &#39;de numuneler, 12 saat süre ile, ilgili rotor 167.000 x g ve sed izlemekSürekli 280 nm&#39;de protein imentation. Daha önce gösterildiği gibi, her kanalın geçen ışık şiddeti Absorbans yerine ölçüldüğü zaman, sinyal gürültü oranı artırıldı. Bu, daha sonra veri uydurma kalitesini arttırır. </li><li> Sürekli c (ler) dağıtım modeli 17 kullanılarak, SEDFIT (sürüm 15.01b 2015 Aralık) veri analizi yapıyoruz. Nasıl SEDFIT kullanmayı anlatan bir öğretici referans 18 bulunabilir. <ol><li> 0,7 ME (Maksimum Entropi) regularization için güven seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> SEDNTERP 19 kullanılarak tampon yoğunluğunu yanı sıra viskoziteyi hesaplayın. , Toplu müşteri protein miktarını tahmin referans olarak pH 7 pH 4&#39;te tortulaşmış LDH integral karşılaştırmak için. NOT: sedimantasyon dağılımın Entegrasyon SEDFIT doğrudan yapılabilir. Sedimantasyon hızı verilerini analiz etmek için alternatif bir yazılım son inceleme 20 bulunabilir. &lt;/ Li&gt; </ol> HdeB Varlığında 4. İzleme MDH inaktivasyonu ve Yeniden Not: pH katlanmamış MDH yeniden katlanması ile saflaştınldı HdeB etkisi nötralizasyondan sonra MDH faaliyeti gözlenerek belirlenmiştir. <ol><li> ya da yokluğunda 25 uM HdeB mevcudiyetinde 37 ° C &#39;de, 1 saat boyunca (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde tampon D 1 uM MDH inkübe edin. Daha sonra, 10 dakika boyunca 20 ° C&#39;ye kadar bir sıcaklık geçişi. Not: MDH 37 ° C&#39;den daha yüksek sıcaklıklarda kuluçkaya zaman Resim MDH yeniden katlama da HdeB mevcudiyetinde gözlenmiştir. </li><li> Asit denatüre MDH yeniden katlanması başlatma 0.5 M sodyum fosfat, pH 8.0 0,13-0,42 hacminin ilavesiyle pH 7&#39;ye örnekleri etkisiz hale getirir. </li><li> 20 ° C &#39;de 2 saat süre ile inkübasyondan sonra, 340 nm 9&#39;da NADH düşüş gözlenerek MDH aktivitesi belirlenir. NOT: MDH L-malat içine oksaloasetat ve NADH bağımlı bir azalma katalize eder. <ol&gt; <li> 950 deney tamponu ul (50 mM sodyum fosfat, pH 8.0, 1 mM oksaloasetat ve 150 uM NADH) ile inkübasyon reaksiyon 50 ul karıştırın. Not: Deney tamponunda MDH nihai konsantrasyon 44 nM olması gerekir. </li><li> 20 ° C olarak ayarlanmış bir Peltier sıcaklık kontrol bloğu ile donatılmış bir spektrofotometre kullanılarak absorbans değişikliği, izleyin. </li><li> pH 7.0 tutuldu 44 nM yerli MDH için MDH aktivitesi göreli bildirin. </li></ol></li></ol> E. tarihinde HdeB aşırı ifadesinin 5. Etkisi Asit Stres altında coli Survival NOT: E. E. coli MG1655 genomik DNA yayınlanmış bir protokol 21 kullanılarak izole edilmiştir. <ol><li> E. hdeB yükseltin BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT ve hdeB - - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. PCR primerleri hdeB kullanarak coli MG1655 </li><li> Aşağıdaki şekilde 50 ul PCR reaksiyonu başlatacak: 10 ul 5x polimeraz tamponu, 200 uM dNTP, 0.5 uM primer JUD2, 0.5 uM primer JUD5, 150 ng genomik DNA, MG1655, 0.5 ul DNA polimeraz, GKD 2 O 50 ul ekle. </li><li> Şöyle hdeB amplifikasyonunu yapmak: Aşama 1: 95 ° C, 1 döngü, 5 dakika; Adım 2: 95 ° C&#39;de 30 saniye, 55 ° C&#39;de 30 saniye, 72 ° C, 40 döngü 30 saniye; Aşama 3: 72 ° C&#39;de 10 dakika. </li><li> Sınırlama mevkisi klonlama için, standart yöntemler kullanılarak plazmid pBAD18 EcoR I ve BamH I bölgeleri içine PCR fragmanı elde Klon. üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti kullanılarak plazmid saflaştırılır. Sıralama 10 ile sonuçlanan plazmid doğrulayın. </li><li> HdeB veya zorlanma BB7224 içine boş vektör kontrolü pBAD18 (Δ rpoH) (genotip ifade plazmid Dönüşümü: F - λ - e14 - [araD139] B / r [6 (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (FRUK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: TN 10 (Tc S) suhX401 deoC1 Arad + rpoH :: kan +; 16) kimyasal yetkili hücreleri kullanılarak. NOT: Bu gerginlik ısıya duyarlı olduğunu. </li><li> 45 saniye 42 ° C&#39;de ısı şoku ve önceki kaplama için Sonra, 30 ° C ve 200 rpm&#39;de inkübe hücreleri. Pozitif klonların tek bir koloni çizgi-çıkışları gerçekleştirin ve gece boyunca 30 ° C kuluçkaya yatmaktadır. 