Yazarlar Marit Warrer mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bağımsız araştırma için Danimarka Konseyi tarafından desteklenmiştir | Doğa Bilimleri [1323-00343B] ve [DNRF120] Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı.

1. bakteriyel kültürlerde hazırlanması.
<ol><li>Grow bütün kültürlerde Erlenmeyer şişeler ile bir kültür/şişesi hacim oranı en az 1/6. 37,0 ° C'de kültürler ve tercih edilen karbon kaynağı, örneğin % 0,2 glikoz, en az 10 ile takıma morpholinepropanesulfonic asit (paspas) en az orta 18 160 rpm'de sallayarak tipik bir deneysel Kur içinde büyümek RNA hasat önce üst üste nesilleri.</li>
	<li>RNA hasat, önceki gün seyreltik BEZLERİ en az orta ertesi gün istediğiniz saatte istediğiniz OD 436 ulaşacak şekilde istenen yük outgrown bir kültür. Aşılama için formül tarafından kullanmak için kültür geçmek hacmi hesaplamak: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg" /> Not: Burada, OD Yeni istenen OD 436 gösterir Kuluçka sonra V Yeni gösterir seyreltilmiş kültür hacmi, OD eski gösterir üzerinden seyreltilmiş outgrown kültürünün OD 436, G gösterir kültür büyür, nesil sayısı üzerinden seyreltme (TRT 1) gün sonra (t 2) gerekli değildir ve olarak hesaplanan zaman zaman: zaman farklılığı (dk) arasında TRT 1 ve t 2 nesil süresi (dk) bölünür. Örnekleme zamanında kararlı durum büyüme sağlamak için G olmalıdır &#8805; 10; V eski taze ortamına aktarılması gerektiğini dışı yetiştirilen kültür seviyesini gösterir. Bu denklem için herhangi bir gecikme aşama hesaba katmaz bir yaklaşım olduğunu; seyreltme taze medya dışı yetişkin bir kültür sonra sık sık gözlenen bir fenomen.
	<ol><li>Büyüme koşulları deneme amacına bağlı olarak değişiklik gösterir, ama hücre hücre varyasyon tRNA düzeyleri ve sonuçları (önerilen), tekrarlanabilirlik artırmak için büyümek örnekleme öncesi durumunu sürekli kültürler sınırlamak için 19.</li></ol></li></ol> 2. Spike hücreler hazırlanması Not: tRNA selC bir izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) kontrolü altında kodlama selC gen ifade E. coli zorlanma MAS1074,- indüklenebilir organizatörü spike zorlanma kullanılır.
<ol><li>Dilute MAS1074 outgrown bir kültür 0,05 BEZLERİ içinde bir OD 436 için en az orta 100 µg/mL Ampisilin ve % 0,2 glikoz ile desteklenmiştir. 160 rpm'de sallayarak 37 ° C'de kültür büyümek. 
	Not: tartışma bir alternatif başvuru zorlanma kullanımı için bkz.</li>
	<li>, OD 436 ~ 0,1, tRNA selC ifade ikna etmek için 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyin. Kültür OD 436 ~0.5 için büyümek (~ 3-4 s büyüme) ve kültür şişeye bir buz banyosu için hareket. RNA arıtma için tüm örneklerini hasat kadar buz spike hücre kültür devam.</li>
</ol> 3. Deneysel örnekleri hasat.
<ol><li>Öncesi sıcak (37 ° C) bir şapkalı 100 mL Erlenmeyer şişesi (veya benzeri) bir sıcak su banyosunda yerleştirerek her örnek için 4 mL % 10 (w/v) trichloroacetic asit (TCA) içeren. 
	Not: dikkat, hidrojen klorür ve kloroform gibi toksik ve aşındırıcı duman üreten Isıtma üzerine TCA parçalanır. Güçlü bir asit suda çözümdür; Bu şiddetle üsleri ile reaksiyona girer ve birçok metaller atmış. Bu sıvı kullanırken gerekli tedbirleri alınmalıdır.</li>
	<li>Hemen önce hücre hasat, ölçmek ve kültür OD 436 rekor.</li>
	<li>Hücreleri hasat, kültür 4 mL TCA içeren önceden ısıtılmış bir şişesi transfer.</li>
	<li>İçin 5 s. karıştırma TCA ile hemen tüm enzimatik faaliyetleri devre dışı bırakır ve böylece tRNA şarj düzeyini korur şişeye el ile dönen tarafından örnek mix. 
	Not: Eğer birden fazla örnekleri toplanması için tüm örnekleri toplayana kadar hasat örnekleri TCA buz üstünde tutun.</li>
</ol> 4. Ayrıca spike hücreler Not: spike hücreler hazırlanması adım 2'de açıklanan.
<ol>Ne zaman tüm örnekleri için RNA hazırlık <li>toplanmıştır, her örnek için (OD üzerinde göre) % 5 spike hücreler ekleyin. 
