This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

Plazmidler hazırlanması 1. <ol><li> Bir (çapa-ST olarak bu protokolde anılacaktır) çiftdikgen bağlantı etki kaynaşmış plazmid (örneğin, pET22) çapa protein içeren (OmpA), epitop etiketi (örneğin saflaştırma ve tanımlama için 6xHis, myc veya BAYRAK etiketleri gibi) hazırlayın periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve seçilen bakteri suşunun 7 göre çoğaltma uygun kökeni. <ol><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, bir ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin. </li></ol></li><li> Bir plasmid (ör pACYC184) (enzim-SC olarak protokolde adlandırılır) (PTE) bağlantı proteininin tamamlayıcı bioorthogonal bağlantı alanına birleştirilen OMV içinde paketlenmiş enzim / protein ihtiva eden hazırlama, epitop etiketi bağlantı proteini plazmid farklıdır periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve uygun origçoğaltma seçilen bakteri suşu 7 dayalı. <ol><li> Üreticinin protokolü 7 izlenerek ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin. </li></ol></li></ol> Bir OMV Ambalaj E.coli Kültür 2. Nesil <ol><li> Plazmid izolasyonu <ol><li> Enzim-SC oluşturmak ve bağlantı ST üreticinin protokolü 7&#39;deki gibi ticari bir plazmid izolasyon kiti kullanılarak ayrı bakım hücre çizgilerinden oluşturur kodlayan plazmidler saflaştınlır. 260 nm ve 280 nm &#39;de absorbans ölçülerek DNA konsantrasyonu ve saflık belirler. </li></ol></li><li> Ko-transformasyon <ol><li> Protein ifadesi kolaylaştırılmış ticari olarak temin edilebilen bir E. coli suşu seçin. Not: BL21 (DE3) hücreleri burada kullanılmıştır. T7 lizojenin prot için T7 destekleyici ve T7 RNA polimeraz dayanır çapa ST yapının ekspresyonu için gerekli olanein ifadesi. Diğer bakteri suşlarının kullanımı T7 lizojenin geninin varlığını ya pET22 7 dışında bir plazmidin kullanılması istenmektedir. </li><li> daha sonra seçilen hücreler için imalatçının protokolü izlenerek ısı şoku transformasyonu ya da elektroporasyon ya ile kompetan bakteriyel hücreler içine transforme eş molar konsantrasyonlara saflaştırılmış plazmid DNA ile seyreltilir. </li><li> , Üzerine antibiyotik içeren iki ampisilin (pET22) ve kloramfenikol (pACYC184) ile agar plakaları Luria-Bertani (LB) Levha dönüştürülmüş hücreler her ikisi de 25 ug / ml nihai konsantrasyonlarda mevcut. </li><li> Her iki plazmit ihtiva eden tek klonları izole etmek için gece boyunca 37 ° C &#39;de kültür tabağına yerleştirin. NOT: Antibiyotik seçimi hayatta koloniler gelecekteki tüm OMV hazırlıkları için kullanılacaktır. Antibiyotikler (ampisilin ve kloramfenikol) selektif basıncı korumak ve her iki plazmidlerin varlığını sağlamak için tüm sıvı kültürlere ilave edilecektir. </li></ol></li></ol> 3. OMV Üretimi <ol><li> koloni Genişleme <ol><li> 2.2.4 anlatılan seçme plakaları tek bir koloni ile yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda antibiyotik içeren bir kültür ortamı (tipik olarak Terrific Broth (TB) ve LB) (aşama 2.2.3) 5 ml inoküle. </li><li> şaşkın kültürü şişeler içine bir gecede starter kültür 100 kat seyreltme: 1 gerçekleştirin. NOT: 250-500 ml arasında medya hacmi kullanın. </li><li> kültür yeterli havalandırma elde sağlamak için 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de kültür muhafaza edin. </li></ol></li><li> Her plazma indüksiyonu <ol><li> Bakteri kültürü birincil büyüme balonun aşılamadan sonra, bir OD 0.6-0.8 arasında 600 büyüme yaklaşık 3 saat büyümeye olanak sağlar. </li><li> PTE-SC yüklü veziküllerin son verimini artırmak için, 15 dakika boyunca 7.000 xg&#39;de tüm kültür santrifüj. önceden ısıtılmış taze kültür ortamı hücre pelletini. NOT: Bu optuğratarak aşama PTE-SC indüksiyonu öncesinde kültür ortamı içinde mevcut olan herhangi bir boş OMV giderilmesine yardımcı olur. </li><li> 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre L-arabinoz% 20 stok solüsyonu olun. 2-4 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın, L-arabinoz çözeltisi. </li><li> PTE-SC üretiminin başlatılması için bir son% 0.2 konsantrasyonuna kültür şişesine, L-arabinoz solüsyonu ekleyin. NOT: Bu önceki mutant OmpA-ST indüksiyon yoluyla artan vezikülasyon teşvik PTE-SC ile periplazmik boşluk önceden yüklemek için yardımcı olur. </li><li> 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre içinde 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) çözeltisi olun. Not: IPTG kez hemen kullanılmıştır hidrate olması gerekir. IPTG alikotları 3-6 ay donmuş olarak saklanabilir ve kullanımdan önce, hemen çözülmüş olabilir. </li><li> OmpA-ST üretimini başlatmak için 0.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar ilave 3 saat inkübasyon döneminden sonra IPTG ekleyin. </li><li> cul izinçalkalayarak 37 ° C &#39;de ilave bir 8-14 saat boyunca büyümeye Ture. </li></ol></li></ol> 4. OMV Arıtma <ol><li> Bozulmamış Bakterilerin uzaklaştırılması <ol><li> sağlam bakteri pelet 4 ° C&#39;de 7,000 x g&#39;de 15 dakika süre ile bakteriyel kültür ortamı santrifüjleyin. </li><li> Hücre pelet rahatsız değil Durusu ve dikkatli olmak hücre topağı sonrası santrifüj üst kapalı, medya kaydedin. </li><li> bir ek santrifüj döngüsü tüm bozulmamış bakteri süzün ve medyayı kaydetmek için emin olmak kültür ortamından kaldırılır sağlamak için tekrarlayın 4.1.1 ve 4.1.2 adımları. </li></ol></li><li> Protein Agregaların çıkarılması <ol><li> Bundan başka kalıntı bakteri ve kötü büyük hücre malzemenin çıkarılması için 0.45 um zar filtre kullanılarak bakteriyel kültür ortamı saflaştırılması. Not: (örneğin, selüloz asetat (CA) veya poliviniliden diflorür daha yüksek geri kazanımlar ve düşük protein adsorpsiyonu için biyolojik açıdan uyumlu bir membran malzemesi kullanmaPVDF). 