50 mi LB Amp bir gece boyunca kültür Hazırlama 200 rpm ve 30 ° C &#39;de hücrelerin kültive edilmesi. </li><li> Bir gecelik kültürler 25 mi LB Amp 40. kat seyreltilir ve HdeB protein ifadesini uyarmak üzere 30 ° C ve bir OD 600 Nm 200 rpm = 1.0, 0.5,% arabinoz (ARA) mevcudiyetinde bakterilerin yetiştirilmesi. </li><li> pH değişim deneyler için, LB kullanmakAmp + Ara 0.5 OD 600Nm hücreleri sulandırmak ve (burada: pH 2.0, pH 3.0 ve pH 4.0) ilgili pH değerlerine ayarlamak için 5 M HCl uygun hacimleri ekleyerek. </li><li> Belirtilen zaman noktalarında (pH 3, 2.5 dakika; pH 2, 1 dakika, pH 4, 30 dakika) sonra, 5 M NaOH uygun hacimleri ilave edilerek kültürleri nötralize eder. </li><li> OD ölçümleri kullanılarak, 30 ° C&#39;de 12 saat süre ile sıvı kültürde etkisiz hale kültürlerin büyümesini izlemek. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions.">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li><li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria.">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+out+of+Disorder:+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone.">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li><li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+disorder+in+chaperone+action.">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li><li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding.">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li><li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation.">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li><li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers.">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li><li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release.">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li><li>Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria.">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri.">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li><li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli.">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li><li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase.">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li><li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch.">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li><li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Molecular,+Modeling,+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response.">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling.">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation:+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution.">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li><li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones.">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li><li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog,+Hsp40.">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li><li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy.">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li><li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone.">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

