Wir danken Dr. Claudia Cremers für ihre hilfreiche Ratschläge auf Chaperon-Assays. Ken Wan ist für seine technische Unterstützung bei HdeB Reinigung anerkannt. Diese Arbeit wurde von der Howard Hughes Medical Institute (zu JCAB) und den National Institutes of Health Zuschuss RO1 GM102829 zu JCAB und UJJ-UD unterstützt wird von einem Postdoc-Stipendium gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zur Verfügung gestellt.

1. Expression und Reinigung von periplasmatischen HdeB HINWEIS: HdeB wurde in E. ausgedrückt coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB 10 und gereinigt aus dem Periplasma auf Polymyxin Lyse beherbergen. <ol><li> Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von E. coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB 10 in 30 ml LB , enthaltend 200 ug / ml Ampicillin (LB Amp) beherbergt. Beimpfen von vier 1 l - Kulturen von LB Amp wachsen und sie bei 37 ° C und 200 rpm bis OD 600nm von 0,7 erreicht ist. Dann fügen 300 uM IPTG die Expression von HdeB zu induzieren und die Wachstumstemperatur auf 30 ° C ab. </li><li> Nach 5 h Proteinexpression bei 30 ° C, Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Wasche das Zellpellet mit 100 ml die Zellen erneut bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) und zentrifugieren puffern. </li><li> Anschließend resuspendierendas Zellpellet in 80 ml Puffer A, enthaltend 1 mg / ml Polymyxin-Sulfat. Für eine effiziente Zerstörung der äußeren Membran, rühren Sie vorsichtig die Suspension für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge die cytoplasmatische Fraktion und Zelltrümmer zu entfernen, die Suspension für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C. Dies resultiert in ~ 60 ml Überstand mit dem löslichen HdeB enthält. </li><li> Dialysieren des Überstandes des periplasmatischen Extrakt über Nacht gegen 150x Volumen Puffer B enthält (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0), um eine Dialysemembran mit 6 kDa MW mit cut-off. Konzentriere die Proteine ​​auf 15 ml unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 3 kDa. Filtern die Proteinlösung eine 0,2 um Porenfilter. </li><li> Anwenden, die das Protein auf eine Anionenaustauscher-Chromatographiesäule (Säulenvolumen 5 ml), die mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min mit 5 Säulenvolumina Puffer B äquilibriert wurde. Sobald das Protein auf die Säule geladen wird, Waschen der Säule mit Puffer B für 10 min beieine Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min. Elute HdeB mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in Puffer B über einen Zeitraum von 50 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml / min 6. </li><li> Identifizieren Fraktionen, die HdeB 15% SDS-PAGE. Mischen Sie 20 ul Probe mit 5 ul 5x reduziert SDS-Ladepuffer. Last 10 ul auf das Gel, und führen in Tris-Glycin-Puffer (14,4 g / l Glycin, 2,9 g / L Tris, 1 g / L Natriumdodecylsulfat, pH 8,3). Führen Sie das Gel bei 150 V, bis der Bromphenol Band nahe dem Boden des Gels (~ 45 min) gewandert ist. </li><li> Pool aller HdeB enthaltenden Fraktionen, bei 4 ° C dialysiert über Nacht gegen 4 L HdeB Aufbewahrungspuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) und konzentriert, um das Protein zu etwa 300 &amp; mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht cut-off von 3 kDa. Bestimmen Sie die Konzentration von HdeB bei 280 nm unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε 280nm = 15.595 M -1 cm -1. Bereiten Sie 100 ul Aliquots und gratfreiezie die Aliquots in flüssigem Stickstoff. HINWEIS: HdeB kann für mindestens 6 Monate bei -70 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Chaperone Aktivitätstest Thermisch Mit Ausklappen Malatdehydrogenase (MDH) HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Aggregation von thermisch porcine mitochondriale Malat-Dehydrogenase (MDH) bei verschiedenen pH-Werten wurde Entfalten überwacht, wie weiter unten beschrieben. Alle aufgelisteten Proteinkonzentrationen beziehen sich auf die Monomer-Konzentration. <ol><li> Zur Herstellung von MDH, dialysieren MDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 100 &amp; mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa. HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von MDH ist erforderlich, da MDH als Ammoniumsulfatlösung geliefert wird. </li><li> Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren Sie das Protein für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen MDH-Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε &lt;sub&gt; 280 nm = 7.950 M -1 cm -1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von MDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung. </li><li> Platz 1 ml Quarzküvette in ein Fluoreszenz-Spektralphotometer mit temperaturgesteuerten Probenhalter und Rührer ausgestattet war. Set λ ex / em bis 350 nm. </li><li> Fügen geeignete Volumina von vorgewärmten (43 ° C) Puffer D (150 