	Not: Gerekli spike hücre kültür hacmi formülle hesaplanır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg" /> V spike gerekli, spike-in hücre kültürü hacmi gösterir nerede V exp hacmi gösterir (TCA) olmadan hasat deneysel hücre kültürü, OD exp deneysel hücre kültürü OD 436 hasat TCA içine zaman gösterir. OD spike spike hücre kültürünün OD 436 gösterir. Eğer birden fazla örnekleri farklı ODs hasat, birimin eklendi spike hücreler her örnek için formüle göre ayarlanmalıdır.</li>
	Spike hücreler katkısı faiz, RNA türü ölçmek için <li>sadece 4 mL spike hücreler 4 mL TCA ile karıştırılarak spike hücreler içeren bir örnek hazırlamak. RNA bu örnekten diğer örnekleri için aynı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, spike hücreler, olmadan sadece deneysel örnek içeren başka bir şişe al ve tRNA için deneysel örnek katkısını ölçmek için içerir selC düzeyleri; tRNA selC endojen düzeyleri E. coli K-12 negligibly düşük.</li>
</ol> 5. RNA'ın hazırlık Not: Burada açıklanan RNA hazırlık protokoldür esasen Varshney ve ark. tarafından açıklanan 1; Aminoacylated tRNA deacylation arıtma sırasında önlemek için asidik pH ve arıtma seyri boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak önemlidir. Örnekleri ve çözümleri tutmak için temiz steril tüpler/şişeler kullanın ve tüm çözümler ultrasaf (18,2 MΩ·cm direnci ile) su hazırlayın.
<ol><li>Bir buz soğuk santrifüj tüpü dönüştürmek dökün 8 mL. Örnekleri de 4 ° C. tamamen Kaldır süpernatant 9.500 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve 0.3 mL soğuk 0,3 M sodyum asetat içinde pH 4.5 ve 10 mM EDTA resuspend.</li>
	<li>Her örnek için bir soğuk 1.5 mL microcentrifuge tüp nakletmek ve eklemek ile aynı tampon equilibrated 0.3 mL fenol. 
	Not: dikkat, fenol zehirli gazlar oluşturur ve cilt için son derece korozif.</li>
	<li>Girdap her örnek 10 x 15 için en az 1 dk her girdap arasında bir iyimsersin. Vortexing arasında örnekleri 0 tutmak ° C. örnekleri soğuk kalmasını sağlamak için sık sık duraklar kullanın.</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 15 dk santrifüj örnekleri ° C. Transfer (üst aşama) su aşamaya yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpleri. 0.3 mL soğuk fenol ve girdap 4 x 15 s daha önce olduğu gibi ekleyin.</li>
	<li>4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. Transfer 2,5 kat % 96 etanol (~ 750 µL) birimi içeren yeni, soğuk 1.5 mL microcentrifuge su aşamaya tüpleri. Tüpler için 1 h-20 ° C veya gecede-80 kuluçka tarafından RNA çökelti ° C.</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj örnekleri ° C. süpernatant atmak ve RNA Pelet bozmadan 1 mL soğuk % 70 etanol dikkatle ekleyin. Yavaşça iç etanol ile tüplerin yıkamak için bir kez tersine çevirin. 
	Not: Pelet Bu adımda görmek zor olabilir.</li>
	<li>4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve kadar hiçbir etanol sol Pelet kuruması. Pelet tarafından şiddetle vortexing 20 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4.5 ve 1 mm EDTA resuspend. 
	Not: o-ecek var olmak resuspend zor gibi Pelet aşırı kuru değil.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, RNA konsantrasyonu 260 Absorbans ölçerek değerlendirmek nm.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, özel Jel Elektroforez 20 tarafından arıtılmış RNA kalitesini değerlendirmek.</li>
	<li>Mağaza örnekleri-80, ° C. 
	Not: Burada protokol duraklatılmış.</li>
</ol> 6. Kimyasal olarak deacylated denetimi örneğini hazırlanması Not: aminoacylated grup ayırt etmek için Kuzey üzerinde deacylated karşılığından tRNA leke, bir kimyasal deacylated aliquot alkali tedavisi tarafından hazırlanmıştır. Çoğu amaç için Kuzey her leke için deacylate tek bir örnek yeterli.
Buz <ol><li>tezcan RNA örnek. 4 µL aliquot RNA örneği için yeni bir tüp aktarın. 46 µL Tris-HCl pH 9.0 ekleyin. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>PH 4.5 0,3 M sodyum asetat 15 µL ekleyip daha sonra 125 µL % 96 etanol ekler. -20 ° c için 1 h. RNA çökelti</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve 4 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4,5 ve 1 mM EDTA içinde resuspend. 
	Not: örnek-80 depolanıyorsa, protokol, duraklatılmış ° C.</li>
</ol> 7. Jel Elektroforez ve Kuzey kurutma <ol><li>Mix 4 µL örnek (tedavi edilmemiş veya kimyasal olarak deacylated) ile 6 µL yükleme arabellek (0.1 M sodyum asetat (pH 5,0), 8 M üre, % 0.05 bromophenol mavi ve % 0.05 Ksilen cyanol). 
	Not: yalnızca spike hücreler, içeren örnek eklemeyi unutmayın kimyasal olarak deacylated sample (ve bir hazır spike hücreler, olmadan).</li>
	<li>Örnekleri üzerine bir 0.4 mm kalınlığında % 6,5 polyacrylamide 0.1 M sodyum asetat arabellek (pH 5,0) 8 M üre içeren jel (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) yükleyin. TRNA türler uygun ayırma için 60 cm uzun jelleri kullanın.</li>
	<li>Ayrı RNA, 4 ° C'de 10 V/cm Jel Elektroforez tarafından mavi bromophenol kadar ulaşır jel (~ 20 h) alt.</li>
	<li>Alan Ksilen cyanol boya ve bromophenol mavi doğru aşağı 20 cm boya kurutma için kullanılır (iki boyalar arasındaki uzaklığı 25-30 cm olmalıdır). Böylece jel onlardan biri kalır iki cam levha, dikkatlice ayırın. Filtre kağıdı ince bir parçası istenen blotting alan boyutuna kesme ve kurutma için kullanılacak jel parçası üzerine yerleştirilir. Filtre kağıdı tarafından kapsanmayan jel parçaları kesilmiş ve atılan. jel parça cam levha uzak çýkýntýdan için filtre kağıdı kullanın. 