100 ml ve 100 ml daha fazla vakum filtre hacimleri daha az şırınga filtresi birimleri. <ol><li> şırınga filtresi için steril 10-50 ml şırınganın içine kültür ortamı çizin. şırınga Luer sonuna kadar 0.45 mikron filtre takın. pistonu basınız ve akış yoluyla yeni bir kap içinde toplamak. </li><li> Filtreyi vakum steril filtrasyon aparatına kültür ortamı aktarmak için. Pompayı vakum veya emme oluşturmak için aspiratör batmaya birimi takın. Yeni geminin filtrelenmiş orta aktarın. </li></ol></li></ol></li><li> Ultrasantrifügasyon üzerinden OMV İzolasyonu <ol><li> santrifüj karşıt tüpleri dengelemek için dikkatli olmak santrifüj tüplerine süzülmüş kültür ortamı ekleyin. </li><li> alet ve tüpler her iki eşleştirme mukabil rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjdeki 4 ° C sıcaklıkta 3 saat ~ 150.000 x g&#39;de topak kullanılmaktadır. </li><li> hemen tamamlama o da OMV pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, OMV pelet OMV tükenmiş kültür ortamı DurusuOMV kurtarma azaltarak pelet yumuşatır medyada kalmasını OMV pelet izin olarak f santrifüj. NOT: Bu pelet hafif kahverengi bakteri kültürü başlangıç ​​miktarına bağlı olarak ya da gözü tarafından görülemeyen olabilir olacaktır. santrifüj tüpünün üst doğrudan medya aspire da OMV kaldırıldı fazla medya son OMV örnek olacak daha saf pelet akılda tutmak bir seçenektir. </li><li> OMV parçacıklar tamamen medyadan tükenmiş olduğunu doğrulamak için, daha sonra dinamik ışık saçılımı (DLS) test için santrifüj süpernatant kaydedin. </li><li> Ekle, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyona izin OMV topak, pH 8.0, steril filtre edildi fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 ve 100 mM N-sikloheksil-2-aminoetansülfonik asit (CHES), tampon 0.5-1 mi. pelet kuru değil emin olun. NOT: Çözelti iyonik kuvvet, pH ve sıcaklığın aşırı düşük OMV çözünürlük neden olabilir ve Birikmesi arttırabilirNavigasyon. </li><li> Dikkatle çözünür hale olmuştur tüm pelet sağlamak için hafifçe karıştırarak, santrifüj tüpüne saflaştırılmış OMV çözümünü pipetlemeyin. </li></ol></li></ol> 5. OMV Karakterizasyonu <ol><li> OMV boyut dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu belirlemek için her enstrümanın özgü sağlanan üreticinin protokolleri takip piyasada mevcut DLS veya nanopartikül izleme yazılımı kullanın. NOT: Burada, OMV boyut dağılımı ve konsantrasyon NanoSight LM10 Nanopartikül İzleme ve NTA 2.3 Analiz yazılımı kullanılarak tespit edildi. <ol><li> yazılımını açın. </li><li> mikroskop açın ve mikroskop ve nanoparçacık izleme ünitesi üzerindeki tüm yüzeyleri temizleyin. </li><li> ~ Bir hava enjekte olmadan tüm görüntüleme penceresi kapak emin olarak 1 ml steril bir şırınga ile montaj Luer aracılığıyla parçacık izleme cihazının bakma penceresi ile doğrudan OMV numune 0.5 mi sisteme kabarcıklar ekleyin. </li><li> Yeri to mikroskop sahnede birimi, izleme ve lazeri açın nanoparçacık. </li><li> Yazılımda &quot;yakalama&quot; tıklayın. </li><li> mikroskop odağı ayarlayın ve yazılım penceresindeki önizleme ekranı şimdiki parçacıkları görselleştirmek için sahne. </li><li> parlak parçacıklar açıkça karanlık bir arka plan görsel kadar &quot;Kamera Shutter&quot; ve &quot;Kamera Gain&quot; ayarlayın. </li><li> 60 sn yakalama süresini ayarlayın. </li><li> &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> , Giriş numune / cihaz sıcaklığı istendiğinde, örnek etiket ve bir kullanıcı belirlenen klasöre çalıştırmak her tamamlanmasından video verileri kaydetmek. </li><li> (Algılama Eşiği, Blur, Min Parça Uzunluğu Min Beklenen Partikül Boyutu) oto modunu algılamak ve tıklayın tüm analiz parametrelerini tutmak &quot;Süreç Sırası.&quot; NOT: Her bir parametre ince ayar analiz sonuçlarına bağımsız olarak ayarlanabilir nasıl kılavuzuna başvurun. </li><li> Telaffuz parçacık boyutu dağılımı ve parçacık / myazılım tarafından tespit edildiği üzere l konsantrasyonu. Not: Tipik bir OMV hidrodinamik boyutu aralığı ~ 10 x 10 8 bir parçacık / ml konsantrasyonu ile 30-200 nm arasındadır. </li></ol></li><li> OMV Protein İçeriği belirlenmesi <ol><li> OMV saflık, enzim üretimi, ve SK-ST çapraz bağlama verimliliği 7 değerlendirmek için standart SDS-PAGE ve Batı benek protokolleri kullanarak. Not: çapraz bağlama verimliliği% 100 7 olmayacaktır. </li></ol></li></ol> Enzim Ambalaj 6. Doğrulama <ol><li> PTE Aktivite Deneyi <ol><li> ya da bir küvet içinde, 25 ° C&#39;de, uygun bir tampon maddesi, örneğin 100 mM CHES tamponu (pH 8) &#39;de, tüm enzimatik testleri gerçekleştirmek veya 96/384 oyuklu bir plaka içerisinde multiplekslenmektedir. </li><li> 1 5 ul ekleyin: Ches 90 ul ve saflaştırılmış OMV 5 ul CHES tamponunda paraoksonun 1000 seyreltme (~ 36 kat kültür ortamında bulunan OMV konsantrasyonuna göre konsantre). Dikkat: Paraokson bir toksik pestisit olduğunuve üretici ve kurumsal kurallarımıza göre ele alınması gerekir. </li><li> 405 nm&#39;de düzenli aralıklarla absorbans okumaları (~ 2 saat, toplam reaksiyon süresi boyunca her 20 sn) alın (ε = 18.1 mM -1 cm-1) ve 348 nm (isosbestic nokta s = 5.4 mM -1 cm-1) en kromojenik paraokson arıza ürün, p-nitrofenolu reaksiyon ilerlemesini izlemek. Not: pH değeri 8 den P-nitrofenolu baskın protonu giderilmiş formu 405 nm&#39;de doğru izlenmesi için izin mevcuttur. Tüm diğer karmaşık ya da daha düşük pH değerli solüsyonlarda p-nitrofenolu