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl) zu den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) in die Küvette und set die Temperatur in den Küvettenhalter bis 43 ° C. Das Gesamtvolumen beträgt 1,000 &amp; mgr; l. </li><li> Hinzufügen 12,5 uM HdeB (oder alternativ das gleiche Volumen an HdeB Speicherpuffer für den Puffersteuerung) zu dem Puffer, gefolgt von der Zugabe von 0,5 uM MDH. Beginnen Lichtstreuung zu überwachen. Inkubieren Sie die Reaktion für 360 sec ausreicht, damit der MDH Entfaltung. </li><li> Erhöhen Sie den pH - Wert auf 7 durch Zugabe von 0,16-0,34 Volumen von 2 M ungepufferte K 2 HPO 4 und weiterhin reCording Lichtstreuung für eine weitere 440 sec. </li><li> Gesetzt, das Ausmaß der MDH-Aggregation, die in Abwesenheit des Chaperons an einem definierten Zeitpunkt nach der Neutralisation aufgenommen wird (hier nach 500 sec, wenn die maximale Lichtstreuung von MDH beobachtet wurde) auf 100%. Normalisieren HdeB Aktivität zu dem Lichtstreuungssignal von MDH in Abwesenheit von HdeB bei jeder angegebenen pH-Wert. </li></ol> 3. Nachweis von HdeB-LDH-Komplexbildung durch Analytische Ultrazentrifugation (AUC) HINWEIS: Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente von HdeB allein oder im Komplex mit thermisch Lactatdehydrogenase Entfaltung (LDH) wurden einer analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt werden. <ol><li> Zur Herstellung von LDH, dialysieren LDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 200 &amp; mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa. HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von LDH als LD erforderlichH wird als Ammoniumsulfat-Lösung zugeführt. </li><li> Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren LDH für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen LDH - Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε 280 nm = 43.680 M -1 cm -1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von LDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung. </li><li> Inkubieren 3 uM LDH in Gegenwart und Abwesenheit von 30 uM HdeB in Puffer D (pH 4 bzw. 7) für 15 min bei 41 ° C. HINWEIS: Die Inkubation von LDH bei höheren Temperaturen führt zu seiner vollständigen Aggregation und keine Chaperon Wirkung HdeB beobachtet werden. </li><li> Lassen Sie die Proben abkühlen auf Raumtemperatur. Dann laden Proben in Zellen mit einem Standard-Sektor 2-Kanal-Mittelstücke mit 1,2 cm Weglänge. Laden der Zellen in der Ultrazentrifuge und Äquilibrieren auf 22 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Sedimentation. </li><li> Spin-Proben bei 22 ° C und 167.000 xg in dem jeweiligen Rotor für 12 h und überwachen die Sedimentation des Proteins kontinuierlich bei 280 nm. Wie zuvor gezeigt, wird das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, wenn das übertragene Lichtintensität jedes Kanals gemessen wird, anstatt Extinktion. Dies verbessert auch die Qualität der nachfolgenden Datenanpassung. </li><li> Führen Sie die Datenanalyse mit SEDFIT (Version 15.01b Dezember 2015), mit der kontinuierlichen c (n) Verteilungsmodell 17. Ein Tutorial beschreibt , wie SEDFIT verwenden können in Bezug 18 zu finden. <ol><li> Stellen Sie das Konfidenzniveau für die ME (Maximum Entropy) Regularisierung bis 0,7. </li></ol></li><li> Berechnen Puffer Dichte sowie die Viskosität unter Verwendung SEDNTERP 19. Zur Abschätzung der Menge von aggregiertem Protein Client, Vergleichen der Integrale von sedimentierten LDH in pH 4 bis pH 7 als Referenz. HINWEIS: Die Integration der Sedimentationsverteilungsmuster Plots können direkt in SEDFIT erfolgen. Alternative Software Sedimentationsgeschwindigkeits Daten analysieren kann in einer aktuellen Bewertung 20 gefunden werden. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Überwachung MDH Inaktivierung und Reaktivierung in Gegenwart von HdeB HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Neufaltung von ungefalteten pH-MDH wurde durch Überwachung MDH-Aktivität bei Neutralisation bestimmt. <ol><li> Inkubieren 1 uM MDH in Puffer D bei den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) für 1 h bei 37 ° C in Abwesenheit oder Anwesenheit von 25 uM HdeB. Dann verschieben sich die Temperatur auf 20 ° C für 10 min. NOTE: No MDH Neufaltung wurde in Gegenwart von HdeB beobachtet, selbst wenn MDH bei Temperaturen höher als 37 ° C inkubiert. </li><li> Zur Rückfaltung von denaturiertem Säure MDH, neutralisieren die Proben auf pH 7 durch Zugabe von 0,13-0,42 Volumen von 0,5 M Natriumphosphat, pH 8,0 initiieren. </li><li> Nach Inkubation für 2 h bei 20 ° C, MDH - Aktivität zu bestimmen durch Überwachung der Abnahme von NADH bei 340 nm 9. HINWEIS: MDH katalysiert die NADH-abhängige Reduktion von Oxalacetat zu L-Malat. <ol&gt; <li> Mischungs 50 ul der Inkubation der Reaktion mit 950 &amp; mgr; l Assaypuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 1 mM Oxalacetat und 150 &amp; mgr; M NADH). HINWEIS: Die Endkonzentration des MDH in dem Assaypuffer sollte 