<html> aktivasyonu ve HdeB bir şaperon fonksiyonu mekanizmasını araştırmak için, HdeB büyük miktarlarda ifade edilmiş ve saflaştırılmış gerekir. sentezleme vektör sistemleri bir dizi bu çalışmada kullanılmıştır, her ikisi de pTrc ya pBAD vektörleri de dahil olmak üzere, bir hedef proteinin yüksek seviyeleri üretimi için kullanılabilir. Destekleyiciler E. için kolayca erişilebilir E. coli RNA polimerazı ve bir E. HdeB böylece güçlü yukarı regüle getirilmesine olanak tanıyan ifade coli suşu. Bu yönü rpoH -açıklı suşu kullanılmıştır asit stres koşulları altında HdeB in vivo aşırı çalışma için özellikle uygundur. Bu soy şaperonlar en yoksun ve böylece yüksek bir sıcaklıkta, düşük pH ve oksidatif stres 15 dahil olmak üzere çeşitli stres, karşı daha duyarlıdır. alternatif olarak, hayatta kalma ilgili geni eksik mutant yapılabilir Burada sunulan benzeyen inceler. t &quot;&gt; bir şaperon aktivitesi için deney tasarımı ve tekrar katlama deneyi müşteri türü, istemci protein konsantrasyonu ve tampon koşulları açısından hem de, dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır. Bu gibi tipik şaperon deneyleri, model alıcı proteinlerden, içinde sitrat sintaz, lusiferaz veya malat dehidrojenaz üre veya guanidin-HCl, yüksek konsantrasyonlarda denatüre ve agregasyonu 23,13 indükleme denatüran içermeyen tampon içerisinde seyreltilir. şaperonlar mevcudiyetinde ölçümler, proteinin agregasyonunu önlemek için derecesini yansıtmaktadır. Alternatif olarak, müşteriler, termal olarak katlanmamış ve protein birikimini Her iki durumda da, ışık saçılım ölçümleri, protein agregasyonu için, okuma çıktısı olarak kullanılır. izlenir. Aktif şaperonlar ve böylece ışık saçılım sinyali 6 bir azalmaya neden client proteinlerin ortaya konma toplanmasını önler. hem bu deney düzeneğinde, düşük pH inkübasyon ile kombine edilebilir. ek olarak mol değerlendirilmesineBelirli bir istemci protein agregasyonunu önleme kabiliyetlerini izleyerek ecular şaperon aktivitesi olmayan stres koşullarına dönüş üzerine, istemci yeniden katlanma ile şaperonlar etkisi 24 test edilebilir. İstemci proteinler inaktivasyonu ve yeniden aktivasyonu için niceliksel okuma olarak kullanılabilir enzimatik aktiviteye sahip olduğunda özellikle basittir. Şaperon aracılı yeniden katlama doğal olarak ATP-bağımlı bir işlem olduğu halde, örneğin HdeA, HdeB ve ajan olarak periplazmik şaperonlar periplasmasında 9,25 enerji eksikliği ile tutarlıdır bir ATP-bağımsız bir şekilde yeniden katlama istemci kolaylaştırmak için gösterilmiştir. Bu HdeB gibi bir asit koruyucu hastabakıcı pH optimumu incelenmesi çeşitli nedenlerden dolayı zordur: sitrat sentetaz bile köklü şaperon müşterili proteinlerinin (I) &#39;in agregasyonu davranışları asidik pH değerinde farklıdır; ve (ii) sadece birkaç tampon sistemleri 2-5 arasındaki bir pH aralığında çalışır ve kendine olanilgi hastabakıcı ve müşteri protein hem de tablo. Biz bu asidik pH koşulları altında ideal olmayan tampon sistemi farkında olmasına rağmen, fosfat tamponu ile sahada. Bununla birlikte, fosfat tamponu asit aktive hastabakıcı 9,22 olarak HdeA karakterize etmek için çok uygundur olduğu bulunmuştur. Toplama ölçümleri sıcaklık ya da tampon içeriğinde değişikliklere karşı çok duyarlıdır. Yalancı pozitif sonuçlar ortadan kaldırmak için, biz bu nedenle her zaman müşteri toplama üzerinde hastabakıcı depolama tampon etkisi (Şekil 1, tampon kontrolü) test etmek önerilir. Bazen müşteri protein agregasyonu bile en iyi hastabakıcı toplama süreci ile rekabet edebilecek olmayabilir o kadar hızlı gerçekleşir. Optimal tahlil koşulları bulmak için ön testler yapmak için elzemdir. Böyle bir durum için iyi bir örnek&gt; 42 ° C arasındaki sıcaklıklarda LDH inkübasyon çok hızlı olduğu bizim ultrasantrifügasyon deneyler verilmiştir bileHdeB ilişkin bir fazlalığın mevcudiyeti LDH toplanmasını engellemez. Buna ek olarak, şaperon / birlikte-hastabakıcı oranı ve şaperon / müşteri oranı dikkatle 23 belirlenmelidir. Ön deneylerde 1 ve HdeB bir hastabakıcı faaliyeti için en uygun pH pH değeri 4 belirlenmesinde bize yardımcı: 50 MDH oranı: Biz oldukça yüksek HdeB kullanmaya başladı. En etkili oranının, 1: 25, belirleme pH 4 1: 1 ve 50: 1 arasında MDH oranı: Daha sonra HdeB analiz etmiştir. Bunun aksine, HdeA 10 olarak MDH toplama bastırılır: 1 koruyucuya: İstemci oranları 6,9,10,22. istemci oranları tamamen MDH toplanmasını bastırmak için yeterli idi: Böylece, HdeA, HdeB göre, alt hastabakıcı