birden formları, mevcut olacak şekilde 348 nm isosbestic noktasını kullanmak gerekmektedir. </li><li> Her bir örnek, paket verimliliği, toplam PTE üretiminde PTE nispi miktarı karşılaştırma aşamasında 6.1.3 İlerleme eğrileri doğrusal kısmının eğimi belirleyerek başlangıç ​​reaksiyon hızları hesaplanır. </li><li> Standart enzimatik gerçekleştirinTahlil protokolleri K M, V max belirlemek ve OMV k kedi PTE kapsüllü. NOT: Lineweaver-Burk analizi bu kinetik parametrelerin belirlenmesi için kullanılabilir nerede y kesişim = 1 / V maks ve eğim = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembran Yüzey / Ürün Difüzyon. <ol><li> hacimce Aşama 0-3 ile% CHES tamponu, Triton X-100&#39;ün artan konsantrasyonları kullanılarak 6.1 de tarif edildiği gibi aynı kinetik deney analizi yapın. Not: çözündürülmüş OMV fonksiyonlarına Triton X-100 eklenmesi OMV içeriği, reaksiyon çözeltisine serbestçe erişilebilir olduğu için izin lipid çift bozabilir. </li><li> Hesaplamak ve aktivitesi enzim göre enzim aktivitesinde çok az bir değişiklik (başlangıç ​​hızı) ile gösterilen alt-tabaka / ürün transmembran geçişini kontrol etmek için her bir Triton X-100 seviyesinde İlk hızlar, karşılaştırmaN Triton X-100 bulunmaması. enzim aktivitesinde bir artış, Triton X-100&#39;ün varlığında görülürse alt-tabaka serbest OMV nüfuz etmez olasıdır. </li><li> enzim aktivitesi doğrulamak için Triton X-100&#39;ün varlığında deneyi serbest enzim aktivitesi (Bölüm 6.1&#39;de yukarıda anlatıldığı gibi) yüzey aktif maddeler ile inhibe değildir. NOT: aktivitesi büyük ölçüde Triton X-100 gibi saponinler veya çeşitli polisorbat gibi alternatif katkı etkilenirse / ara yüzey aktif OMV membran rüptürü için daha uygun olabilir. </li></ol></li></ol> 7. OMV Depolama <ol><li> Dondurucu <ol><li> doğrudan sıvı azot içine saflaştırılmış OMV Yeri ~ 100 ul alikotları ek emin tam şişeleri batığın veya numune kendisi ile herhangi bir sıvı azot temas olmaması alikotları dondurma. NOT: Arıtılmış OMV tampon doğrudan donduruldu olabilir purificat sırasında OMV pelet çözülmesi için seçildi7 Gerekirse ek dondurarak saklama koruyucuları ile iyon süreci. </li><li> -80 ° C&#39;de ek dondurulmuş alikotları saklayın. </li><li> RT emin örnekleri ısıtmak için değil varlık onları yerleştirerek adım 7.1.1 dondurulmuş alikotları çözülme. </li><li> Bu şekilde depolama için tüm örnekler hazırlamak önce aşamasından önce başlangıç ​​hızları karşılaştırarak 6.1 ve enzim aktivitesi sonrası dondurularak çözülme önemli bir kayıp olmadığını doğrulamak için dondurulduktan sonra tarif edilen enzim tahlili gerçekleştirmek. Not: enzim aktivitesinde bir azalma dondurma nedeniyle gözlenmesi halinde saklayın 4 ° C&#39;de OMV arıtıldı. </li></ol></li><li> liyofilizasyon <ol><li> Piyasada mevcut liyofilizasyon donanımları 21 kullanılarak anında dondurulmuş saflaştırılmış OMV alikotları liyofilize. </li><li> Mağaza hafta veya aylarca, -80 ° C&#39;de, oda sıcaklığında alikotları liyofilize edildi. </li><li> Liyofılizasyon öncesinde şekilde liyofilize OMV saf suyun aynı hacimde ekleyin ve t rehidrate, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilmiştirO örnek. Gerekli emin olunca girdap ya da OMV ses dalgalarına maruz değil hafifçe karıştırın. </li><li> önce seyreltme / çözündürme gerekli olmadığı yerlerde işaret-bakım uygulamaları için doğrudan liyofilize OMV tozu ekleyin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacterial+membrane+vesicles.">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li><li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li><li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li><li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria.">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li><li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li><li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles.">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li><li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles.">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li><li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein,+through+engineering+a+bacterial+adhesion.">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li><li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag.">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li><li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta.">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li><li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases.">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li><li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organo-phosphate+poisoning.">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li><li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX:+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis.">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li><li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-negative+bacteria:+the+cell+membranes.">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli.">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li><li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soluble,+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel.">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li><li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives.">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li><li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation.">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+(LEP).">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li><li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques.">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li><li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast,+efficient,+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo.">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Temsilcisi