	Not: Büyük jel çok kırılgandır çok özenle ele.</li>
	<li>Pozitif yüklü naylon membran (örneğin Hybond N + membran) jel üstüne yerleştirilir ve bu electroblotted 20 V 90 dk 40 mM Tris-asetat (pH 8.1), 2 mM EDTA Aktarım arabellek kullanarak için.</li>
	<li>Crosslink RNA UV ışık kullanarak membran için (0,12 J/cm 2). 
	Not: Membran-ebilmek şimdi var olmak stok oda sıcaklığında ve protokol burada duraklatıldı.</li>
</ol> 8. Tasarım ve sondalar doğrulanması Not: dikkatli tasarım ve Kuzey leke probları doğrulanması güvenilir sonuçlar elde etmek ve diğer RNA türleri ile istenmeyen çapraz hibridizasyon önlemek için çok önemli.
<ol><li>Kullanım probları olarak kısa sentetik oligonucleotides. Sonda sıra faiz tRNA dizisi en benzersiz bir parçası için tamamlayıcı - bu kez antikodon döngü olduğunu bir şekilde Tasarla. 
	Not: Çeşitli organizmalar üzerinden tahmin edilen tRNA sıralarının listesini veritabanı (GtRNAdb) 21 genomik tRNA bulunabilir.</li>
	<li>Ayarlama bir tahmin almak için dizinin uzunluğunu erime sıcaklığı 55-65 ° c</li>
	<li>Patlama (temel yerel hizalama arama aracı) seçilmiş sıra sıra 22 içinde açıklandığı gibi seçili tRNA için benzersiz olduğunu doğrulamak için deneyde kullanılan bakteriyel zorlanma genom dizisi karşı. 
	Not: Tablo 1 E. coli K12 birkaç farklı tRNA için önerilen sonda serilerini listeler. Sonda faiz tRNA için belirli ise, sadece iki grup Kuzey leke (şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA) görünür ve yalnızca bir grup şeritte deacylated örnek (doldurulmamış tRNA) ile görülür. Daha--dan iki grup varsa veya daha fazla sonda özgüllük doğrulanmasını isterseniz, bkz.</li>
</ol> 9. Kuzey blot hibridizasyon Not: Aşağıdaki adımlarda, membran sırayla probları başvurusu için belirli bir sonda da dahil olmak üzere istediğiniz belirli tRNA tamamlayıcı ile melezleşmiştir tRNA selC.
<ol><li>Membran bir hibridizasyon tüpü yerleştirin ve 6 mL hibridizasyon çözüm ekleyin (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, %0,5 (w/v) SDS, 100 mg/mL sheared ve denatüre ringa balığı sperm DNA ve 5 x Denhardt &#39; s çözüm (100 x Denhardt &#39; s çözüm % 2 sığır serum albümin, % 2 polyvinylpyrrolidone 40 ve % 2 = Ficoll)).</li>
	<li>Ön arabellek için 1S 42 ° C. Ekle 30 pmol radyoaktif oligo-DNA prob 5 dönen membran melezlemek &#39; - sonu - etiketli ile 32 (Sambrook et al. tarafından açıklandığı gibi hazırlanmış P 23) Not: dikkat, 32 P yüksek enerjili beta emisyonları önemli cilt ve göz doz tehlike sunabilirim. 32 s. radyoaktif atık kullanarak, uygun kurumsal güvenlik protokollerini göre atılmalıdır zaman gerekli tedbirleri alınmalıdır.</li>
	<li>Membran gece 42, dönen sonda kuluçkaya ° C. Kaldır tek kullanımlık 10 mL pipet kullanarak soruşturma. 
	Not: Eğer bir dolaba saklanan sonda kullanılabilmesinden.</li>
	<li>Hibridizasyon tüpte membran 0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS oda sıcaklığında 50 mL kısa bir süre içinde yıkayın. 
	Not: Bu ilk yıkama çok ilişkisiz sonda içerir ve son derece olarak radyoaktif işlenmeli.</li>
	<li>Tekrar bir kez 9,4 adım, o zaman bir düz plastik konteyner veya bir kapak dahil olmak üzere tepsi membran taşıma. Yıkama solüsyonu (0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS) membran kapak ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama çözüm değiştirin ve çamaşır kadar tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı (, çözüm yıkama kez 3-4 değişiklikleri) elde etti. Nasıl boş bir alanı radyasyondan membran ölçerek gürültü oranı sinyal değişiklikleri algılamak ve nerede sonda özellikle tRNA melezleşmiştir alanına karşılaştırmak için bir Geiger-Müller tüpü kullanın.</li>
	Sonda zar maruz kaldıktan sonra şerit edebilmek için <li>emin olun (önemli) membran önce striptiz yordamı kurumasına olduğunu. Membran bir ince plastik torba veya sıkıca plastik kullanarak sarın ve hava-teyp veya kaynak tarafından sıkı sıkıya bağlanmanızı mühür şal yerleştirin. Mühürlü membran phosphorimaging ekrana koyun. 