olarak MDH toplanmasını bastırılması daha etkili olduğu sonucuna varıldı. Protein agregasyonu şaperon aracılı bastırılması araştırmak için başka bir yaklaşım, bir dönüş yavaşlatma deneyleri, istemci agregalar, santrifüj işlemiyle çıkarıldı ve SDS-PAGE ile ölçülmüştür edildiği içerir. Bu yaklaşım, ayrıca m uygundurin vivo protein agregasyonu üzerine şaperonlar etkisini onitoring. Ya aşın veya ilgi koruyucuya eksikliği mutant suşlar, protein açılımı stres koşullarına maruz kalırlar. Daha sonra hücreler parçalanır ve çözünen ve birleştirilmiş fraksiyonlar ayrıldı ve 15,16,26 nicelendirilir. istemci hastabakıcı kompleksinin saptanması için, analitik ultrasantrifüj uygulanır. Her iki proteinler 280 nm&#39;de absorbe gibi, deney düzeneği dayalı doğrudan bu komplekse bağlı HdeB miktarı ve LDH monomerleri ölçmek mümkün olmadığı burada not edilmelidir. Arzu edildiği takdirde, şaperon müşterili kompleksinin stoikiometrisinin ayrı olan uyarılma maksimumuna görülebilir aralığı içinde uzanan bir kromofor ile koruyucuya ve müşteri protein etiketleme belirlenebilir. Seçenek olarak ise, kompleksler içindeki şaperonlar istemcilerin stokiyometri olarak niceliksel Western lekesiyle ile birlikte yerel PAGE kullanılarak belirlenebilir. </p&gt; Burada sunulan protokolleri takip ederek, biz iki moleküler şaperonlar, HdeA ve HdeB 9,10,22 karakterize başardık. Genel olarak, bu deneyler, in vitro ve in vivo olarak, protein yeniden katlanma moleküler şaperonlar potansiyel önleyicileri rolünü araştırmak için de kullanılabilir veya asit stres altındaki müşteri agregasyonunu önleme yetenekleri sentetik şaperonlar test etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, burada sunulan protokoller aktivasyon mekanizması ışık tutmak amacıyla nokta mutasyonları ve / veya asit ile aktive edilmiş şaperonlar kesik varyantları analizler için de kullanılabilir.

Mikrobiyal patojenler asit kaynaklı protein elinde tutmasına koşulları tecrübe edildiği bir ortak doğal çevre olan asidik pH gıda kaynaklı patojenler 1 karşı etkili bir bariyer görevi görür memeli mide (pH aralığı 1-4) &#39;dir. Amino asit yan zinciri protonasyon nedeniyle protein açılması ve agregasyonu, biyolojik süreçleri, zarar hücresel yapıları etkileyen ve en sonunda hücre ölümüne 1,2 neden olur. Bakteriyel periplazmaya pH nedeniyle gözenekli dış zar boyunca proton serbest difüzyonuna neredeyse aynı anda, çevre pH dengeye için, Gram-negatif bakterilerin periplazmik ve iç membran proteinleri asit, gerilimli şartlar altında 3 en hassas hücre bileşenleri bulunmaktadır. Hızlı asit aracılı olduğu hasarlara karşı gösterdikleri periplazmik Proteomun korumak için, Gram-negatif bakteriler asit ile aktive edilmiş periplazmik şaperonlar HdeA ve HdeB kullanmaktadır. HdeA bir şartlı bozukluğu şaperonudur <sup&gt; 4,5: nötr pH&#39;da, HdeA katlanmış, şaperon hareketsiz dimer olarak mevcuttur. PH 3 altında bir pH kayması sırasında, HdeA en şaperon fonksiyonu hızla 6,7 etkinleştirilir. HdeA aktivasyonu monomerlerin 6-8 açılımı derin yapısal monomerlerin içine ayrışma dahil değişiklikleri, ve kısmi gerektirir. Bu işlemden sonra, HdeA asidik koşullar altında açığa proteinlerine bağlanır. Bu etkili bir düşük pH değerlerinde inkübasyon sırasında hem de pH nötrleştirme sırasında hem agregasyonunu engeller. PH 7.0&#39;a dönüş üzerine, HdeA bir ATP-bağımsız bir şekilde, istemci proteinlerinin yeniden katlanmasını kolaylaştırır ve dimerik, refakat-olmayan yapıya 9 geri dönüştürür. Benzer şekilde, benzer şaperon HdeB da refakat hareketsiz pH 7.0 ile kullanılmıştır. HdeA aksine, HdeB en şaperon aktivitesi, pH 4.0 HdeB hâlâ büyük oranda katlanır ve 10 dimerik olduğu koşullar altında, görünür maksimuma ulaşır. Ayrıca, daha fazla pH gevşeyebilir düşürücüHdeB inaktivasyonu es. Bu sonuçlar, büyük bir homoloji rağmen HdeA ve HdeB bunları koruyucu şaperon fonksiyonu ile geniş bir pH aralığı kapsayan sağlayan