göstermek için bu protokol işlevleri, ilgili bir enzim üretimi ve E. coli OMV içine paketlenmiş olan bir paketleme tekniği yöneliktir. birçok karmaşık tekniklerle de protokol aşağıda ayrıntılı olarak bazıları, farklı özel uygulamalarda, kullanım için uyum için değiştirilebilir olan birden çok alan vardır. OMV paketleme ve enzim kapsülleme mekanizması özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir olsa da başarısı için kritik olan bu protokol kapsamında birkaç adım vardır. sağlam bir bakteri ve hücresel enkaz ilk çıkarılması büyük önem taşımaktadır ve kantitatif veya numune analizinde tüm alt girişimleri etkileyecektir. filtrasyon ve ardından iki ardışık santrifüj adımları bu kirleri çıkarmak için genellikle yeterli olmaktadır. boşaltılarak çözeltiler Santrifüj işleminden sonra kirletici aktarımını en aza indirmek için, ancak, tüm örnekler bakım alınmalıdır. Benzer şekilde, son OMV pelet obtained Aşağıdaki ultrasantrifügasyon genellikle sadece gevşek bir santrifüj tüpünün tabanına yapıştırılır. Pelet kabın altındaki bozulmamış kalmasını sağlamak için harcanan kültür ortamı çıkarılırken son aşamalarında, dikkat edilmelidir. Bazı durumda bu protokolün son adımda kayıp değildi OMV pelet sağlamak için DLS veya nanopartikül izleme cihazı kullanarak örnek analizi sonrasına kadar nihai kültür ortamı korumak için iyi olabilir. Aşağıda araştırmacıların özel ihtiyaçlarına göre uyarlanmış bu özel protokol ve diğerleri hem ortaya çıkabilecek bazı ek endişeleri vardır. Bu sistemde PTE kullanımı PTE alternatif bir enzim veya söz konusu proteinin ile kolayca değiştirilebilir olması ile organofosfat kontamine bölgelerin çevresel iyileştirme için mükemmel bir model enzimi kapsülleme sağlar. burada açıklandığı gibi OmpA-ST ile PTE-SC Koekspresyon genel PTE expressi büyük bir artışa neden olduhem de daha fazla PTE yüksek vezikül üretim seviyeleri PTE ve tek başına ifade PTE-SC göre veziküller içinde paketlenir. OmpA hiper vezikülasyon C-terminal silme yoluyla, dış membran ve peptidoglikan arasındaki etkileşimlerin sayısının azaltılması ile elde edilir. Bu bakteriler genellikle yerli olmayan proteinlerin aşın gözlenen toksik etkileri azaltır rekombinant PTE ihracat için kolay bir yol sağlar. PTE kolayca bu model sistemde değiştirilebilir iken tüm enzim substratları özgürce OMV bilayeri geçeceği dikkat etmek önemlidir ve her benzersiz enzim ve substrat çifti vaka bazında bir durumda test edilmesi bu nedenle zorunludur. zarından Bu teknik geçmez bir alt tabaka de üretim ve OMV olarak bir enzim ve Triton X-100 ilave ya da uygun başka bir yüzey aktif madde paketlemek için kullanılabilir olsa bile, yeterli le eklenebilirVELS kullanmadan önce kesecikler rüptüre. rekombinant protein ekspresyonu ve paketleme yokluğunda bu protokol, aynı zamanda, çeşitli bakteri türleri OMV üretimi ve saflaştırılması için temel bir yöntem olarak hizmet edebilir. Bu yoğunluk gradyan fraksiyonasyon 22 membran filtrasyonu 23 ve ultra-süzme 24 olarak OMV saflaştırma için alternatif yöntemler de vardır ve amaçlanan uygulamaya bağlı olarak daha uygun teknikler olabilir. Bu alternatif saflaştırma teknikleri de hali hazırda bir çiftdikgen sentetik bağlantı aracılığıyla bir OMV bir proteinin yönelik ambalaj OMV ultrasantrifügasyon taneleme yerine bu protokolde desteklenebilir. Diğer değişiklikler bu protokol yanı sıra seçilen membran bağlama proteini kullanılan özel sentetik bağlantı sistemi yapılabilir. Eşleştirme, iki farklı protein için çeşitli sentetik stratejiler vardıriçeren bir biyolojik sistem içinde s: Bölünmüş proteinleri 25, sarmal bobinler 26, ve split inteins 27, sadece birkaç listelemek için. Böyle OMPF ve OMPC gibi diğer membrana bağlı veya transmembran proteinleri olasılıkla uygun ST modifikasyon siteleri de 28 için sağlayacaktır. Bazı durumlarda, aynı zamanda yeniden birleştirici enzim / protein ST ve ankraj protein SC yerleştirilmesi SC etki alanları ve daha küçük ST değiş tokuş etmek için gerekli olabilir. aynı ya da farklı indüksiyon sistemlerinde birden plasmidlerin kullanımı dahil olmak üzere, burada uygulanabilir, farklı klonlama stratejileri da vardır, birden fazla protein tek bir plazmid kodlanmış ya da ifade homolog rekombinasyon, bütün dahil teknikleri veya parçaları kullanılarak bakteriyel genoma sistemi. OMV mikroçevresinin yaygın İdeal st daha az altında oluşur enzimatik inaktivasyonu azaltarak paketlenmiş enzim stabilize etmek için yardımcı olurOraj koşullar, donma-çözülme ve liyofilizasyon 29. Ayrıca, OMV iki tabakalı aktif enzim ve ekstra OMV alanı içinde mevcut protein arasındaki fiziksel bir engel olarak işlev gibi OMV proteolitik bölünmeye büyük ölçüde geliştirilmiş direnç sağlayacağı tahmin edilmektedir. Bu protokol ayrıca OMV kapsüllü proteinler ve afinite saflaştırma hedeflenen teslim kolaylaştırmak için bir dış bakan küçük molekül, peptid veya protein etiketi içerecek şekilde genişletilebilir. PTE Bu bir uygulama için seçilen birlikte bu protokolün, bu çalışmanın sonuçları, içeriği kolaylıkla çeşitli farmasötik teslimat kullanım için benzer bir proteini ambalaj stratejiler tasarlamak için kullanılabilir, Kullanılan Tıbbi Tanı ve çevresel iyileştirme uygulamaları 30.