44 nm betragen. </li><li> Überwachen Sie die Änderung der Absorption mit einem Spektralphotometer, ausgestattet mit einem Steuerblock Peltier Temperatur auf 20 ° C. </li><li> Bericht des MDH-Aktivität im Vergleich zu 44 nM nativem MDH, die bei pH 7,0 gehalten wurde. </li></ol></li></ol> 5. Wirkung von HdeB Überexpression auf E. coli Überleben unter Säurestress HINWEIS: E. coli MG1655 genomische DNA wurde mit einem veröffentlichten Protokoll 21 isoliert. <ol><li> Amplify hdeB von E. coli MG1655 durch PCR - Primer hdeB mit - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT und hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. </li><li> Eingerichtet , um die PCR - Reaktion in 50 ul wie folgt: 10 &amp; mgr; l 5x - Polymerase - Puffer, 200 uM dNTPs, 0,5 uM Primer JUD2, 0,5 uM Primer JUD5, 150 ng genomische DNA MG1655, 0,5 ul DNA - Polymerase, fügen ddH 2 O auf 50 &amp; mgr; l. </li><li> Führen Amplifikation hdeB wie folgt: Schritt 1: 5 min bei 95 ° C, 1 Zyklus; Schritt 2: 30 sec bei 95 ° C, 30 sec bei 55 ° C, 30 sec bei 72 ° C, 40 Zyklen; Schritt 3: 10 min bei 72 ° C. </li><li> Klon resultierende PCR - Fragment in die EcoR I und BamH I - Stellen des Plasmids pBAD18 Verwendung von Standardverfahren für Restriktionsstelle Klonen. Man reinige das Plasmid ein Plasmid Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Überprüfen Sie die resultierende Plasmid durch Sequenzierung 10. </li><li> Transformieren Sie das Plasmid, das HdeB oder die leeren Vektorkontrolle pBAD18 in den Stamm BB7224 (Δ rpoH) (Genotyp: F -, λ -, e14 - [araD139] B / r [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: kan +; 16) unter Verwendung von chemisch kompetenten Zellen. HINWEIS: Dieser Stamm ist temperaturempfindlich. </li><li> Nach 45 sec Hitzeschock bei 42 ° C und vor der Beschichtung, Inkubation Zellen bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute. Führen Sie einzelne Kolonie Streifen-outs der positiven Klone und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur in 50 ml LB - Amp und pflegen die Zellen bei 200 Umdrehungen pro Minute und 30 ° C. </li><li> Verdünnte Nacht - Kulturen 40-fach in 25 ml LB Amp und wachsen die Bakterien in Gegenwart von 0,5% Arabinose (Ara) bei 30 ° C und 200 rpm bis zu einer OD 600nm = 1,0 bis HdeB Proteinexpression induzieren. </li><li> Für die pH-Verschiebung Experimenten verwenden LBDurch Zugabe geeigneter Mengen von 5 M HCl: Amp + Ara die Zellen zu OD 600 nm von 0,5 und passen sich den jeweiligen pH - Werte (pH 2,0, pH 3,0 und pH 4,0 hier) zu verdünnen. </li><li> Nach den angegebenen Zeitpunkten (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), um die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Mengen von 5 M NaOH neutralisiert. </li><li> Überwachen des Wachstums der neutralisierten Kulturen in Flüssigkultur für 12 Stunden bei 30 ° C unter Verwendung von OD-Messungen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

<html> Um den Mechanismus der Aktivierung und Chaperon-Funktion HdeB große Mengen HdeB zu studieren muss exprimiert und gereinigt werden. Eine Anzahl von Expressionsvektorsysteme sind für die Herstellung von großen Mengen eines Zielproteins, einschließlich pTrc oder pBAD-Vektoren zur Verfügung, von denen beide in dieser Studie verwendet wurden. Die Promotoren sind leicht zugänglich für E. coli - RNA - Polymerase und somit HdeB stark upregulated Ausdruck erlauben in jedem E. coli - Stamm. Dieser Aspekt ist besonders relevant für die in vivo - Überexpression Studie von HdeB unter sauren Stressbedingungen, in denen die rpoH defizienten Stamm verwendet wurde. Dieser Stamm fehlt den meisten der Chaperone und somit ist empfindlicher gegenüber verschiedenen Stressoren, einschließlich erhöhter Temperatur, niedrigem pH - Wert und oxidativen Stress 15. Als alternative, studiert Überleben ähnlich den hier vorgestellten können in Mutantenstämmen, die das Gen von Interesse fehlt, durchgeführt werden. t &quot;&gt; Das experimentelle Design für jede Chaperon-Aktivität oder Rückfaltungs Assay muss sorgfältig in Betracht gezogen werden, sowohl in Bezug auf die Art von Client, die Konzentration des Client-Protein und der Pufferbedingungen. In typischen Chaperon Assays, Modell Client Proteine, wie Citratsynthase, Luciferase, Malatdehydrogenase oder in hohen Konzentrationen von Harnstoff oder Guanidin-HCl denaturiert, und in Denaturierungsmittel-freie Puffer verdünnt Aggregations 23,13 zu induzieren. die Messungen in Gegenwart von Chaperonen zeigen das Ausmaß , in dem sie die Proteinaggregation verhindern. Alternativ werden die Clients thermisch aufgeklappten und Proteinaggregation überwacht wird. in beiden Fällen Lichtstreuungsmessungen als Anzeige für Proteinaggregation verwendet werden. Aktive Chaperone die Aggregation von Entfaltungs Client - Proteine verhindern, wodurch eine Abnahme in der Signallichtstreuung verursacht 6. beide dieser Versuchsaufbauten kann mit niedrigen pH Inkubation kombiniert werden. Zusätzlich