fonksiyonel bir aktivasyon tarzı açısından farklılık göstermektedir. E. asit direnci implike edilmiştir Diğer bir şaperon E. coli nötr koşullar restore kadar gelişeceğini istemci proteinleri stabilize görünen sitoplazmik Hsp31 vardır. Hsp31 en müdahale durumu net olarak, bununla birlikte, 12 anlaşılmaz kalmıştır. Salmonella gibi diğer enteropatojenik bakteriler hdeAB operonunu eksikliği göz önüne alındığında, diğer henüz kimliği belirlenemeyen periplazmik şaperonlar bu bakterilerin 11 asit direnci dahil olduğunu var olabilir kuvvetle muhtemeldir. Burada yer alan protokol vivo 10 in vitro ve in HdeB pH bağımlı şaperon etkinliğini izlemek için izin diğer şaperonlar araştırmak için uygulanabilirHsp31 gibi. Seçenek olarak ise, hdeAB ifadesini kontrol transkripsiyon faktörleri karmaşık ağ potansiyel in vivo gerilme testi ile araştırılabilir. In vivo olarak, proteinlerin şaperon işlevini karakterize etmek için, farklı deney düzenekleri uygulanabilmektedir. Birinci yol proteinin açılımı stres koşullar uygulanır ve fenotipik iki ilgili geni aşırı ifade eden ya da genin bir silme taşıyan mutant türünü nitelendirilmesidir. Proteomik çalışmalar chaperone mevcut olduğu zaman, gerilimli şartlar altında, toplam artık bu proteinleri belirlemek için yapılabilir, ya da belirli bir enzimin bir şaperon etkisi Enzimatik 14-16 kullanılarak stres şartlarında belirlenebilir. Bu çalışmada, tüm büyük E. ekspresyonunu kontrol RpoH ısı şoku sigma faktörü 32. yoksun bir rpoH delesyon suşu içinde HdeB aşın tercih E. coli chaperones ve silme sens arttırdığı bilinmektedirprotein 15 açılımı neden olan çevresel stres koşullarına iTivity. HdeB in vivo şaperon aktivitesi Δ rpoH soyunun pH duyarlılığı bastırmak için kabiliyetini izleyerek tespit edilmiştir. Özet olarak, burada sunulan protokoller in vitro hem de in vivo bağlamında bir asit ile aktive edilmiş cinsten aktivitesinin karakterize edilmesi için hızlı ve basit bir yaklaşım sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

Bakteriler sıklıkla pH değişiklikleri, sıcaklık, redoks durumu, ışığa maruz kalma veya mekanik güç gibi çevresel değişikliklere maruz kalır. Bu durumların çoğu hücrede açılımı proteini neden organizmanın sağkalım üzerine olumsuz etkisi vardır. olmayan, stres-özel moleküler şaperonlar bir grup, bu stres koşullarında hayatta kalması gerekli roller oynadığı gösterilmiştir. Tamamen katlanmış ve hastabakıcı-inaktif stres önce, bu proteinler hızla açılmak ve spesifik stres koşulları altında hastabakıcı aktif hale iken. Bir kez bu koşullu düzensiz şaperonlar farklı toplama eğilimli proteinin çok sayıda bağlanan, aktive edilmiş, bunların birarada toplanmasını önlemek ve, ya doğrudan ya da dolaylı olarak non-stres koşullarına dönüş üzerine yeniden katlama proteini kolaylaştırır. onların aktivasyonu ve müşteri tanıma mekanizması hakkında daha ayrıntılı bir anlayış kazanıyor için birincil yaklaşım arınma ve subsequen içerirnitro şaperon deneyler kullanılarak bu proteinlerin t karakterizasyonu. In vivo stres deneyleri takip bağımsız in vitro sonuçlar elde onaylamak için kesinlikle gereklidir. Bu protokol, E. şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlere tarif E. coli HdeB bir asit aktive şaperon. Işık saçılım ölçümleri, in vitro olarak, kurulu bir modeli istemci protein, MDH asit ile indüklenen, toplanmayı önlemek için HdeB kapasitesi için uygun bir okuma olarak kullanılmıştır. Analitik Ultrasantrifügasyon deneyleri non-stres koşullarına döndükten sonra müşteri proteinlerin kaderi içine ışık tutacak, HdeB ve müşteri protein LDH arasındaki karmaşık oluşumunu ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Müşteri proteinlerin enzimatik aktivite deneyleri pH kaynaklı müşteri inaktivasyonu ve reaktivasyon üzerinde HdeB etkilerini izlemek için yapılmıştır. Son olarak, hayatta kalma çalışmaları için kullanılmıştır monitoin vivo HdeB en şaperon fonksiyonunun etkisini r.