Enzim yüklü bakteriyel dış membran veziküllerinin (OMV) tasarımı, üretim ve saflaştırma için bir yöntem olup burada sunulmuştur. OMV, 30-200 nm 1,2 büyüklükleri değişen proteoliposomes öncelikle tek katmanlı, küçük. Bugüne kadar incelenen tüm gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriler, yüzey 3,4 OMV veya hücre dışı vesiküller (EV), ya serbest göstermiştir. OMV üretildiği kesin mekanizma henüz tam olarak nedeni onları yanı sıra hizmet ettikleri farklı işlevleri salgılayan çeşitli bakteri nüfusa açıklanacaktır zorunda. OMV kompleksi arası iletimde, gen translokasyon çeşitli hizmet genetik malzemenin küçük moleküller, peptitler ve proteinler yükün geniş taşıma gösterilmiştir ve hastalık oluşturma 5,6 çalışır. OMV biogenez kesin mekanizmaları iyi karakterize ve bakteriyel türler arasında farklılık göstermedi değildir. thi rağmens aslında, ilgi bir protein ve bakteriyel dış zar için son derece fazla protein endojen ve daha sonra OMV ile sentetik bir bağ oluşturarak OMV bir rekombinant proteinin ambalaj etkinliğinin arttırılması için bir yöntem geliştirdik. Sentetik bağlantı ya da yapay olarak dahil afinitesi yokluğunda, rekombinant şekilde sentezlenmiş protein ile OMV arasında gözlenen paketleme verimliliği 7 çok düşüktür. Bu sonuç, iyi anlaşılmış değildir mekanizmalar yoluyla bakteriyel yüzeye ya da yönlendirilmiş paketleme ile OMV formasyonunun kesin bir anda rastgele olasılık kapsülleme yoluyla gerçekleşir OMV içindeki proteinler dahil edilmesi gibi beklenebilir. inci kıyasla yüksek verimde ambalaj bazı proteinleri ile bağlı protein yüksek bir başarı rastgele olasılık kapsülleme ama etkili paket dayanır periplazmik boşluk içinde ekspresyonu üzerinde, sadece yoluyla proteinlerin paketleme gözlenmiştir olduğutüm 8-10&#39;da paket yok. Ortak sentetik biyoloji tekniklerini kullanarak biz Escherichia coli (E.coli) aynı anda üretmek, paket ve kargo için bakteriler tarafından seçilir nasıl OMV oluşturulur ve nasıl ilgili güncel bilgi sınırlamaları ortadan OMV içine ilgi aktif bir enzim salgılaması için mühendis çalıştı ambalaj. tercih edilen, sentetik bağlantı OMV içine yönsel ve paketlemeyi kolaylaştırmak için, bu başvurunun amaçları için, bir bölme proteini bioconjugation sistemi seçildi. Adından da anlaşılacağı gibi bölünmüş bir protein bioconjugation sistemi birbirleriyle etkileşim iki tamamlayıcı alt birim etki oluşur. Bu protokolün amacıyla seçilen bölünmüş protein domainleri Streptococcus pyogenes fibronektin bağlama proteini (FbaB) 11 elde edilir SpyCatcher (SC) SpyTag (ST) etki gibi ifade edilir. Bu bölme, protein sisteminin bu w sıradışıTavuk, iki alt birimi yakınlık içinde isopeptide bağ spontan bir kovalent bağ oluşturma asit ve lizin amino asit kalıntıları, aspartik proksimal arasında oluşturur. Isopeptide bağı oluşumu şaperon protein, katalitik enzimlerin veya kofaktörlerin eklenmesini gerektirmez ve kolayca, oda sıcaklığında (RT) ve fizyolojik olarak ilgili koşullar, 12, geniş bir aralıkta meydana gelebilir. Kavramının bir kanıtı olarak, Brevundimonas diminuta gelen phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) OMV 13 türetilmiş E. coli &#39;içine paketlenmiş seçildi. PTE binükleer Zn / Zn etkin bir yeri içerir ve Dialkilfosfatlar ve aril alkolleri 14&#39;e aryldialkylphosphates dönüştürme bir hidroliz reaksiyonu ile organofosfatlar ayrıştırma kabiliyeti yer alır. Organofosfatlar maruz kalma nöromüsküler kavşak makin de asetilkolinesteraz tarafından asetilkolin hidrolizini inhibe yoluyla uygun nörotransmitter fonksiyonu bozar15 derece tehlikeli g organofosfat türetilmiş bileşikler. Uzun süreli veya Organofosfatlar önemli maruziyet sık kontrol edilemeyen kasılmalar oluşur ve genellikle boğulma yoluyla ölüme neden olur. PTE paraokson doğru yüksek bir katalitik aktivite sergiler ise, çok güçlü bir insektisit, aynı zamanda diğer ilaç ve V / G tip kimyasal sinir ajanları 16 geniş bir hidrolize yeteneğine sahiptir. OMV ve paketlemeyi kolaylaştırmak için bir bakteriyel plazmid indüklenebilir bir promotör, bir periplazmik lokalizasyon sekansını ve SK gen dizisinin üst akışında bir kısa çoklu klonlama yerini içeren bir gen yapısı kodlayan tasarlanmıştır. OMV ambalaj periplazmik bölgeye PTE-SC füzyon proteinini hedefleyen genetik anahtarın oluşturulması için izin lideri ve SC sekansı arasındaki PTE geninin yerleştirilmesi. Burada tarif edilen çalışmalar PTE odaklanırken, enzim gen değiştirilebilir ve hali hazırda Fakültesi için diğer bir gen sekansı ile değiştirilebilirAlternatif bir enzim veya protein ilitate ambalaj. Sentetik bağlantı ikinci bir parçası olarak bir çok dış zar proteini (OmpA) Abone terminali peptid dizisi sunmak tercih edilir. değişebilir bağlantı proteininin tercih protein, periplazmik boşluk içinde sunulur permisif alan adına sahip sitotoksisite neden olmadan bir füzyon yapısı tolere esastır iken rekombinant olduğunda, OMV mevcut olduğu bilinmektedir, ve toplam etmez üretilmiş. OmpA yüksek bakteriyel dış zar ve daha sonra OMV 17&#39;de ifade edildiği bilinen bir 37.2 kDa transmembran Porin proteinidir. Küçük moleküllerin taşınması karıştığı, bakteri membranı 18 arasında, boyutu 2 nm &lt;. Ana OmpA