	Not: Phosphorimaging ekrandaki gerekli çekim hızı belirlenir sonda, özel faaliyetin tarafından RNA miktarı fo probedr ve sonda ve can hibridizasyon etkinliğini büyük ölçüde değişir; birkaç gün için bir kaç dakika uzaklıktadır. Deneyimi ile membran Geiger-Müller tüpü ile algılanan radyasyon şiddetini gerekli çekim hızı iyi bir gösterge sağlar. Güvenilir miktar için ekran değil pozlanmış önemli.</li>
	<li>Bir lazer tarayıcı kullanarak phosphorimaging ekran tarama ve dosyaya kaydetmek &#34; .gel &#34; biçimi. 
	Not: Bir yüksek sinyal gürültü oranı güvenilir miktar için gereklidir. Bir tRNA sondalama iki bantlarında sonuçlanmalıdır; bir içeren aminoacylated tRNA (daha yavaş geçiş) ve bir içeren deacylated tRNA (daha hızlı geçiş). Bkz: Şekil 2.</li>
</ol> 10. Membran sıyırma Not: membran için başka bir tRNA probed önce önceki sonda ilk membran sıyırma tarafından kaldırılmalıdır.
Membran kapak ve membran dökmek için <ol><li>ısı yeterince sıyırma arabellek (15 mM NaCl, 1.5 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS). 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Tekrarlama adım 10.1 radyasyon yok kadar bir Geiger-Müller tüpü ile tespit; membran-ebilmek şimdi var olmak bölüm 9 açıklanan adımları izleyerek yeniden melezleşmiştir.</li>
</ol> 11. TRNA miktarının ve düzeyleri şarj <ol><li>yükü görüntüleme .gel dosyasına yazılım (Tablo reçetesi görmek). Nereye sinyal 3A rakam gösterildiği gibi düzensiz, olabilir bu yolun genişliğini çoğunu yayılmıştır ancak bantları kenarları hariç böyle bir şekilde her örnek yolları boyunca dikey bir çizgi çizmek.</li>
	<li>Visualize'ı tıklatarak her şeritli gelen sayar &#34; analiz &#34;-&#62; &#34; grafik oluşturmak &#34;. Şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA her şeritli gelen temsil eden iki doruklarına şekil 3B ' gösterildiği gibi tanımlarken.</li>
	<li>Edinmek sayıları her ayında en yüksek tıklatarak &#34; analiz &#34;-&#62; &#34; alan rapor &#34; ve her iki doruklarına altına alan kayıt.</li>
	Ne zaman leke tRNA selC ve en az bir tRNA ilgi için probed <li>tRNA tRNA selC ilgi düzeyleri normale.
	<ol><li>Her şeritte spike hücreler kaynaklanan tRNA oranını hesaplamak ve toplam sinyal denklemi kullanarak bu şeritte değerden çıkarmak: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg" /> Not: Burada, Örnek tRNA bir tek şeritli bir membran için istenen tRNA; probed elde edilen sinyal = Örnek selC tRNA selC için; probed aynı membran aynı lane elde edilen sinyal = Ref tRNA için istenen tRNA; probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal = Ref selC tRNA selC için probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal =.</li>
		Normalize etmek <li>tRNA selC sinyal aynı Lane tarafından düzeltilen tRNA değeri her Lane bölmek. 
		Not: tRNA selC sinyal katkısı örneklenen hücrelerden ihmal edilebilir düzeydedir (bkz: Şekil 2, lane etiketli &#34;-selC &#34;).</li>
	</ol></li> <li>Her iki zirveleri sinyal toplamı ile dolu tRNA temsil eden en yüksek sinyal bölerek düzeyinde her lane için şarj oluyor tRNA hesaplamak (ücret + doldurulmamış).</li></ol>

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı aynı anda belirli E. coli şarj düzeyini ölçmek açıklar tRNA ve farklı örneklerinde tRNA göreli düzeyleri karşılaştırın. 1) örnekleri hücresel tRNA şarj düzeyleri, 2) tRNA miktarları göreli tRNA düzeyleri farklı örneklerinde güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir şekilde normale ve sp 3) tutulduğunu böyle bir şekilde işlemek için protokol kritik noktaları vardır tRNA ilgi için seçili sonda ecificity. Bu noktalar aşağıda ayrı ayrı ele alınmaktadır.
tRNA arıtma
TRNA E. coli hücresel şarj seviyelerini korumak için en iyi duruma getirilmiş nazik bir şekilde saf. Bu iletişim kuralı öncelikle 150 kısa RNA'ların ayıklar bizim deneyimdir nt, böylece tRNA arıtılmış RNA büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu nedenle, E. coliüzerinden toplam RNA arındırmak için bu iletişim kuralını kullanmanız önerilmez. Burada sunulan protokolü de algılama ve küçük RNA (sRNA) olmadan herhangi bir daha fazla uyarlamaları gibi diğer RNA'ların miktar uygun olmalıdır. RNA ayıklama protokolü için kısa RNA serileri zenginleştiren çünkü sRNA soruşturma altında basit ifade edilir olsa bile aynı zamanda kullanım bulmalısınız.