HdeA ve HdeB E. homologdur asit stres koşulları 10 karşı periplazmik proteinlerin korumak için bilinen E. coli proteinleri. Çalışmalarımız bir asit moleküler koruyucuya aktif olarak HdeA benzer HdeB da işlev ortaya koydu. Bununla birlikte, potansiyel olarak bakteri ama HdeA 6,9,10,22 optimum pH değeri önemli ölçüde daha yüksek olan bir pH değerinde HdeA, HdeB işlevleri tersine. In vitro HdeB en şaperon aktivitesinin pH optimumu araştırmak için, yerel MDH HdeB varlığında ya da yokluğunda belirtilen pH önceden ısıtılmış (43 ° C) tampon içinde seyreltilmiştir. inkübasyondan 360 saniye sonra, kuluçka Reaksiyon nötralize edildi. Bu nötralizasyon, 43 ° C&#39;de 9 de MDH agregasyonunu tetikler. Örnek sonuçlar HdeB yokluğunda MDH ışık saçılım sinyali nedeniyle MDH agregasyonu nötrleştirme sırasında büyük ölçüde arttırdığını göstermektedir (Şekil 1, blHer pH bildirim hattı). HdeB varlığında, ışık saçılım sinyali anlamlı HdeB MDH (Şekil 1, pH 4 ve pH 5) agregasyonunu engeller gösteren, pH 4 ve pH 5 ile nötralizasyondan sonra azaltılır. Buna karşın, pH 2 ve pH 3 ila nötralizasyondan sonra, MDH hızlı HdeB en şaperon aktivitesi için optimum pH olduğunu gösteren HdeB (Şekil 1, pH değeri 2 ve pH 3) varlığı veya yokluğu bağımsız olarak aynı ölçüde agrega HdeB saklama tamponu 4 pH arasında ve 5 pH 4&#39;te HdeB mevcudiyetinde MDH azaltılmış ışık saçılması sinyali, şaperon işlevi nedeniyle olduğuna işaret MDH toplama (Şekil 1, geçici bellek kontrol) üzerinde herhangi bir etki. HdeA pH 2-3 de monomerik ve açık bir halde aktif şaperon ancak en veya pH 4 ila 10 daha yüksek bir faaliyet gösterir. Bu sonuçlar, HdeB pH 4 ila 10 etrafında uygun şaperon aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. <img al<html> t = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1:., Asidik pH&#39;da HdeB bir şaperon aktivitesi 0.5 uM MDH, 43 ° C de ya da yokluğunda 360 saniye boyunca 12,5 uM HdeB mevcudiyetinde belirtilen pH değerinde önceden ısıtılmış tampon D inkübe edildi. Numunelerin pH değeri 0,16-0,34 hacim 2M tamponsuz K ilavesinden 2 HPO 4&#39;e göre (yıldız işareti ile gösterilir) pH 7&#39;ye yükseltildi, MDH agregasyon 350 nm&#39;de gözlenmiştir ışık saçma ile ek bir 440 sn için ölçülmüştür nötr pH (mavi arka plan). Şekil başlangıçta Biological Chemistry dergisinde yayımlanan Dahl ve ark. 10 .Bu araştırma değiştirilir. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. diğer istemci proteinlerle de HdeB formları kararlı kompleksler, 3 uM LDH termal farklı pH koşullarında varlığında ya da 30 uM HdeB yokluğunda 41 ° C&#39;de katlanmamış olup olmadığını gidermek için. Analitik ultrasantrifüj, bu örneklerin sedimentasyon davranışının analizi 22 ° C &#39;de yürütülmüştür. LDH, HdeB pH 7 ve 41 ° C&#39;de birlikte inkübe edildi LDH özel tetramerik (120 kDa&#39;lık bir moleküler ağırlığa) kalmış ve HdeB dimerik kalmıştır. Bu sonuçlar, proteinler, pH 7 stabil kompleksler oluşturmaz göstermiştir ve LDH 41 ° C&#39;de (Şekil 2, yeşil hat) bir 20 dakika inkübasyondan sonra oligomerizasyonu herhangi geri dönüşü olmayan değişiklikler uğramaz. Benzer şekilde, HdeB gösteren 41 ° C ve pH 4.0 inkübasyon üzerine dimerik kaldığı düşük pH kuluçkaHdeB bile ısı şok koşullarında (Şekil 2, kırmızı çizgi) altında oligomerizasyon