iki yapısal benzersiz etki, bir transmembran p varil motif ve peptidoglikan 19 ile etkileşim için bilinen periplasmically çözünebilir bir C-terminal bölümüne sahiptir. Mutant OmpA-ST füzyon designe olarakBuradaki D ompA C-terminal kısmı silinmiştir ve ST periplasmically bakan N- ya da C-ucu ile kaynaştırılır. OMPA periplazmik bölümünü silme dış membran ve hiper-vezikülasyon 7 giden membran istikrarsızlaştırma sonuçlanan peptidoglikan arasındaki etkileşimlerin sayısını azaltır. Genomik OmpA Brüt membran destabilizasyonuna azaltmak için, rekombinant şekilde eksprese OmpA-ST yapısına ek olarak muhafaza edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">IPTG</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Can be prepared ahead of time and stored at 4C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">TB/LB Culture Media</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other growth medias will likely work similarly.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">One of many potential suitable surfactants.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Baffled culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">The baffles promote higher levels of aeration.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">CHES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:96px;">BP318-100</td>
			<td style="width:273px;">Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &#62; 8).</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Paraoxon</td>
			<td style="width:93px;">Chem Service</td>
			<td style="width:96px;">N-12816</td>
			<td style="width:273px;">Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Syringe Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">60183-221&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (30 mm)</td>
			<td style="width:273px;">Filter diameter will depend on volume of sample.&#160; Low protein binding membrane is critical.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:93px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:96px;">Excella E24</td>
			<td style="width:273px;">Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Culture Centrifuge</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">RC 5B PLUS</td>
			<td style="width:273px;">Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">WX Ultra 90</td>
			<td style="width:273px;">Capable of centrifugal forces &#8805;150,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">AH-629</td>
			<td style="width:273px;">Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (25 x 89 mm)</td>
			<td style="width:93px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:96px;">344058</td>
			<td style="width:273px;">Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Tecan</td>
			<td style="width:96px;">Infinite M1000</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for enzyme kinetic assays.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">DLS / particle tracking</td>
			<td style="width:93px;">NanoSight&#160;</td>
			<td style="width:96px;">LM10</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Suitable bacterial expression strain.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pET22</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:96px;">69744-3</td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pACYC184</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td style="width:96px;">28704</td>
			<td style="width:273px;">Example kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

dış membran veziküller (OMV) programlamak için sentetik biyoloji teknikleri uygulayarak giderek artan ilgi, geleneksel nanopartiküller sentezlemek için çok zor kanıtlamaktadır OMV&#39;ye için bazı çok ilginç ve benzersiz uygulamalara yol açmaktadır. Bugüne kadar, bütün Gram negatif bakterilerin küçük moleküller, peptitler, proteinler ve genetik malzemesi içeren kargo çeşitli OMV Gösteren ambalaj üretmek için gösterilmiştir. onların çeşitli yük göre OMV hücre-hücre iletişim gen transferi ve bakteri OMV üretiminde hangi bağlı olarak hastalık oluşturma faktörlerinin teslimat kadar birçok biyolojik süreçlere de karışırlar. Sadece son zamanlarda bakteriyel OMV kontrol etmek ve OMV içine rekombinant proteinlerin doğrudan ambalaj tekniklerinin geliştirilmesi yoluyla geniş bir uygulama yelpazesinde kullanım için erişilebilir hale gelmiştir. overa geliştirilmiş Bu protokol, üretimi, saflaştırılması için bir yöntem, ve enzim paketlenmiş OMV kullanımını temin tarifrekombinant enzim, artan vezikülasyon ve gelişmiş enzim stabilitesi ll üretimi. Bu protokolün başarılı kullanımı aynı zamanda, bir rekombinant protein üretimi ve yeniden birleştirici protein ve bir dış membran ankraj protein arasında sentetik bağlantı oluşturma yoluyla OMV kapsüllenmesi için yönlendiren bir bakteri suşunun oluşturulmasıyla sonuçlanır. ilaç ilaç dağıtım, tıbbi teşhis ve çevresel iyileştirme: Bu protokol ayrıca gibi diğer benzersiz uygulamalar için kullanılmak üzere bu protokolü adapte göz önünde bulundurulması gereken bakteri kültürlerinin yanı sıra uygun işleme teknikleri ve şeyler OMV izole etmek için yöntemler göstermektedir.

Bu protokol ayrıntılı OMV ambalaj stratejisi için gerekli olduğu gibi, iki yeniden birleştirici proteinin aynı anda sentezlenmesi, farklı yollar bir numara ile gerçekleştirilebilir. Burada, bir iki vektör sistemi çoğaltma ve ayrı olarak uyarılabilir gen kasetlerinin uyumlu kökeni ile kullanılmıştır. PTE-SC sentezlenmesi için bir arabinoz, indüklenebilir gen kaseti ve bir enzim geninin klonlanmasını kolaylaştırmak için benzersiz sınırlama sitelerinin bir dizi ardından periplazmik lokalizasyon lider dizisine arginin bir çift içermek üzere tasarlanmış olan bir ticari bir plazmid omurgasını (pACY184) oluşturmak bir C-terminal SC proteinine füzyon. Dış zar bağlantı proteinini kodlayan plazmid yapısı, protein ekspresyonunun kontrol ve pelB periplazmik lokalizasyon dizisi için lac operon kullanan ticari vektör pET22 olup. Kısa ST dizisi INSE önce kesik OmpA protein klonlanmıştırifade plazması içine rtion. her iki plazmid olarak, C-terminal hekzahistidin sekansı OMV örneklerinde füzyon proteinlerinin aynı anda tespiti için izin vermek için muhafaza edilmiştir. OmpA N- ve C-terminali ST füzyon konstruktları, her iki dahil olmak üzere, bu gen yapılarının inşası ve karakterizasyonu, tam Alves diğ tarif edilmiştir. 7. Burada tarif edilen gen yapıları, enzimlerin paket için elverişli olmayabilir. Bazı durumlarda, periplazmik lokalizasyon sinyali, düzenleyici elemanlar, ya da epitop etiketleri değiştirmek için gerekli olabilir. Ayrıca, bazı proteinler engelleyici büyük ve tamamen iç zarı enine mümkün olabilir. Enzim aktivitesi ve OMV paketleme verimliliği priori tespit edilemez ve ampirik her hedef protein için tespit edilmesi gerekir. Aşağıda başarıyla taşıyan o ardına genellikle beklediğiniz sonuçlarıBu protokolü ut. Bir OMV içinde iki ST / SC bölünmüş protein alanları şematik, OmpA-ST ve PTE-SC füzyon yapıları olarak bakteriyel dış membran isopeptide oluşumu Örnek ve PTE-SC daha sonra kapsülleme dahildir (Şekil 1) . Ayrıca temsili SEM aracılığıyla saflaştırılmış OMV morfoloji sonuçları yanı sıra boyut dağılımı ve mutlak OMV konsantrasyon parçacık izleme yazılımı ile belirlenen (Şekil 2) dahildir. OMV protein içeriği ve rekombinant protein ekspresyonu ileri karakterizasyonu SDS-PAGE ve Western Blot (Şekil 3) ile görülür. aşağıdaki gibi burada sağlanan protokole özgü ilgi proteinlerin için molekül ağırlıkları şunlardır: Yerli OMPA (37.2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Saflaştırılmış OMV yüksek miktardaki nativ OmpA göstergesidir koyu bant yaklaşık 37 kDa olmalıdır. Jel çözünürlüğüne bağlı olarak birden fazla ba olabilirOmpA, OMPF ve OMPC olarak jel bu bölgedeki nds mevcut tüm nispeten bol ve benzer moleküler ağırlığı paylaşın. OmpA-ST nedeniyle de, E. coli sentezleme makineleri ezici sonucu lider sekansın uygun olmayan bölünmeye gözlenebilir 2,2 kDa daha büyük olan bir ilave bant. Başarıyla saflaştırılmış OMV örnek diğer birçok yüksek ifade proteinleri olmayacağını dikkat etmek önemlidir. Diğer gruplar varsa da saflaştırma hatalı gerçekleştirildiği veya bakterilerin, E. coli BL21 (DE3) soyu gözlenmemiştir diğer proteinleri ambalaj olabilir kullanılmaktadır süzün. Ayrıca, etkinlik analizleri ve vezikül kopma deneyleri enzimatik substrat serbestçe transmembran porin proteinleri (Şekil 4) ile OMV girebilirsiniz eğer beklenen temsilcisi sonuçları göstermek için sağlanmıştır. Paraokson, nispeten serbest bir şekilde girerEndojen transmembran Porin proteinleri ile OMV OMV zardan görece serbestçe geçer, paketlenmiş PTE ve reaksiyon ürününün, s-nitrofenolu tepkimeye bırakılır. Bu olgu, tüm ürün, alt-tabaka ve enzim kümeleri arasındaki yerde olmayacak ve deneysel olarak tespit edilmelidir. Başarılı bir OMV yırtılma ve enzim salma deterjan ve PTE (burada Triton X-100), düşük konsantrasyonları ile görülmüş olsa da, bu tür ilave için diğer enzimlerin aktivitesini etkileyebilir. Plazmid haritalar da SC / ST sistemini (Şekil 5) kullanan iki plazmid ambalaj stratejisi tasarımı göstermek için dahil edilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54458/54458fig1.jpg" /> Şekil 1: OMV içine proteinlerin Yönetmen ambalaj. tarif OMV ambalaj strat kullanılan proteinler için kristal yapılarıEGY: OmpA, PTE, SpyTag (SS) ve SpyCatcher (SC); PDB: 2GE4, 1PTA sırasıyla 4MLI, 4MLI. bakterilerin dış zar bir isopeptide bağı oluşturmak OmpA-ST ve PTE-SC kaynaşma şematik bir temsili gösterilmektedir. Bu membran füzyon oluşturan OMV olan PTE dahil edilmesini tahrik eder. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54458/54458fig2.jpg" /> Şekil 2: OMV karakterizasyonu. Ultra santrifüj işlemi (A) SEM yerel E. coli OMV saflaştırılmıştır [BL21 (DE3)]. (B) Temsilcisi parçacık trac<html> kral dağılımları ve (C) toplam vezikül konsantrasyonu örnek Yerli OMV, arabinoz aktivasyonu (PTE-Hayır A) arabinoz aktivasyon varlığında, PTE-SC yokluğunda PTE-SC için okur 90 sn boyunca ortalama (PTE-A) N-terminal OmpA-ST birlikte dönüştürülmüş arabinoz ve IPTG aktivasyonu (PTE / OMV-H) varlığında, PTE-SC ve ultra santrifüj süpernatan (UC süpernatant) mevcuttur. OMV üretimde önemli bir artış Yerli OMV ve PTE-SC yalnız yapıları ile karşılaştırıldığında PTE / OMV-N numunesinde gözlendi. OMV süpernatant sonrası Ultrasantrifügasyon hiçbir OMV küçük bırakarak UC pelet OMV neredeyse tam iyileşme göstermek için UC süpernatant ölçüldü. Tüm veriler, üçlü deney (± SD) bir mekanizma sağlamaktadır. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society.d / 54458 / 54458fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54458/54458fig3.jpg" /> Şekil 3: Saf OMV protein içeriği belirlenmesi. PTE-SC ile birlikte eksprese C-terminal OmpA-ST füzyon saflaştırılmış OMV UC pelet (A) SDS-PAGE (PTE / OMV) OmpA-ST, Yerli OMPA, PTE-SC ve OmpA- temsilcisi bolluğu gösteren inşa ST / PTE-SC isopeptide füzyon. (B) OMPA ve PTE mevcut dahil onun-etiketi kullanan Western Blot analizi bir anti-6xHis antikor aracılığıyla görselleştirme kolaylaştırmak için oluşturur. Daha büyük bir moleküler ağırlığa his-etiketli türlerin varlığı ile lekesi üzerinde kanıtlandığı gibi PTE, dimerize bilinmektedir dikkat etmek önemlidir. Çok yüksek OmpA-ST ifade seviyeleri gözlenen olsa serbest tam bir dönüşüm yokturzara PTE-SC OmpA-ST / PTE-SC bağlı. Buna karşın, genel olarak PTE üretimi ve gelişmiş paketleme verim artışı kovalent bağ oluşumu her yerde olmasa da ST ve SK etki kovalent olmayan ilişki OMV içinde yönlendirilmiş ambalajın önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54458/54458fig4.jpg" /> Şekil 4: PTE aktivitesi ve paketleme karakterizasyonu. (A) Genel PTE ekspresyon seviyeleri ve OMV paketleme verimliliği bıraktı kullanan ilk hız ölçümleri ile tespitOxon hücre topakları, UC süpernatan içinde PTE mevcut karşılaştıran bir kromojenik substrat ve saflaştırılmış UC OMV peletler olarak anlaşılacaktır. (B) OMV iç alt-tabaka engelsiz erişim sağlayan OMV iki tabakalı bozmaya Triton X-100 (% 0.5 T100) kullanımını gösteren Örnek verileri. enzimatik İlk hızlar, aynı kalırsa T100 yokluğunda gerçekleştirilebilir deneyleri için bu verileri karşılaştırmak sağlam OMV ikili tabakalar arasında alt-tabaka translokasyonu doğrulama kolaylaştırır. paraokson halinde varlığında veya paraokson OMV ile endojen gözenekler boyunca serbestçe geçer gösteren T100 yokluğunda gözlemlenen çok az aktivite fark yoktu. (C) PTE / OMV-N ve PTE-A için standart Michaelis-Menten enzim kinetiği denklemi PTE-SC kinetik veri uyum. (D) K M ve k cat / K M (48 belirlemek için kullanılan bir Lineweaver-Burk analizi, 4.4 x 10 7, 44 uM, 4.9 x10 7 saniye -1 sırasıyla M -1) doğal enzim gibi benzer PTE edebiyat kinetik parametreleri gösteren (90 uM, 2.7 x 10 7 saniye -1 M -1) tüm durumlarda R 2 ≥ 0,999 ile. Tüm veriler, üçlü deney (± SD) bir mekanizma sağlamaktadır. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54458/54458fig5.jpg" /> Şekil 5: Burada anlatılan örnek sistem için Temsilcisi plazmid yapıları. SpyCatcher modifiye enzim-SC (PTE-SC) plazmid OMV (solda) içinde kapsülleme için hedeflenen. SpyTag modified membran çapa-ST (OmpA-ST-N) plazmid (sağda). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54458/54458fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification at JoVE.com

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K Görüntüleme.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

Video: Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biyokimya

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Dış ve İç Perivitellin Sublayerlerinin Tavuk Yumurtalarından Mekanik Ayrıştırılması ve Protein Solubilizasyonu

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...