Normalleştirme spike hücreler tarafından
TRNA düzeyleri farklı örnekler üzerindeki karşılaştırmak için RNA örnek örnek çeşitleri için düzeltmek için mevcut tüm örneklerdeki hücre başına ortalama aynı numarasında bir transkript düzeyleri tRNA düzeylere normalleştirmek gereklidir Kurtarma ve jel yükleme. Bu amaçla, biz önce RNA arıtma nadir tRNAselC overexpress hücrelere başvurma % 5 ile örnekleri spike. Nerede yok endojen RNA'ların kesin olarak aynı hücresel konsantrasyonu bulunabilir bilinmektedir koşullarında tRNA düzeylerinin karşılaştırılması verir çünkü spike yöntem endojen bir RNA referans olarak kullanarak üzerinden tercih edilir. E. coli hücreleri spike-kullanılarak dezavantajı o %5 ilave E. coli RNA tüm deneysel örnekleri için eklenir nerede bu ilgi RNA sinyal için katkıda vardır. Bu önyargı için tarafından bir örnek sadece spike hücreler her Kuzey leke üzerinde içeren ve RNA değerleri 11.4.1 adımda anlatıldığı gibi düzeltme dahil muhasebeleştirilir. TRNAselC vahşi türü hücrelerdeki olduğunu ifade düşük (bkz. Şekil 2) diğer tRNA öyle karşılaştırıldığında miktar önemli bir fark yapmaz ve böylece ihmal. Ancak, nerede selC ifade edilen bir T7 düzenleyici tarafından yüksek kopya plazmid, başvuru zorlanma içinde MAS1074, tahmin ettiğimiz en az 1000 kat daha fazla tRNAselC 1 mM IPTG huzurunda üretilir daha E. wildtype tarafından üretilen coli herhangi bir koşul altında K-12. MAS1074 tam IPTG indüksiyon iki nesil sonra büyümeye sona erer. Bu noktada, tRNAselC indüksiyon Kültür Kültür farklılıkları küçük, ve tüm aliquots spike hücreler tek bir deney olarak bu iletişim kuralı için bir endişe değil MAS1074 aynı indüklenen kültüründen alınır. MAS1074 alternatif, hücre olan RNA hibridizasyon sonda ile cross-react değil bir organizmadan spike hücreler kullanılabilir. Sulfolobus solfataricus hücreleri başarıyla spike-in E. coli tRNA4ile deneyler için kullanılmaktadır. Olup aynı verimlilik ile S. solfataricus lyses belirsiz olduğu gibi Ancak, E. coli spike hücreler deneysel hücrelerinin hücre lizis derecesini daha doğru yansıtacak biçimde aşikardır E. coli. Ayrıca, S. solfataricus büyüyen bir oluşturma süresi ~ 16 h ile 85 ° C'de büyüdükçe daha yorucu olabilir.
Seçili tRNA özgüllük sağlanması
Aminoacylated ve deacylated tRNA başarıyla geçmişse arıtılmış iki grup Kuzey membran üzerinde tespit edilmelidir. İki grup arasındaki mesafe ve soruşturma altında belirli tRNA bağlı olarak farklı olacaktır boyutu, kutup özellikleri ve belirli bir amino asit özellikle tRNA5 bağlandığında ateşlenmesine uyum arasındaki fark, kombine bir sonucudur . Örneğin, aminoacylated ve deacylated arasındaki mesafe tRNA Şekil 2' de görüldüğü gibi daha tRNAgltTUVWiçin tRNAargVYZQ için büyüktür. Burada RNA ayırmak için kullanılan jel büyük boyutu sonucu olarak, çözünürlük şarj edilmiş tRNA doldurulmamış dan ayırt etmek için aynı zamanda birbirinden farklı tRNA uzunluğu, sıra aralarındaki farklılıkları nedeniyle çoğu ayırt etmek için yeterince yüksek olduğunu kompozisyon ve değişiklik desenler. Hatta isoaccepting tRNA tRNA2kabul lösin gösterildiği gibi ayırt edilebilir. Ancak, sıra fark sadece bir G T ikame için olduğu gibi bu çalışmada bu tRNAleuPQV tRNAleuT, ayırt etmek mümkün olmadı unutmayın.
Daha--dan iki grup Kuzey membran üzerinde görünüyorsa bu sonda ile diğer RNA'ların cross-reaction bir sonucu olabilir. Sıcaklık artırarak yıkama adım (adım 9.5) sıkılık artan genellikle bunu çözebiliriz. 30 dk 55 ° C'de yıkama genellikle yeterli olur. Yıkama sıkılık artan çapraz-hibridizasyon kaldırmaz tamamlayıcı tRNA dizisinin (genellikle kısmen üst üste gelen) farklı bir parçası yeni bir sonda tasarlamak için çözüm olabilir. Ek bantları-ebilmek da var olmak yeterli membran soyma bir sonucu olarak bir önceki sonda gelen etkilenmişimdir. Bunu önlemek için zar sondalama önce yeniden açarak bir Şerit denetimi yapın. Grup denetimi Ultrasonda görünür membran ek sıyırma gerekebilir. Genellikle bir membran en az 8 - 10 kez yeniden incelemek mümkündür ama sonra birkaç probları tamamen şerit zor olabilir. Bu durumda ise, membran 32P bozunmaları hızlı yeniden sondalama daha önce bir kaç ay depolanabilir.