durumunu etkilemez evi. LDH İlk tarama (sağ üst köşede yer alan Şekil 2) Kaydedilmiş önce LDH&#39;nin% 40 tortulaşmış olması ile gösterildiği gibi hızlı bir şekilde birleştirilmiş HdeB yokluğunda, pH 4, 41 ° C de inkübe. Kalan LDH monomer (Şekil 2, mavi çizgi) ağırlıklı olarak çöktürmek ortaya çıktı. Bunun aksine, pH 4 ile 41 ° C &#39;de LDH ve HdeB kuluçka 134 kDa bir molekül ağırlığına sahip yeni bir tür oluşturan iki protein için birlikte tortu (HdeB-LDH C) büyük bir kısmı neden oldu. Bu tür büyük olasılıkla HdeB dimerleri ve termal açılımı LDH arasında bir kompleks temsil eder. Ayrıca, HdeB mevcudiyetinde önce çökelme hiçbir önemli LDH çekiş eden in vitro agregasyon ölçümleri ile uyumlu biçimde gözlenmiştir. Bu sonuçlar, HdeB bölgesindeki şaperon aktivitesi göstermişlerdir onunpH 4.0 dimerik formu. Bu monomerik formda aktif şaperonudur HdeA, taban tabana zıttır. Bu pH 4 ve pH 7 arasında yapısal yeniden tabi sağlar HdeB çok dinamik yapısı HdeB en şaperon fonksiyonu 10 aktivasyonu için olası yeterlidir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54527/54527fig2.jpg" /> Şekil 2:. Analitik ultra-santrifüj ile pH 4&#39;te HdeB ve katlanmamış LDH arasındaki kompleks oluşumunun saptanması 3 uM LDH tampon D, 15 dakika boyunca (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) ve 10-molar fazlası HdeB mevcudiyetinde kuluçkalanmıştır pH 7 (yeşil hat) ya da 41 ° C veya pH 4 (siyah çizgi). Karşılaştırma için, LDH, tek başına (mavi çizgi) ya da tek başına HdeB (kırmızı çizgi) LDH, 4. Analitik ultrasantrifügasyon sedimantasyon hızının HdeB stokiyometri belirlemek için kullanılmıştır pH 41 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edildi, ve kompleks HdeB arasında oluşturulan ve dif de LDHferent pH koşulları. (Sağ üst köşede belirtildiği gibi) pH 4&#39;te ve HdeB yokluğunda kuluçkaya zaman ilk tarama öncesinde toplanmış o ~% 40 LDH unutmayın. sedimantasyon katsayısı dağıtım arsa olduğunu göstermiştir (c (ler)) programı SEDFIT kullanılarak analiz edildi. Harfler, sırasıyla LDH veya HdeB ilgili oligomerik durumunu belirtir: HdeB D, HdeB dimer; LDH M, LDH monomer LDH t, LDH tetrameri; HdeB-LDH Cı HdeB-LDH kompleksi. Şekil Dahl ve ark. 10 modifiye edilir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig2large.jpg" target="_blank">Ver bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sion. HdeB nötralizasyondan sonra istemci proteinlerinin yeniden katlanmasını destekler olmadığını test etmek için, pH denatüre MDH yeniden katlanması üzerine HdeB etkisi analiz edildi. Termal denatüre MDH HdeB varlığında veya yokluğunda, farklı pH değerlerinde inkübe edildi. düşük pH inkübasyondan sonra, pH (ki MDH yeniden katlanmasını başlatır) ile nötralize edildi ve MDH aktivitesi 2 saat sonra tespit edilmiştir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, MDH önemli yeniden aktive HdeB mevcudiyetinde pH 4 ile nötralizasyondan sonra elde edildi. HdeB düşük pH inkübasyon yok oldu hiçbir MDH aktivitesi belirlendi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54527/54527fig3.jpg" /> Şekil 3: HdeB asit yeniden katlama enzimatik olarak aktif duruma MDH denatüre kolaylaştırır 1 uM MDH ya da yokluğunda, p 37 ° C &#39;de, 1 saat boyunca belirtilen bir pH değerinde tampon