zu den mol Beurteilungecular Chaperon - Aktivität durch ihre Fähigkeit , die Aggregation von bestimmten Client - Proteine zu verhindern , die Überwachung der Einfluss von Chaperonen auf Client - Umfaltung bei der Rückkehr in Nichtstressbedingungen können 24 getestet werden. Dies ist besonders einfach, wenn die Client-Proteine ​​enzymatische Aktivität besitzen, die als quantitative Anzeige für die Inaktivierung und Reaktivierung verwendet werden kann. Während Chaperon-vermittelte Rückfaltungs natürlich ein ATP-abhängiger Prozess ist, wurden periplasmatische Chaperone wie HdeA, HdeB und Spy worden Client angezeigt zu erleichtern in einem ATP-unabhängigen Art und Weise in Übereinstimmung mit dem Mangel an Energie in das Periplasma 9,25 Neufaltung. Untersuchung der pH-Optimum eines Säureschutz Chaperon wie HdeB ist anspruchsvoll aus verschiedenen Gründen: (i) Aggregation Verhalten sogar etablierte Chaperon-Client-Proteine ​​wie Citratsynthase bei saurem pH unterscheiden; und (ii) nur wenige Puffersysteme arbeiten im pH-Bereich zwischen 2-5 und sind suifür Tisch sowohl das Chaperon von Interesse und dem Client-Protein. Wir entschieden uns, Phosphatpuffer zu verwenden, obwohl wir wissen, dass dies ein nicht-idealen Puffersystem unter sauren pH-Bedingungen. Jedoch wurde Phosphatpuffer sein , gut geeignet zu charakterisieren HdeA als Säure aktiviert Chaperon 9,22 gefunden. Aggregation Messungen sind sehr empfindlich gegenüber Änderungen der Temperatur oder Pufferinhalt. Zur Beseitigung falsch-positive Ergebnisse empfehlen wir daher immer prüfen , um den Einfluss von Chaperon - Speicherpuffer auf den Client - Aggregation (Abbildung 1, Puffer - Steuerung). Manchmal Aggregation des Client-Protein tritt so schnell, dass selbst die beste Chaperon nicht in der Lage sein könnte, mit dem Aggregationsprozess konkurrierender. Es ist daher wesentlich Vorversuche durchzuführen, um die optimalen Testbedingungen zu finden. Ein gutes Beispiel für eine solche Situation ist in unserer Ultrazentrifugation Experimenten gegeben, in dem die Inkubation von LDH bei Temperaturen von&gt; 42 ° C schnell ist, so dass auch derGegenwart eines Überschusses von HdeB nicht LDH Aggregation verhindern. Darüber hinaus hat das Chaperon / Co-Chaperon - Verhältnis oder Chaperon / Client - Verhältnis sorgfältig 23 bestimmt werden. Wir begannen eine ziemlich hohe HdeB mit: MDH-Verhältnis von 50: 1 in Vorversuchen und das half uns pH 4 als optimale pH-Wert für die Chaperon-Aktivität von HdeB bei der Identifizierung. Wir setzten dann HdeB Analyse: MDH-Verhältnisse zwischen 1: 1 und 50: 1 bei pH 4, Identifizierung 25: 1 am wirksamsten Verhältnis zu sein. Im Gegensatz dazu unterdrückt HdeA MDH Aggregation als 10: 1 Chaperon: Client - Verhältnisse 6,9,10,22. Daraus schließen wir, dass HdeA, im Vergleich zu HdeB, effektiver bei der Unterdrückung der MDH-Aggregation als untere Chaperon ist: Client-Verhältnisse ausreichend waren, um vollständig MDH Aggregation unterdrücken. Ein weiterer Ansatz Chaperon-vermittelte Unterdrückung der Proteinaggregation beteiligt Spin-down-Assays zu untersuchen, in dem Client-Aggregate werden durch Zentrifugation entfernt und durch SDS PAGE quantifiziert. Dieser Ansatz wird auch für m geeignetonitoring den Einfluss von Chaperonen auf Proteinaggregation in vivo. Mutantenstämme, die entweder überexprimiert oder fehlt das Chaperon von Interesse sind Proteinentfaltung Stressbedingungen ausgesetzt. Anschließend werden die Zellen lysiert , und die löslichen und aggregierten Fraktionen werden getrennt und 15,16,26 quantifiziert. Zur Erfassung des Client-Chaperon-Komplexes, angewendet wir analytische Ultrazentrifugation. Es soll hier angemerkt, dass auf der Grundlage des experimentellen Aufbaus ist es nicht möglich, direkt die Menge an HdeB und LDH Monomere in diesem Komplex gebunden zu quantifizieren, da beide Proteine ​​bei 280 nm absorbieren. Falls gewünscht, kann die Stöchiometrie des Chaperon-Client-Komplex durch getrenntes Etikettieren Chaperon und Client-Protein mit einem Chromophor, dessen Anregungsmaximum liegt im sichtbaren Bereich bestimmt werden. Alternativ kann die Stöchiometrie von Kunden Chaperone innerhalb Komplexe durch Verwendung nativer PAGE mit quantitative Western-Blot gekoppelt bestimmt werden. </p&gt; Indem Sie die hier vorgestellten Protokolle konnten wir zwei molekulare Chaperone zu charakterisieren, HdeA und HdeB 9,10,22. Im Allgemeinen können diese Assays auch die Rolle von potentiellen Inhibitoren der molekularen Chaperone in Proteinrückfaltungs in vitro zu untersuchen , verwendet werden , und in vivo oder können synthetische Chaperone angewandt werden auf ihre Fähigkeit zu testen Client Aggregation unter Säurebeanspruchung zu verhindern. Darüber hinaus können die hier vorgestellten Protokolle können für Analysen von Punktmutationen und / oder verkürzten Varianten der säureaktivierten Chaperone, um Licht in den Mechanismus ihrer Aktivierung Schuppen verwendet werden.

Eine gemeinsame natürliche Umgebung , in der mikrobiellen Krankheitserregern Entfaltungsbedingungen Säure-induzierte Protein erleben , ist die Säugetier-Magen (pH - Bereich 1-4), deren sauren pH - Wert dient als eine wirksame Barriere gegen Krankheitserreger in Lebensmitteln 1. Proteinentfaltung und Aggregation, die durch Aminosäure-Seitenkette Protonierung verursacht wird, beeinflusst biologische Prozesse, Schäden Zellstrukturen und letztendlich verursacht Zelltod 1,2. Da der pH - Wert der bakteriellen Periplasma fast augenblicklich mit dem Umwelt pH äquilibriert durch die freie Diffusion von Protonen durch die poröse äußere Membran periplasmatische und inneren Membranproteine von Gram-negativen Bakterien sind die empfindlichsten Zellkomponenten unter sauren Stressbedingungen 3. Um ihre periplasmatischen Proteom gegen eine schnelle Säure-vermittelte Schädigung, Gram-negative Bakterien verwenden, um die säureaktivierten periplasmatischen Chaperonen HdeA und HdeB schützen. HdeA ist eine bedingt ungeordnet Chaperon <sup&gt; 4,5: Bei neutralem pH - Wert, ist HdeA vorhanden als gefaltete, Chaperon-inaktive Dimer. Bei einem pH - Verschiebung unter pH 3 wird HdeA die Chaperon - Funktion aktiviert schnell 6,7. Die Aktivierung von HdeA erfordert grundlegenden strukturellen Veränderungen, einschließlich der Dissoziation in Monomere, und die teilweise der Monomere Entfaltung 6-8. Einmal aktiviert, bindet HdeA an Proteine, die unter sauren Bedingungen entfalten. Es verhindert effektiv ihre Aggregation sowohl bei der Inkubation bei niedrigem pH-Wert sowie bei pH Neutralisation. Nach der Rückkehr auf pH 7,0, erleichtert HdeA die Neufaltung seiner Client - Proteine in einem ATP-unabhängige Art und Weise und wandelt wieder in seine dimere, Chaperon-inaktive Konformation 9. In ähnlicher Weise ist die homologe Chaperon HdeB auch Chaperon-inactive bei pH 7,0. Im Gegensatz HdeA jedoch erreicht HdeB die Chaperonaktivität seine scheinbare Maximum bei pH 4,0, Bedingungen , unter denen HdeB noch weitgehend gefaltet und dimeren 10. Außerdem senken, ferner mit den pH-Wert causes die Inaktivierung von HdeB. Diese Ergebnisse legen nahe, dass trotz ihrer umfangreichen Homologie, HdeA und HdeB in der Art ihrer funktionellen Aktivierung unterscheiden und ihnen so einen breiten pH-Bereich mit ihren Schutz Chaperon-Funktion zu decken. Einem anderen Chaperon, die in der Säurebeständigkeit von E. beteiligt ist coli ist die zytoplasmatischen Hsp31, die wiederhergestellt werden entfaltete Client - Proteine bis neutralen Bedingungen zu stabilisieren scheint. Die genaue Art der Hsp31-Aktion hat sich jedoch blieb rätselhaft 12. Da die anderen enteropathogenen Bakterien, wie Salmonella , die hdeAB Operon fehlt, ist es sehr wahrscheinlich , dass andere noch nicht identifizierte periplasmatischen Chaperonen könnte existieren , die in der Säurebeständigkeit dieser Bakterien 11 beteiligt sind. Die Protokolle hier vorgestellten erlauben die pH-abhängige Aktivität von Chaperon HdeB in vitro und in vivo 10 zu überwachen und angewendet werden kann , andere Chaperone zu untersuchenwie Hsp31. Alternativ kann das komplexe Netzwerk von Transkriptionsfaktoren, die die Expression steuern hdeAB potentiell durch den Assay in vivo Stress untersucht werden. Um die Chaperon - Funktion von Proteinen in vivo verschiedene Versuchsanordnungen charakterisieren können angewendet werden. Ein Weg ist die Proteinentfaltungsstressbedingungen anzuwenden und phänotypisch mutante Stämme zu charakterisieren, die entweder das interessierende Gen überexprimieren oder eine Deletion des Gens tragen. Proteom - Studien können durchgeführt werden , um festzustellen , welche Proteine nicht mehr Aggregat unter Stressbedingungen , wenn das Chaperon vorhanden ist, oder der Einfluss eines Chaperons auf einem bestimmten Enzym kann bei Stress - Bedingungen unter Verwendung von enzymatischen Assays 14-16 bestimmt werden. In dieser Studie haben wir uns für HdeB in einer rpoH Deletionsstamms überexprimiert, die den Hitzeschock - Sigma - Faktor 32 fehlt RpoH den Ausdruck aller wichtigen E. steuert coli Chaperone und deren Löschung ist bekannt sens zu erhöhenitivity auf Umweltstressbedingungen , die Proteinentfaltung 15 verursachen. Die in - vivo - Chaperon - Aktivität von HdeB wurde durch Überwachung ihrer Fähigkeit bestimmt , den pH - Empfindlichkeit des Δ rpoH Stamm zu unterdrücken. Insgesamt ist die hier vorgestellten Protokolle einen schnellen und einfachen Ansatz liefern die Aktivität eines säureaktivierten Chaperon in vitro als auch in der in vivo - Kontext zu charakterisieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

Bakterien werden häufig auf Umweltveränderungen ausgesetzt ist, wie beispielsweise Veränderungen in pH, Temperatur, Redox-Status, Lichtexponierung oder mechanische Kraft. Viele dieser Bedingungen verursachen Proteins in der Zelle entfaltet und nachteilige Auswirkungen auf das Überleben des Organismus. Eine Gruppe von unabhängigen, Stress spezifische molekulare Chaperone gezeigt wesentliche Rolle für das Überleben dieser Stressbedingungen wurden spielen. Während vollständig gefaltet und Chaperon-inaktiv vor Stress, diese Proteine ​​schnell entfalten und werden Chaperon-aktiv unter bestimmten Stressbedingungen. Einmal aktiviert, wobei diese bedingt ungeordneten Chaperone binden an eine Vielzahl von unterschiedlichen aggregationsanfällig Proteine, verhindern ihre Aggregation und entweder direkt oder indirekt Protein bei der Rückkehr in Nichtstressbedingungen Rückfaltungs erleichtern. Der primäre Ansatz ein detaillierteres Verständnis über den Mechanismus ihrer Aktivierung und Client-Erkennung für die Gewinnung umfasst die Reinigung und subsequent Charakterisierung dieser Proteine in vitro - Assays unter Verwendung von Chaperon. Follow-up - in - vivo - Stress - Tests sind absolut notwendig , um unabhängig die in - vitro - Ergebnisse bestätigt werden können . Dieses Protokoll beschreibt in vitro und in vivo - Verfahren der Chaperon - Aktivität von E. Charakterisierung coli HdeB, ein säureaktivierter Chaperon. Lichtstreuungsmessungen wurden als bequeme Auslese für HdeB Fähigkeit verwendet , um säureinduzierte Aggregation eines etablierten Modell Client Protein, MDH, in vitro zu verhindern. Analytische Ultrazentrifugation Experimente wurden angewandt, um die Komplexbildung zwischen HdeB und ihrem Kunden Protein LDH zeigen, Licht in das Schicksal von Client-Proteine ​​nach ihrer Rückkehr in Nicht-Stress-Bedingungen zu vergießen. Die enzymatische Aktivität Assays der Client-Proteine ​​wurden durchgeführt, um die Auswirkungen von HdeB auf pH-induzierte Client-Inaktivierung und Reaktivierung zu überwachen. Schließlich wurden die Überlebensstudien verwendet monitor den Einfluss von Chaperon - Funktion des HdeB in vivo.

HdeA und HdeB sind E. homolog coli - Proteine, bekannt periplasmatische Proteine gegen Säurestressbedingungen 10 zu schützen. Unsere Arbeit ergab, dass ähnlich wie HdeA, HdeB fungiert auch als eine Säure molekularen Chaperon aktiviert. Jedoch im Gegensatz zu HdeA, HdeB Funktionen bei einem pH, der noch potentiell bakterizide, aber deutlich höher als der pH - Optimum von HdeA 6,9,10,22. Um den pH - Optimum von HdeB der Chaperon - Aktivität in vitro zu untersuchen, nativer MDH wurde in vorgewärmten (43 ° C) Puffer des angegebenen pH - Wert in Gegenwart oder Abwesenheit von HdeB verdünnt. Nach 360 sec Inkubation wurde die Inkubation Reaktion neutralisiert. Diese Neutralisation löst die Aggregation von MDH bei 43 ° C 9. Repräsentative Ergebnisse zeigen , dass das Lichtstreuungssignal von MDH in Abwesenheit von HdeB dramatisch bei Neutralisation erhöht aufgrund der Aggregation von MDH (Abbildung 1, black Linie bei jedem pH-Wert). In Gegenwart von HdeB das Lichtstreuungssignal verringert wird signifikant bei Neutralisation von pH 4 oder pH 5 anzeigt , dass HdeB die Aggregation von MDH verhindert (Abbildung 1, pH 4 und pH 5). Im Gegensatz dazu jedoch bei der Neutralisation von pH 2 und pH 3, aggregiert MDH schnell im gleichen Maße unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von HdeB (Abbildung 1, pH 2 und pH 3), was darauf hinweist , dass das pH - Optimum für die Aktivität HdeB des Chaperon zwischen pH 4 und 5. die HdeB Speicherpuffer hatte keine Wirkung auf die Aggregation MDH (Abbildung 1, Puffersteuerung), was darauf hinweist , dass die reduzierte Lichtstreuungssignal von MDH in Gegenwart von HdeB bei pH 4 wegen seiner Chaperon - Funktion ist. HdeA ist Chaperon aktiv in seine monomeren und entfalteten Form bei pH 2-3, zeigt aber keine Aktivität bei oder über pH 4 10. Diese Ergebnisse legen nahe , dass HdeB um pH seine optimale Chaperon - Aktivität hat 4 10. <img al<html> t = &quot;1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg&quot; /&gt; Abb . 1: Chaperone Aktivität von HdeB bei saurem pH 0,5 uM MDH wurde in vorgewärmten Puffer D bei dem angegebenen pH - Wert in Abwesenheit oder in Gegenwart von 12,5 uM HdeB für 360 sec bei 43 ° C inkubiert. Der pH - Wert der Proben dann auf pH 7 erhöht wurde (wie durch das Sternchen gekennzeichnet) durch Zugabe von 0,16 bis 0,34 Volumen 2 M ungepufferte K 2 HPO 4 wurde MDH Aggregation für eine weitere 440 sec durch die Überwachung der Lichtstreuung bei 350 nm gemessen bei neutralen pH-Wert (blauer Hintergrund). Abbildung modifiziert von Dahl et al. 10 .Dieses Forschung wurde im Journal of Biological Chemistry ursprünglich veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Anzusprechen, ob HdeB bildet stabile Komplexe auch mit anderen Client-Proteine, 3 uM LDH thermisch bei 41 ° C in Gegenwart oder Abwesenheit von 30 uM HdeB bei verschiedenen pH-Bedingungen entfaltet wurde. Analyse des Sedimentationsverhaltens dieser Proben durch analytische Ultrazentrifugation wurde bei 22 ° C durchgeführt. Wenn LDH und HdeB bei pH zusammen inkubiert wurden 7 und 41 ° C blieb LDH ausschließlich tetrameren (Molekulargewicht von 120 kDa) und HdeB blieb dimere. Diese Ergebnisse zeigten , dass die Proteine bilden keine stabilen Komplexe bei pH 7 und LDH erleidet keine irreversiblen Veränderungen in Oligomerisierung bei einer 20 min Inkubation bei 41 ° C (Abbildung 2, grüne Linie). In ähnlicher Weise blieb HdeB dimeren bei Inkubation bei 41 ° C und pH 4,0, was anzeigt, daß niedrige pH-Inkubationvon HdeB beeinflussen Staat seine Oligomerisierung nicht einmal unter Hitzeschockbedingungen (Abbildung 2, rote Linie). LDH , wenn sie bei pH inkubiert 4 und 41 ° C in Abwesenheit von HdeB rasch aggregiert , wie durch die Tatsache angezeigt , dass 40% der LDH sedimentiert , bevor die erste Abtastung aufgezeichnet wurde (Abbildung 2, in der oberen rechten Ecke angegeben). Der verbleibende LDH erschien überwiegend als Monomer (Abbildung 2, blaue Linie) zu sedimentieren. Im Gegensatz dazu ist die Inkubation von LDH und HdeB bei pH 4 und 41 ° C verursacht einen großen Anteil an den beiden Proteinen zusammen Sediment (HdeB-LDH C), eine neue Spezies mit einem Molekulargewicht von 134 kDa bildet. Diese Art stellt wahrscheinlich einen Komplex zwischen HdeB Dimere und thermisch Entfaltung LDH. Darüber hinaus wird in der Gegenwart von HdeB keine signifikante LDH Aggregation vor der Sedimentation beobachtet, was mit unseren in vitro Aggregationsmessungen konsistent ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass HdeB Chaperon-Aktivität zeigt in seinerdimere Form bei pH 4,0. Dies steht in krassem Gegensatz zu HdeA, das in seiner monomeren Form aktiven Chaperon ist. Die sehr dynamischen Natur HdeB dass es strukturelle Umlagerungen zwischen pH 4 und pH 7 wahrscheinlich ausreichend für die Aktivierung von HdeB des Chaperon - Funktion 10 unterzogen werden können. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54527/54527fig2.jpg" /> Abb . 2: Nachweis der Komplexbildung zwischen HdeB und ungefalteten LDH bei pH 4 durch analytische Ultrazentrifugation 3 uM LDH wurde in Gegenwart eines 10-molaren Überschuß HdeB in Puffer D (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) für 15 min inkubiert , bei 41 ° C entweder bei pH 7 (grüne Linie) oder pH 4 (schwarze Linie). Zum Vergleich, LDH allein (blaue Linie) oder HdeB allein (rote Linie) wurden für 15 min bei 41 ° C bei pH 4. Analytische Ultrazentrifugation Sedimentationsgeschwindigkeit wurde die Stöchiometrie von HdeB, LDH, und der gebildete Komplex zu bestimmen, zwischen HdeB inkubiert verwendet und LDH bei difdene pH-Bedingungen. Man beachte, dass ~ 40% LDH aggregiert vor der ersten Abtastung, wenn sie bei pH 4 und bei Abwesenheit von HdeB inkubiert (wie in der oberen rechten Ecke angegeben). Dargestellt ist eine Sedimentationskoeffizientenverteilung Verteilungskurve (c (n)) analysiert das Programm SEDFIT verwenden. Letters zeigen den jeweiligen oligomeren Zustand von LDH oder HdeB jeweils: HdeB D, HdeB Dimer; LDH M, LDH - Monomer, LDH T, LDH Tetramer; HdeB-LDH C, HdeB-LDH - Komplex. Abbildung von Dahl et al modifiziert. 10. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um ein</a> , <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig2large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern ver</a>sion von dieser Figur. Um zu testen, ob HdeB die Rückfaltung von Client-Proteine ​​nach der Neutralisierung unterstützt wurde HdeB Einfluss auf die Rückfaltung von pH-denaturierten MDH analysiert. Thermisch denaturiert MDH wurde bei verschiedenen pH-Werten in Gegenwart oder Abwesenheit von HdeB inkubiert. Nach dem niedrigen pH der Inkubation wurde der pH-Wert neutralisiert (die initiiert MDH Neufaltung) und MDH-Aktivität wurde nach 2 h bestimmt. Wie in 3 gezeigt, signifikante Reaktivierung von MDH wurde nach der Neutralisierung von pH 4 in Gegenwart von HdeB erreicht. Keine MDH-Aktivität wurde bestimmt, wenn HdeB abwesend aus dem niedrigen pH-Inkubation war. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54527/54527fig3.jpg" /> Abbildung 3: HdeB erleichtert die Rückfaltung von Säure MDH zu einem enzymatisch aktiven Zustand denaturiert 1 uM MDH wurde in Puffer D bei dem angegebenen pH inkubiert für 1 Stunde bei 37 ° C in Abwesenheit oder p.räsenz von 25 uM HdeB. Dann wurde die Temperatur für 10 min auf 20 ° C verschoben , bevor die Proben auf pH 7 durch Zugabe von 0,5 M Na 2 HPO 4 neutralisiert wurden. Aliquots wurden bei 20 ° C nach 2 h Inkubation entnommen und auf MDH-Aktivität getestet. MDH-Aktivität bei Neutralisation in Abwesenheit (weiße Balken) oder Gegenwart von HdeB (schwarze Balken) gezeigt. Standardabweichung von mindestens 3 unabhängigen Messungen abgeleitet gezeigt. Abbildung von Dahl et al modifiziert. 10. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen</a>Zahl. Unsere In - vitro - Daten zeigten , dass HdeB verschiedene Modell - Client - Proteine bei pH bindet 4, verhindert deren Aggregation und erleichtert die Client einmal neutralen pH - Bedingungen Neufaltung wiederhergestellt werden. Um zu untersuchen , wurden die Wirkungen von HdeB in vivo, pH-abhängigen Überlebens - Assays durchgeführt , die temperaturempfindliche rpoH Deletionsstamm verwenden. Dieser Stamm fehlt den meisten Chaperone und daher anfälliger gegenüber erhöhter Temperatur, niedriger pH - Wert oder oxidativer Stress 15. Die Überexpression von HdeB unter neutralen pH - Bedingungen zeigte keine Wirkung auf die Wachstumsrate des Stammes, die vergleichsweise gut mit dem Kontrollstamm wuchs, die den leeren Vektor pBAD18 (Abbildung 4, unbehandelt). Im Gegensatz birgt, fanden wir deutliche Unterschiede in ihrer Fähigkeit, wieder aufnehmen Wachstum bei pH 3 oder pH 4 Behandlung mit dem HdeB überexprimierenden Stamm reproduzierbar verbesserte Erholung von niedrigem pH-Wert trea zeigttment als der Kontrollstamm. Im Gegensatz zu unseren in vitro - Daten jedoch Gegenwart HdeB hatte auch eine deutlich schützende Wirkung bei pH 3 dies aufgrund der hohen Konzentration von HdeB in der Zelle sein könnte, die die Oligomerisierung Zustand HdeB Richtung Dimere selbst bei pH - Verschiebung kann 3. Beachten Sie, dass die Zellen auf pH 2 oder pH 3 führte sehr schnell und hochtoxische Effekte, während keine signifikante Abtötung beobachtet wurde Verschiebung , wenn die Zellen , wo 4 9,10,22 bei pH inkubiert. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54527/54527fig4.jpg" /> Abbildung 4: HdeB schützt E. coli gegen sauren pH. HdeB (rote Kreise) wurde in BB7224 (Δ rpoH) in Gegenwart von 0,5% Arabinose bei 30 ° C überexprimiert. BB7224 Zellen, die leeren Vektor pBAD18 beherbergen, wurden als Kontrolle (schwarze Kreise) verwendet. Obere linke Tafel zeigt das Wachstum sowohl von stRegen bei 30 ° C, pH 7. Die Zellen wurden mit dem angegebenen pH verschoben durch Zugabe von 5 M HCl und für 1 min bei pH 2 (oberes rechtes Feld), 2,5 min bei 3 pH inkubiert (untere linke Tafel) oder 30 min bei pH 4 (rechts senken). Anschließend wurden die Kulturen durch Zugabe geeigneter Mengen von 5 M NaOH neutralisiert und das Wachstum wurde in flüssigen Medien bei 30 ° C überwacht. Abbildung von Dahl et al modifiziert. 10. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB Funktionen als Säureschutz Chaperon in Bakterien. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Diese Studie beschreibt biophysikalischen, biochemischen und molekularen Techniken , um die Chaperon - Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren pH - Bedingungen zu charakterisieren. Diese Verfahren wurden für andere Säureschutz Chaperone wie HdeA erfolgreich angewendet und kann modifiziert werden, um andere Chaperone und Belastungsbedingungen zu arbeiten.

Nachweis des pH-abhängige Aktivität von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; und<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

10.3K Aufrufe.  University of Michigan.  Diese Studie beschreibt biophysikalischen, biochemischen und molekularen Techniken , um die Chaperon - Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren pH - Bedingungen zu charakterisieren. Diese Verfahren wurden für andere Säureschutz Chaperone wie HdeA erfolgreich angewendet und kann modifiziert werden, um andere Chaperone und Belastungsbedingungen zu arbeiten. 

Serie: Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Forschung

Biochemie

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

Personalisierte Peptidarrays für die Erkennung von HLA Alloantibodies in Organtransplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

Erkennung von Phospholipase C Aktivität im Gehirn Homogenat von der Honigbiene

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...