Daha fazla sonda özgüllük doğrulanması elde edilebilir bir Kuzey gerçekleştirerek leke bir koşullar kümesi altında hasat hücreler nerede faiz transkript tahmin edilebilir bir şekilde etkilenmesi bekleniyor. Örneğin, plazmid veya soydaş amino asit, amino asit açlık gelen tRNA indüklenebilir ifade bir gelişmiş göreli ifade düzey veya daha düşük şarj düzeyi, sırasıyla, faiz tRNA ile sonuçlanmalıdır.

Aşağıda, biz belirli tRNA miktarının bir yöntem mevcut ve kendi şarj ölçme düzeyleri Kuzey Blot tarafından. Bu yöntem ilk Varshney vd tarafından geliştirilen bir teknik üzerinde dayanır 1. hücre trichloroacetic asit (TCA) hasat ve RNA arıtma boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak, korunmuş2,3,4arasında tRNA ve amino asit ester bağı olduğunu. Aminoacylated tRNA nonacylated karşılıkları Jel Elektroforez ve seçkin Kuzey kurutma, tarafından kusura bakmayın ama aminoacylated azalmış bir hareketlilik için tRNA kovalent bağlı amino asit5tarafından neden jel içinde. Ayrıca, biz tRNA miktarları sık kullanılmayan tRNAselC 4overexpressing spike hücreler ilavesi ile normalize için bir iletişim kuralı mevcut.
tRNA bakteri hücre ve çeviri makineleri kesinlikle hayati bir parçası en bol moleküllerin bazıları. tRNA amino asitleri bağlama ve çeviri ribozomlara aktarabilirsiniz. Aminoasitler tRNA (aminoacylation veya şarj) için bağlama aminoasil tRNA sentetaz tarafından yönetilir. Farklı ücret tRNA göreli bolluk protein sentezi, kalitesini sağlamak için önemli çünkü tRNA için verilen mesajcı RNA (mRNA) kodon konağımız yakınındaki tRNA eşitlenmesi olasılığını artırır konağımız underrepresentation tahsil Yanlışlıkla onun amino asit büyüyen polipeptid zinciri ribozom6teslim. Şarj edilmiş tRNA önemini E. coli hücre geniş yanıt bir tRNA şarj düzeyleri ciddi bir düşüş olarak yansıtılır; sıkı yanıt. Sıkı tepki sırasında tRNA, ribozomal RNA'ların ve çoğu mRNA sentezi, amino asit biyosentezi ve stres hayatta kalma ile ilişkili belirli mRNA'lar transkripsiyon lehine indirilir ve hücrelerin büyüme oranı önemli ölçüde düşürdü7 . Ayrıca, bize ve diğerleri tarafından son iş E. coli aktif tRNA düzeyleri ayarlama olabileceğini düşündüren onun tRNA yanıt olarak çeviri4,8, limit gerilmeler çoğunluğu düşürür gösterdi Böyle stres ile başa çıkma için önemli. Böylece, güvenilir ölçümler tRNA zenginliği ve düzeyleri şarj tamamen bakteriyel stres yanıt-e doğru anlamak için önemli bir araç olacak.
E.coli rekombinant protein hızlı için yaygın olarak kullanılır ve türler arasında kodon kullanım farklılıkları nedeniyle bir sorun kez karşı karşıya9suboptimal ifadesidir. Bu ek tRNA rekombinant mRNA10çevirmek için gerekli ifade tarafından atlatılabilir. Böyle suşları seviyelerinde şarj tRNA ölçümleri sorun giderme çabaları rehberlik ve protein ifade en iyi duruma getirmek.
Bu yöntem, aynı zamanda "mischarging"; algılama sağlar Konağımız olmayan amino asit ile bir tRNA molekül aminoacylated. Farklı amino asitler tarafından Aminoacylation-polyacrylamide jeller1,11biraz farklı hızları ile geçirilecek bir tRNA neden olabilir. Bazı durumlarda, yöntem aynı zamanda aksi takdirde aynı tRNA3farklı değişiklik desenleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Düzeyleri şarj tRNA incelenmesi olduğunu periodate için oksidasyon başka bir biyokimyasal yordamı kurdu. TRNA korunuyorsunuz aminoacylated periodate oksidasyon ve doldurulmamış tRNA değil gözlem yöntemi kullanır. Sonra tRNA şarj şarj düzeyleri hasat RNA'ın tahmin etmek için kullanılan oksidasyon tedavi periodate. Ancak, birkaç tRNA şarj böylece biraz yanlışlık12-mek şartıyla tedavi tarafından etkilendiği gösterilmiştir. Yöntem burada doğrudan saf RNA şarj, böylece herhangi bir önyargıları kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar hariç önlemler sundu. Bu yöntemin bir sınırlama yalnızca bir o tRNA türler algılandığında bir zamanda, öylesine her ne kadar aynı Kuzey leke-ebilmek var soymak ve birden çok tRNA için reprobed zaman alan ve pek çok tRNA üzerinde veri toplamak biraz zahmetli olması.
Örnekleri birbirlerine normalleştirme için güvenilir bir yol hedefi farklı örnekler üzerindeki göreli bir molekül düzeyde karşılaştırmak için nerede çalışmalarda önemlidir. Burada küçük bir aliquot nadir tRNAselC overexpressing E. coli hücre içinde bir spike RNA arıtma önce deneysel örnekleri eklendiği RNA için normalleştirme işlemi tanıtmak. Bu yöntem sadece tRNA incelerken ama RNA'ın herhangi bir türün göreli miktar için deneysel Kur öyle ki hiçbir endojen RNA olmak güvenilir olabilir ne zaman tüm örnekleri aynı hücresel konsantrasyon mevcut yararlı olur. Örneğin, göreli miktarları arasında farklı başka bir RNA'ın karşılaştırmak için endojen bir başvuru13örnekleri gibi bir "temizlik" RNA gibi ribozomal RNA düzeyini kez kullanılır. Ama örnekleme bir stres yanıt15,16,17 veya sırasında oluşursa ribozomal RNA için durum olabilir gibi bu küçük kullanımı başvuru RNA hücresel konsantrasyonu örnekleri arasında değişir durağan faz17girmesinden. Spike hücreler RNA arıtma önce deneysel örnekleri için ek normalleştirme örnekleme kurulumunu bağımsız sağlam ve doğru bir yol sağlar. Başka bir belirli bir veya daha fazla spike içinde RNA'ların deneysel örnekleri eklenmesinden sonra RNA arınma yoludur. Ancak, bu yöntem için RNA kurtarma farklılıklarını örnekler arasındaki hesap değil.
E. coli hücreleri kullanarak bir deneyde E. coli olarak (bkz: şekil 1) spike hücreler olarak RNA gönderme yapıyor bunun dezavantajı o overexpress Ayrıca eksojen E. coli az miktarda toplam RNA örnekleri. Biz bu ek için yalnızca spike hücreler (bkz. Şekil 2, lane "selC" etiketli leke Kuzey) deneysel örnekleri ile paralel olarak içeren bir örnek analiz ederek doğru. Sunulan protokolü E. coli K-12 için geliştirilmiş ancak çoğu bakteriyel türler için geçerli olması muhtemeldir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) herhangi bir canlı translasyonel makinelerin önemli bir parçasıdır. tRNA bağlamak ve amino asitler için çeviri ribozom aktarın. Farklı tRNA göreli seviyeleri ve aminoacylated oranı tRNA toplam tRNA, şarj düzeyi olarak bilinen için doğruluk ve çeviri hızını belirlemede önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bolluk ve şarj tRNA düzeyde protein sentezi, örneğin çeşitli stres koşullarında okurken ölçmek için önemli değişkenlerdir. Burada, tRNA hasat ve doğrudan göreli bereket ve Escherichia colibelirli tRNA türler mutlak şarj düzeyini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TRNA tRNA ve onun amino asit arasında değişken bağ korunmuş şekilde hasat edilir. RNA sonra Jel Elektroforez ve kurutma, ücret ve doldurulmamış tRNA ayrılması hangi sonuçlar Kuzey tabi tutulur. Normalleştirme spike hücreler ilavesi nedeniyle farklı örneklerinde belirli tRNA düzeyde karşılaştırılabilir. Önce RNA arıtma, her örnek için nadir tRNAselC yatırıma E. coli hücrelerinin % 5 ekleyin. Bir örnek ilgi tRNA tür miktarı o zaman tRNAselC aynı örnek miktarı için normalleştirilmiş. Ayrıca spike hücreler RNA arıtma önce Ayrıca hücre lizis verimliliği tüm farklılıkları örnekleri arasında için hesaplar arıtılmış spike bileşenini RNA'lar ek avantajı vardır.

Yordamı kullanarak burada, bereket ve üç tRNA düzeyde E. coli K-12 öncesi ve amino asit açlık sırasında ölçüldü şarj açıklanır.
Arginin auxotroph süzün NF9154 (thr Leyi onun argH thi mtl supE44) BEZLERİ en az orta % 0,4 gliserol, 50 µg/mL treonin, lösin, arginin ve 5 µg/mL histidin, sallayarak 37 ° C'de ile takıma en az on nesiller için yetiştirilen oldu 160 d/dak. Arginin açlık filtrasyon kültür ve resuspension taze BEZLERİ orta yukarıda ama arginin olmadan kullanılmaya başlandı. Arginin açlık sırasında protein sentezi şiddetle azalır, ancak varolan proteinler ciro tarafından yayımlanan arginin kullanarak düşük bir düzeyde devam eder. Örnekleri o zaman hasat Puan belirtilen şekil 4' te. Sonra tüm örneklerini TCA hasat edildi, tRNAselC, overexpressing MAS1074 spike hücreler % 5 eklendi her örnek için gösterildiği gibi şekil 1. RNA örnekleri saf, Elektroforez tarafından ayrılmış ve iletişim kuralında tanımlandığı gibi bir membran deyimiyle. Membran tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisRve tRNAselC, Şekil 2' de görüldüğü gibi sondaj. Radyasyon sinyal her Lane her dört sondalar gibi şekil 3, resimli ve düzeltilmiş ve normalleştirilmiş Bölüm 11'de açıklandığı gibi bir sayısal. Sonuçları şekil 4' te sunulmuştur. Şekil 4A test tRNA türler düzeyleri hızla son zamanlarda bildirilen4olarak amino asit açlık sırasında azalma gösterir. Şekil 4B gösterir Bu düzeyleri davranır beklendiği gibi şarj tRNA: diğer tRNA şarj düzeyleri üzerine biraz artırmak ise arginin kabul tRNA şarj edilmiş kısmını hızla arginin büyüme ortamdan kaldırılması üzerine düşer açlık tRNA birikir ne zaman substrat protein sentezi4için eksikliği nedeniyle ribozomlar decharging onların hızı azalır tahsil çünkü. Daha fazla açlık dönemi dolu tRNA kesir büyük oranda bir kalan tRNA, decharging sonuçlanır tRNA Havuzu (şekil 4A), çoğunluğu bozulması nedeniyle yaklaşık öncesi açlık düzeyleri azalır ribozom. Buna karşılık, tRNAargVYZQ şarj edilmiş kısmını en az iki nedenden dolayı artırır; 1) sıkı yanıt aktivasyonu anlamına gelir mRNA tRNAarg, ücret değil, çeviri için sınırlayıcı bir faktör haline gelir ve 2)arg's tRNA toplam havuz (şekil 4A) çok düşük toplam tRNAdaha büyük bir kısmını arg arginin aynı küçük oranda şarj edilebilir. Bu deneme nasıl eşzamanlı ölçümler tRNA bolluk ve tRNA şarj düzeyleri sağlar yüksek kaliteli protein sentezi hücre içindeki koşulları hakkında bilgi gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig1.jpg"> 
Şekil 1. Ek örnekler için spike hücreler. Örneğin, E. coli NF915 tek kültürünün örneklerinden bir saat serisi öncesi ve amino asit açlık sırasında hasat. NF915 büyüme eğrisi şematik gösterilir nerede mavi noktalar örnek hasat noktaları gösterir. Axes günlük ölçek vardır. Deneysel culture(s) örnekleri Bölüm 3'te açıklandığı gibi hasat. Spike-in yük MAS1074 büyüme eğrisinin bir şematik mavi bir nokta gösterilen örnek hasat amacı ile de gösterilir. Rakam, tüm deneysel örnekleri (Bu örnekte E. coli NF915) bir aliquot spike hücreler aynı başvuru kültüründen almak göstermek için noktasıdır. Her örnek için hesaplanan deneysel hücrelere %5 spike hücreler eklenir (bkz: Bölüm 4) hücre kültürleri OD üzerinde dayalı. Daha sonra RNA tüm örneklerini saflaştırılmış ve Kuzey lekesi için kullanılan. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig2.jpg"> 
Şekil 2. Fosfor Imager tarama Kuzey bir leke için belirtilen tRNA probed. Membran E. coli zorlanma NF915 önce ve sonra indüksiyon arginin açlık (dakika) belirtilen süre noktalarda hasat RNA içerir. Ayrıca, membran nerede spike hücreler ihmal örnekleri iki şeritleri içeren (-selC DA ve - selC), ve bir lane spike bileşeninden RNA içeren hücreleri tek (selC). -SelC DA örnek kimyasal olarak deacylated içeren tRNA. Şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA türleri temsil eden iki grup açıkça ayrılır. Not tRNAselC Lanes ihmal edilebilir sinyal olmadan spike hücreler eklendi. Aynı membran gittikçe soydu ve solda gösterilen tRNA için reprobed. Üst leke kutulu alanda sonraki tRNA probings için gösterilen leke kısmını gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig3v2.jpg"> 
Şekil 3. Kuzey leke quantification. tRNA bereket yazılımı kullanılarak ölçülür. (A) A tek şeritli gelen tRNAargVYZQiçin probed Şekil 2 ' deki görüldü Kuzey leke. Üst ve alt ok belirtmek aminoacylated tRNA ve deacylated tRNA, anılan sıraya göre. Lane ile paralel kırmızı çizgiler eklenir ve miktar alanını tanımlamak için kullanılır. (B) miktar (A) görülen iki kırık kırmızı çizgiler içinde sinyal nerede yatay eksen (piksel cinsinden) (a) hattının üst mesafe gösterir ve dikey eksen (adet) sinyalin yoğunluğunu gösteren bir grafik olarak tasvir. İki sinyal içeren kaynaklanan doruklarına aminoacylated tRNA ve deacylated are tRNA, anılan sıraya göre el ile tanımlanmış. Daha fazla çözümleme için dışa aktarılan her iki doruklarına altına alan karşılık gelen değer veridir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig4.jpg"> 
Şekil 4. Temsilcisi Sonuç: miktar tRNA zenginliği, bird düzeyleri arginin açlık sırasında şarj. Şekil 2' de gösterilen Kuzey leke üzerinde gruplarından miktar. (A) göreli bolluk tRNAgltTUVW (kırmızı), tRNAargVYZQ (mavi) ve tRNAhisR (yeşil). Sıfır dakika (sadece açlık başlangıcından önce hasat örnekleri) bulunan düzey 1 olarak ayarlanır. (B) düzeyinde (A) olduğu gibi aynı üç tRNA şarj oluyor. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sonda özgüllük</td>
			<td>Sonda sıra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAargVYZQ</td>
			<td>5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAgluTUVW</td>
			<td>5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAhisR</td>
			<td>5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuPQVT</td>
			<td>5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuU</td>
			<td>5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuW</td>
			<td>5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuX</td>
			<td>5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuZ</td>
			<td>5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAlysQTVWYZ</td>
			<td>5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAthrV</td>
			<td>5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAtyrTV</td>
			<td>5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAselC</td>
			<td>5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. Tablo seçili tRNA E. coli K-12. için önerilen sonda sıralarının

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

9.2K Görüntüleme.  University of Copenhagen. Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Video: Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Biyokimya

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

Caenorhabditis elegans 2-Arachidonoylglycerol Quantification için Bir Deuterated Standart Sentezi

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...