D inkübe edildi.25 uM HdeB bölgesinin resence. Numuneler, 0.5 M Na-2 ilave HPO 4 ile pH 7&#39;ye nötralize edilmiştir önce Daha sonra, sıcaklık 10 dakika boyunca 20 ° C&#39;ye kadar kaydırılmıştır. Alikotlar, 20 ° C &#39;de inkübasyon 2 saat sonra alındı ​​ve MDH aktivitesi için analiz edilmiştir. yokluğunda (beyaz çubuklar) veya HdeB varlığında (siyah çubuklar) nötralizasyondan sonra MDH aktivitesi gösterilmiştir. en az 3 bağımsız ölçümlerinden elde edilen standart sapma gösterilmektedir. Şekil Dahl ve ark. 10 modifiye edilir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig3large.jpg" target="_blank">Bu büyük halini görmek için tıklayınız</a>rakam. İn vitro veriler, HdeB, pH 4&#39;te, farklı bir model istemci proteinleri bağlayan bunların birleşmesini önler ve bir kez nötral pH koşulları yüklenir yeniden katlama istemci kolaylaştırdığı ortaya koymuştur. In vivo HdeB etkilerini araştırmak için, pH değerine bağımlı kalma tahlillerinde, sıcaklığa duyarlı rpoH delesyon suşu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu soy en şaperonlar sahip değildir ve bu nedenle, yüksek sıcaklık, düşük pH veya oksidatif stres 15 karşı daha hassastır. Nötr pH koşulları altında HdeB aşırı ekspresyonu, boş vektör pBAD18 (Şekil 4, tedavi edilmemiş) barındıran kontrol suşu nispeten iyi büyümüş soyun büyüme hızı üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. Tersine, yetenekleri açısından belirgin bir fark tespit düşük pH Akne tedavi edici gelen tekrarlanabilir geliştirilmiş kurtarma gösteren HdeB fazla sentezleyen suşu pH 3 veya pH 4 tedaviden sonra büyüme devamkontrol suşu daha tment. İn vitro veriler, aksine, bununla birlikte, HdeB varlığı da pH dimerlerin doğru HdeB oligomerizasyon durumunu da kayabilir bu hücrede HdeB yüksek konsantrasyonu nedeniyle olabilir pH 3 önemli ölçüde koruyucu bir etki vardı hücreler nereye pH 4 9,10,22 inkübe anlamlı öldürme gözlenirken pH 2 veya pH 3&#39;e hücrelerin değişen, çok hızlı ve son derece toksik etkileri sonuçlandı 3. Not. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54527/54527fig4.jpg" /> Şekil 4: HdeB E. korur asidik pH karşı coli. HdeB (kırmızı daireler), 30 ° C&#39;de% 0.5 arabinoz mevcudiyetinde BB7224 (Δ rpoH) aşırı eksprese edildi. boş vektör pBAD18 barındıran BB7224 hücreleri kontrol (siyah daireler) olarak kullanılmıştır. Sol üst paneli hem st büyümesini gösterir30 ° C &#39;de yağmur, pH 7 Hücreler, 2.5 dakika, pH 3 (sol alt panel) ya da 30 dakika sonra da, 5 M HCI eklenerek belirtilen pH kaydırılır ve pH 2 (üst sağ panel), 1 dakika süreyle inkübe edildi pH 4 (sağ paneli alt). Daha sonra kültürler, 5 M NaOH, uygun hacimleri ilave edilerek nötralize edildi ve büyüme 30 ° C &#39;de sıvı ortamda izlenmiştir. Şekil Dahl ve ark. 10 modifiye edilir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

10.3K Görüntüleme.  University of Michigan.  Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir. 

Video: Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Biyokimya

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

Balarısı üzerinden beyin Homogenate Fosfolifaz C aktivite tespiti

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

pH bağımlı aktivitenin tespiti

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme