Biz hızlı protokol kurma ve gerekli plazmitleri sağlayarak onların yararlı tavsiyeler Prof. Jeff Gerst ve Boris Slobodin teşekkür ederiz. Biz de LC-MS / MS analizi ile ona yardım için Smoler Proteomiks Merkezi&#39;nden bu protokolü Dr. Tamar Ziv kurulması ona yardım için Dr. Avigail Atir-Lande teşekkür ederim. Biz YEF3 antikor Prof. TG Kinzy (Rutgers) teşekkür ederim. Bu çalışma Binational Bilim Vakfı hibe 2011013 tarafından desteklenmiştir.

Not: 12 MS2 bağlayıcı siteleri kapsayan bir dizi takın (MS2 döngüler; MS2L) istenen genomik içine, genellikle, açık okuma çerçevesinin (ORF) 3 &#39;UTR arasındadır. Bu entegrasyon için ayrıntılı bir protokol yerde 22 sağlanır. PCR, kuzey analizi veya RT-PCR 20,23 tarafından uygun ekleme ve ifade doğrulayın. Entegrasyon 3&#39;UTR&#39;sinden sentezi ile müdahale etmedi doğrulamak için önemlidir. Buna ek olarak, indüklenebilir bir promotör (metiyonin tükenmesi) ekspresyonu altında SKB kaynaşmış bir plazmid ifade MS2-CP da hücreler 24 içine alınmalıdır. kişiye MS12 halkalar hariç özdeş soyu, spesifik olmayan sinyallerin tespiti için bir kontrol olarak kullanılır. 1. Hızlı Arıtma <ol><li> Maya hücreleri, 500 ml (söz konusu genin ifade seviyesi ile ilgili olarak, maya hücreleri 250-1,000 ml kullanın) mRNA&#39;nın 20 ve MS2-etiketli eksprese büyütünUygun büyüme ortamına (örneğin, Sentetik Dekstroz (SD) seçici orta) 30 o C&#39;de 1.0 - MS2-CP-GFP-SBP füzyon proteini 24 600 0.8 OD. </li><li> Santrifüj hücreleri oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de ve süpernatant atın. </li><li> Metiyonin olmayan SD, eşit hacimde (adım 1.1) de (adım 1.2), daha önce olduğu gibi tekrar süspansiyon 1X fosfat tamponlu salin hücreleri (PBS), santrifüj yıkayın ve 45 boyunca inkübe - MS2 ekspresyonunu indüklemek için 60 dakika 30 ° C&#39;nin -CP-GFP SBP füzyon proteini. Not: Daha uzun indüksiyon süresi GFP toplanmalarına neden olabilir. </li><li> Hücrelerin bir kenara 10 ml Set ve basit &quot;sıcak fenol&quot; yöntemini 25 kullanılarak bu örnekten RNA ayıklayın. Dikkat: Fenol son derece zehirli ve emniyet talimatlarına göre ele alınmalıdır. Not: Bu RNA izole RNA (Şekil 1A) kalitesi için iyi bir referanstır. </li><li> 500 ml hücre için, bir son c 1.35 ml% 37 formaldehid ilave% 0.1 bağlı yoğunlaşma RNA-protein kompleksleri çapraz bağlanması için. 10 dakika boyunca 30 ° C de kuluçka devam edin. Dikkat: Formaldehit çok zehirlidir ve güvenlik talimatlarına göre ele alınmalıdır. </li><li> 0.125 M bir son konsantrasyona kadar 2.5 M glisin 26.5 ml ilave edilir ve çapraz bağlanmasının durdurmak için 3 dakika boyunca inkübe edin. Bu adımdan, RNA bozulmasını en aza indirmek için buz üzerinde her şeyi koymak. </li><li> 4 o C&#39;de 4 dakika süreyle 3,000 xg&#39;de Santrifüj hücreleri ve 45 ml soğuk 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Başlangıç ​​hücre kültürü 100 ml başına 1 mi Rapid liziz tamponunda yeniden süspanse hücreleri. </li><li> vidalı kapaklı mikrofuge&#39;ye tüplerde 500 ul hacme bölünmüş ve her kısım (kabaca tam 0.2 ml PCR tüp) için ~ soğutulmuş cam boncuklar 400 mg ekleyin. </li><li> Bir çemberde Hücreleri, 3 dakika boyunca çırpıcı. Hemen buz üzerinde lizat koydu. Not: Hücre parçalama serbest bırakır RNA bozulması başlıca nedenidir hücresel RNases. Rapid liziz tamponu RNaz inhi yüksek konsantrasyonda içerirBu tür spesifik olmayan RNaz inhibitörü özellikle heparin ve spesifik inhibitörleri olarak bitors. hızla çalışan ve soğuk her şeyi tutmak da tavsiye edilir. </li><li> Yeni tüplere lizat aktarın. Pierce sıcak iğne (0.8 mm x 40 mm) ile her bir mikrofüj tüpün alt küçük bir delik ve 15 ml tüpler üzerine mikrofüj tüpleri. mikrofüj tüpleri ve 15 ml tüpler arasında bir adaptör olarak 5 ml&#39;lik bir şırınga baş kullanın. 4 O ° C&#39;de 1 dakika için 3000 x g&#39;de borular düzeneği santrifüj </li><li> Hücre artıkları temizlemek için 4 o C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de yeni bir 1.5 ml tüp ve santrifüj akış oranı 15 ml tüp transfer. </li><li> Havuz tek 15 ml tüp içine tüm 1.5 ml tüpler süpernatantlar ve 1/50 kenara sırasıyla RNA ve protein izolasyonu için lizat 1/100 hacim. Not: Bu sonraki analiz (Şekil 1) için &quot;Giriş&quot; örnekleri olarak görev yapacak. </li><li> i 500 ml başına avidin 300 ug eklemenitial maya kültürü ve sürekli haddeleme (10 rpm) 4 O ° C&#39;de (bu, 10 dakika indirgenebilir), 30 dakika boyunca inkübe edin. Not: streptavidin boncuk bağlanmasını Avidin blok biotin ve biyotinile edilmiş proteinler. </li><li> hücreleriyle inkübasyon önce streptavidin boncuk ön yıkayın. <ol><li> boncuklar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne çamur streptavidin yaklaşık 300 ul aktarın ve üst süpernatant kaldırmak. Bu boncuk 250 ul neden olur. HIZLI liziz tamponu için 1 ml ile iki kez boncuk yıkayın. Her adım arasında 4 o C&#39;de 2 dakika süreyle 660 xg&#39;de streptavidin boncuk santrifüj. </li><li> 0.5 hızlı bir liziz tamponu mL içinde 10 mg, 0.5 ml / ml BSA ve 10 mg / ml maya tRNA, 10 ul 1 saat boyunca inkübe edilerek boncuk bloke eder. Boncuk O / N gerekirse rotasyon ile 4 o C&#39;de çözüm engelleme bırakılabilir. </li><li> Rapid lizis tamponu 1 ml ile iki kez yıkanır. Manyetik boncuklar da zaman ve Backgr azaltmak için kullanılabilir: Notound. Ancak bunlar, sefaroz boncuklar daha düşük kapasiteye sahiptir. </li></ol></li><li> (Adım 1.14 arasında) avidin ihtiva eden lizat önceden yıkanmış streptavidin boncuk 250 ul ilave edin ve sabit dönme (10 rpm) ile, 4 ° C &#39;de 1 saat inkübe edilir. Not: Bu inkübasyon süresi yeterli bağlanma süresi sağlayan ve RNA bozulması şansını en aza indirmek arasında bir uzlaşmadır. </li><li> 4 o C&#39;de 2 dakika süreyle 660 xg&#39;de santrifüj streptavidin boncuk temizlemek ve yeni bir 15 ml tüp süpernatant aktarmak için. sırasıyla kenara 1/50 ve RNA ve protein izolasyonu için lizat 1/100 hacim, ayarlayın. Not: Bu &quot;Sınırsız&quot; örnekleri olacaktır. </li><li> Adım 1.17 gibi hafifçe sallayın, Rapid Lizis tamponu 1 ml boncuk yıkayın yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer ve santrifüj. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> 1 Hızlı yıkama tampon maddesinin ml&#39;si, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca bu zaman döndürmek (10 rpm) ile boncuk yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin. </li&gt; <li> Yukarıdaki 1 1x PBS ilave edildi ve santrifüj ile boncuk yıkayın. </li><li> 1x PBS 120 ul tekrar boncuk yıkayın. Santrifüj yukarıdaki gibi ve &quot;Yıkama&quot; örnek olarak RNA ve protein ekstraksiyonu için tüm süpernatant alır. Not: Bu son yıkama Örnek yıkama katılığını gösterir ve elüsyon örnek olarak, aynı hacimde olmalıdır. Bu daha sonraki analizlerde işleme ve yükleme basitleştirecek. </li><li> Kolondan RNA ve RNA-ilişkili proteinler elüt 1x PBS içinde 6 mM biyotin 120 ul ilave edin ve sabit dönme (10 rpm) ile, 4 ° C&#39;de 45 dakika boyunca inkübasyona. </li><li> Santrifüj boncuklar yukarıda ve yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe elüt malzemeyi aktarırlar. Tekrar edilen örnek Spin ve boncuk Resim taşınmasını sağlamak için yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe Üst faz transfer. </li><li> RNA ya da protein çıkarımı için örnekler alın. Not: Alınan ses RNA veya protein, aşağıdaki deney ve ifade seviyesine bağlı olmalıdır. Kuzey analizi 26 için bir kılavuz olarak, Western Blot 23,27 veya RT-PCR 28 için, numunenin% 80 almak% 20 almak ve kütle spektrometresi 29 için, yeni proteinler keşfetmek tüm örnek almak için. </li></ol> 2. RNA Ekstraksiyon <ol><li> 2x Çapraz bağlama Ters tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve 65 ° C&#39;de 45 dakika inkübe edilir. RNA ekstraksiyonu için doğrudan devam edin. Not: Çapraz bağlama Ters Tampon anlamlı RNA ekstraksiyonu 20 arttırır etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva etmektedir. </li><li> Standart fenol kullanın: kloroform yöntemi 26 &quot;giriş&quot; ve &quot;ilişkisiz&quot; örneklerinde (1.13 ve 1.17 adımlar) RNA ayıklayın. Not: Bu örnekler (ör RT-PCR), bu nedenle, LiCİ çöktürme 30 çıkarmak için tavsiye edilir daha sonra reverse transcriptase (RT) kullanılarak tahlilleri önleyebilen RNaz inhibitör heparin büyük miktarda içerir. &quot;wash &quot;ve&quot; elüsyon &quot;örnekleri (1.21 ve 1.24 adımlar) RNA düşük miktarda içeren ve aşağıdaki adımlarda çöktürülür. </li><li> &quot;Yıkama&quot; ve &quot;yıkama&quot; örnekleri 8 M Guanidinyum-HCI (GuHCl) ve% 100 etanolden iki hacmin eşit hacim. En az 2 saat boyunca -80 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Guanidinium verimli proteinler denatüre ve böylece numunedeki RNases ve proteazlar engelleyecektir. </li><li> 20.000 x g&#39;de, 30 dakika süre ile 4 ° C&#39;de santrifüj ve süpernatant atılır. 20.000 x g&#39;de 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tekrar soğuk% 80 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. </li><li> RNazsız su 400 ul RNA pelet çözülür ve herhangi bir artık GuHCl ya da diğer kirletici maddeleri uzaklaştırmak için yeniden çökeltilmesi. 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve% 100 etanol içinde 800 | il 40 ul ekle, en az 1 saat boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj adım 2.4 gibi yıkayın ve bir 10 ul ucu ile tüm etanol çıkarın ve. RNA pell yeniden süspanse10 ul RNazsız su içinde ve çal. RNA pelet genellikle görünmüyorsa gibi ekstra özen gösterin. Not: 23 (Şekil 1) &#39;de tarif edildiği gibi numuneler, kuzey analizi için kullanılabilir. </li></ol> 3. Protein Western Blot veya Kütle Spektrometre Analiz Hazırlık <ol><li> Protein örnekleri 4x Laemmli numune tamponu (LSB) 1/3 hacim ekleyin ve RNA ve protein çapraz bağlantıyı ters döndürecek 65 ° C&#39;de 45 dakika inkübe edilir. Not: Örnekler, -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Bir SDS poliakrilamid jeli (SDS-PAGE) 31 çalıştırmak proteinler. Analiz edilecek protein ölçülerine uygun jel yüzdesini ayarlamak. Not:% 10 akrilamid jel ayırması geniş verir ve bir birinci yaklaşım olarak iyidir. </li><li> Izolasyon verimi (Şekil 1C) kontrolü için, standart bağışıklık benekleme analizi 27 gibi membran proteinleri aktarın. Coomassie Blue R ile ya Lekekütle spektrometresi analizden önce 250 veya gümüş leke. Not: daha duyarlı ve daha iyi algılama (Şekil 1B) sağlar çünkü Gümüş leke tercih edilen bir seçimdir. Boyama elle hazırlanmış solüsyonlar ya da ticari kitler biriyle yapılabilir. Nihai boya çözeltisi içinde jel inkübasyon süresi deneysel olarak tespit edilmelidir. Uzun inkübasyon düşük bol protein açığa çıkarabilir, ancak böyle MS2-CP-SBP-GFP olarak yüksek ifade proteinler üzerinde lekeli olması neden olabilir ve onların çevresinde çevreleyen proteinleri maskeleyebilir. Buna ek olarak, yüksek bir arka plan oluşabilir. dikkatle reaksiyonu izleyin ve uygun zamanda Dur Çözüm ekleyin. </li><li> jelden bantları kesip 1.5 ml tüpler aktarabilirsiniz. -20 ° C&#39;de saklayın örnekleri ya da LC-MS / MS analizi 32, ardından protein ekstraksiyonu ve tripsin sindirim için örneklendi. </li><li> Eğer jel ayrılması aşamasını hariç tutmak için alternatif bir yaklaşım olarak proteomik, bu adım 1.24 elüt edilen malzeme, özetLC-MS / MS analizi 33 tripsin ve konuyu kullanarak dökülmesinden. Not: SDS-PAGE ayrılması atlama protokolü kolaylaştırır ve verim artar. Bununla birlikte, örnekler, kütle spektrometri analizi önleyen deterjan NP-40, izlerini içerebilir. Bu sorunu aşmak için, aşağıdaki adımları gerçekleştirin: <ol><li> 15 dakika - 10 SDS-PAGE 31 protein çalıştırın. </li><li> (Proteinler bulunduğu, yani) sokağın tüm kısmını kesip. Not: Protein numunesi düşük bolluk protein sinyalleri gizleyebilir MS2-CP- SBP, proteinin önemli bir miktarda içerebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs,+suggesting+an+extensive+regulatory+system.">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255 (2008).</li><li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li><li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+processing+and+its+regulation:+global+insights+into+biological+networks.">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li><li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria.">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li><li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks.">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li><li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING.">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203 (2014).</li><li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system.">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li><li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo.">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li><li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p.">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li><li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions.">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li><li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Genomics:+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation.">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li><li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins.">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes.">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li><li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+factor+eEF3+(Yef3)+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner.">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).</li><li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3'-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein.">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li><li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast.">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li><li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3'-UTRs+and+their+ORFs.">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RaPID:+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes.">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs.">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li><li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRFbeta,+a+novel+regulator+of+calcium+signaling,+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain.">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li><li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells:+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes.">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li><li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site.">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li><li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria.">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(1D+SDS-PAGE).">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li><li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow.">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).</li><li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry.">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li><li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StreptoTag:+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins.">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li><li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+steps+forward--one+step+back:+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes.">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li><li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein.">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li><li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum.">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage.">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14 (2004).</li><li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR/Cas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway.">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572 (2015).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li><li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation.">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li><li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC+yeast:+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification.">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Çeşitli yöntemler ilişkili proteinleri 11,34 35 tanımlamak için belirli bir mRNA izolasyonunu kullanımı. Bu yöntemler, bir RNA-protein etkileşimlerini incelemek için in vitro ve in vivo stratejileri geçerlidir. In vitro yöntemler, dışsal RBPS yakalamak ve RNP kompleksleri 36,37 izole etmek için hücre lizatı ile RNA transkripsiyonu inkübe edin. Bu tip bir etkili bir yaklaşım, bir düzenleyici RNA motifi 18 bağlanan yeni proteinlerin tanımlanmasına olanak sağladı, en son verildi. Dernek Hücresel çevrenin dışında gerçekleştiğinden bu yöntemlerin bir dezavantajı spesifik olmayan RBPS bağlanmasını olduğunu. Kendi doğal ortamlarında, RNA-protein dernek daha iyi bir görünüm sağlayabilir iken proteinler çapraz olduğu in vivo yöntemler. Bundan başka, çapraz bağlanma izolasyonu sırasında daha yüksek sıkılığını ve bu nedenle daha yüksek bir özgüllük sağlar. ÇİFT yaklaşım 17 antisens transfeksiyon kullanırRBPS yakın bir peptid parçasını yönlendirmek için hedef RNA&#39;ya dizisi. peptid-RBPS daha sonra çapraz bağlanmış ve antisens sekansına tamamlayıcı olan bir sekansa bağlı boncuklar ile izole edilebilir. ÇİFT yöntemi nedeniyle karmaşık genom manipülasyonlar için gerek kalmadan bir çok hücre tipinde olan basit bir uygulama çok avantajlıdır. Ancak, transfeksiyon verimliliğine bağlıdır, ve hücrelerin düşük bir yüzde antisens kabul olguda düşük etkiye sahip olacaktır. Ayrıca, RBP peptit-antisens dizisinin izolasyonu antisens nükleik aside tamamlayıcı bir biyotinlenmiş oligonükleotid ile bağlanan manyetik streptavidin boncuk ile elde edilir. etkileşimler (manyetik boncuk, streptavidin biotin ve baz eşleşmesi) çokluğu izolasyon darlığı ve verimliliğini sınırlandırabilir. Burada açıklanan hızlı yöntem 24 çeşitli yönleriyle bu sınırlamalara bir alternatif sağlar. İlk olarak, tgenomik loci böylece veriminin arttırılması, tüm hücrelerin bunu ifade sağlar içine MS2 ve o entegrasyonu döngüler. İkincisi, bu oniki MS2 döngü dizilerine MS2-CP-GFP-SBP yüksek afinite etkileşim kullanır ve onları in vivo bağlamak sağlar. Üçüncü olarak, RNA-protein etkileşimi sabitleme daha sıkı yıkama sağlar ve spesifik olmayan şekilde bağlanmış proteinin tanımlanmasını azaltır. Son olarak, SKB alan yüksek afiniteli streptavidin boncuk bağlar ve kolayca serbest biotin ile akıtılır. RNA&#39;ya MS2 döngüsünün yerleştirilmesi için pertürbasyon en aza indirmek için ve ilmeklerin ekspresyonunu sağlamak için ORF 3 &#39;UTR ile tavsiye edilir. Altı MS2 24 döngü tekrarlar mRNA lokalizasyonu 38-40 görselleştirme için daha önce kullanılmıştır. Ancak, MS2 uzun bir dizinin ekleme işleme ve RNA&#39;nın yapısında değişikliklere neden olabilir döngüler; , bağlı RBPS repertuar transkript istikrarsızlaştırmak ya da değişebilirbuna. Bizim tecrübelerimize göre, 12 döngüler MS2 etiketli RNA 20 etkili bir elüsyon almak için yeterlidir. Bu bağlamda, biz genellikle bizim kuzey döllemeler ek kısa transkriptleri gözlenen unutmayın. Kuzey farklı prob bu kısa formları erken transkripsiyon sonlandırma göstergesidir MS2L ve 3 &#39;UTR 20 parçası dahil ortaya analizler. Bu gibi durumlarda 3 &#39;UTR ile bağlantılı proteinlerin izolasyonu etkinliğini azaltmak olasıdır. Bu nedenle, RNA içine sokulur döngü sayısı ve konumu yüksek verim pull ve transkript istikrar arasında dengeli olmalıdır. RNA bağlı proteinlerin maksimum dizinin verimli yalıtım ve algılamayı etkinleştirmek için protokol boyunca bozulmadan kalmasını vardır. Dış RNaz kirlenme şansı temiz bir çalışma alanı sağlamak, eldiven giyen RNaz içermeyen su ile çözeltisinin hazırlanması ve kısaca çalışarak azaltılabilirve verimli protokol süresini azaltmak için. Bununla birlikte, RNA bozulması en büyük katkıyı hücre erimesi üzerine lizat hücresel RNases salınımı olduğunu gördük. Bu geliştirilmiş RNA saflaştırma 41 mekanik değirmen sonuçları ile maya hücrelerinin bu kriyojenik taşlama önerilmiştir. Bu önemli bozulma bu protokol ile gözlenen durumlarda denenebilir. Açılan testlerin ortak dezavantajı kolona nonspesifik bağlayan sayısız proteinlerin izolasyonu olduğunu. Bu nedenle, etiketsiz RNA ile bir maya suşu kullanımı önemli kontrolüdür. Bu soy daha füzyon proteini olup hedef RNA bağlanan proteinler hariç tutmak için MS2-CP-GFP SBP füzyon proteinini ifade eder. Biz bu MS2 döngü kendini bağlamak olabilir proteinleri dışlamaz unutmayın ve bu protein açılan testi ile daha doğrulama gerekir. Şekil 1B biz bağlayan birkaç proteinleri tespit etmek mümkün olduğunu gösteriyorözellikle PMP1 mRNA&#39;ya ve bazı daha sonra eş-IP tahlilinde 20 tarafından doğrulanmıştır. HIZLI yöntem şu anda iyi bilinen sahaya özel entegrasyon yöntemleri kullanılarak, maya sistemleri ile sınırlıdır. Sahaya özel entegrasyon protokolleri şu CRISPR-Cas sistemi 42,43 kullanan diğer sistemlerde genler için geliştirilmektedir. Bu ek sistemlerin Rapid kullanımını genişleterek büyük önem taşıyacaktır. Rapid başka gelecekteki uygulama ilgilendiren bir mRNA ile ilişkili RNA&#39;lar izolasyonu içindir. Bu kolayca RNA DİZ yerine LC-MS / MS izole malzemenin tabi tutulması ile elde edilebilir. mRNA ekspresyonunu düzenleyen küçük RNA&#39;ların önemli roller göz önüne alındığında, bu uygulama, büyük önem olması muhtemeldir. Son olarak, kütle spektrometrisi gelişmeler (MS) analizi ve SILAC gibi nicel MS yöntemlerin kullanılması mRNA bağlı protein, kantitatif ölçüm ile sonuçlanacaktırFarklı koşullar altında ns. HIZLI maya ağır izotoplar ile zenginleştirilmiş bir ortam içinde büyütüldü ve etiketlenmemiş ortam 44,45 ilişkili durumlarda (örneğin, stres) altında yetişen hücreler ile karşılaştırıldığında kullanılabilir. kantitatif MS analizi ile birlikte hızlı yöntemi uygulayarak belli bir mRNA ile ilişkili RBP repertuarında değişikliklerin doğru önlemleri verecektir.

RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) S. yaklaşık% 10&#39;unu temsil cerevisiae proteinleri 1,2 ve memeli proteinlerinin 3-5 arasında yaklaşık% 15. Bunlar mRNA transkripsiyon sonrası işleme ve düzenleme, çeviri, ribozom biogenezinin, tRNA Aminoacylation ve modifikasyon, kromatin yeniden ve daha fazlası gibi birçok hücresel süreçlere de karışırlar. RBPS önemli bir alt grubu, mRNA bağlayıcı proteinler (mRNPs) 6,7 olan. MRNA olgunlaşma sürecinde, farklı RBPS transkript bağlamak ve nükleus, hücresel lokalizasyonu, çeviri ve bozulma 6-8 dışarı nükleer işleme, ihracat aracılık eder. Böylece, herhangi bir zaman noktasında belirli bir transkript bağlı RBPS ayrı set onun işleme ve sonuçta onun kaderi belirler. Bir mRNA ile ilişkili RBPS belirlenmesi önemli ölçüde transkripsiyon sonrası düzenleme altında yatan süreçlerin anlayışımızı artırabilir. genetik çeşitlilikMikroskobik, biyokimyasal ve biyoinformatik yöntemleri (9-11 gözden) mRNA düzenlenmesinde rol proteinleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birkaç özel bir hedef mRNA ile ilişkili proteinlerin belirlenmesini mümkün kılmaktadır. Dikkat çekici bir şekilde, maya hücreleri bir ekspresyon kolleksiyonunu taramak için yem olarak ilgili mRNA&#39;nın kullanır maya üç hibrid sistemi (Y3H) &#39;dir. Pozitif klonlar genellikle büyüme seçimi ya da muhabir ifade 12-14 ile gözlenir. Bu yöntemin en önemli avantajı, hücre ortamında ve RNA-protein etkileşiminin gücünü ölçmek için yeteneği taranabilir proteinlerin büyük bir sayıdır. Dezavantajları nedeniyle spesifik olmayan yanlış pozitif sonuç, görece olarak yüksek ve füzyon proteini, av veya yem RNA yanlış katlanma kısmen hatalı negatif sonuçlar, yüksek bir potansiyel bulunmaktadır. Genetik yaklaşım alternatif afinite purifi olanilişkili proteinler RNA katyonudur. Poli A ihtiva eden mRNA oligo dT sütun kullanılarak izole edilebilir, ve bunların ilişkili proteinler kütle spektrometrisi ile tespit edilir. RNA-protein etkileşimi, kısa menzilli kovalent bağlar yapan çapraz bağlama suretiyle, hücresel bir çerçevede, muhafaza edilir. Oligo dT sütunun kullanılması mRNA 3,5,15 A-içeren herhangi bir poli ile ilişkili tüm proteom küresel bir görünüm verir. Bununla birlikte, belirli bir mRNA ile ilişkili proteinlerin bir listesi sağlamaz. Çok az metotlar, bir kimlik gerçekleştirmek için kullanılabilir. ÇİFT yöntemi hedefe mRNA 16,17 ile tamamlayıcılık ile nükleik asidin transfeksiyon gerektirir. nükleik asit, aynı zamanda etkileşim bölgesi yakın çevresinde RBPS için çapraz bağlama sağlayan bir peptit eklenir. çapraz bağlama sonrasında RBP-peptid-nükleik asit izole edilebilir ve proteomik analizine tabi tutulmuştur. Son zamanlarda, bir aptamer tabanlı metodoloji oldubaşarılı bir şekilde, memeli hücre hatları 18 alıntılar uygulanır. streptavidin geliştirilmiş afiniteye sahip bir RNA aptamer geliştirilmiş ve (bu durumda AU zengin elemanı (ARE)) ilgi konusu bir sekansına kaynaştırılır. Aptamer RNA streptavidin boncuk bağlanmış ve hücre lizatı ile karıştırıldı. Sırasına ilişkili proteinler arıtıldı ve kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir. Bu yöntem hücresel ayarları (örneğin, in vitro) dışında meydana dernekler bulgulamışsak da, mRNA ile ilişkili proteinlerin izolasyonu genomuna aptamers vermek ve bu şekilde mümkün kılacak şekilde, gelecekte değişecektir olduğu süre hücresel ortam (yani, in vivo). Genetik manipülasyonlar iyi kurulmuş maya, olarak, (Prof. Dr. Jeff Gerst laboratuarında geliştirilen) hızlı yöntem, in vivo dernekler 19 bir görünüm sağlar. Rapid (özel ve MS2 kat proteinin bağlanma güçlü MS2- birleştirirVe) streptavidin bağlama alanı (SBP MS2 RNA dizisine CP) konjuge boncuk streptavidin. Bu streptavidin boncuk ile MS2 etiketli mRNA&#39;ların etkili arınma sağlar. Ayrıca, MS2 döngüler 12 kopya sentezleme RNA eş zamanlı olarak bağlanan ve izolasyon verimini geliştirmek için, altı MS2-CP izin verir. Bu protokol, bu nedenle elüt örnekler kütle spektrometrisi ile proteomik analizine tabi kez yeni mRNA ilişkili proteinlerin belirlenmesini sağlamak için önerilmiştir. Son zamanlarda, maya PMP1 mRNA 20 ile bağlantılı yeni proteinleri belirlemek için hızlı kullanmıştır. PMP1 mRNA daha önce ER membran ile ilişkili olduğu ve 3 &#39;çevrilmemiş bölgesi (UTR) Bu ilişki 21 önemli bir belirleyici olduğu bulunmuştur gördü. Bu nedenle, PMP1 3 &#39;UTR bağlanan RBPS lokalizasyonu önemli bir rol oynaması olasıdır. HIZLI sıvı kromatografı ve ardındany-kütle spektrometrisi / kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) PMP1 20 ile etkileşim çok sayıda yeni protein da tespit ettik. Bu yazıda, Rapid metodoloji ayrıntılı bir protokol sağlar, gerek önemli kontroller yapılır ve verim ve özgüllüğünü artırabilir teknik ipuçları edilecek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tris</td>
			<td style="width:107px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">1981232300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol (pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">3080521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td align="right">5551820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonuclease&#160; Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Beads</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BBI-8541701</td>
			<td>0.4-0.6mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini BeadBeater</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td colspan="2">Mini BeadBeater 16</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot phenol lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 M Sodium Acetate pH 5.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RaPID lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &#181;g/ml Leupeptin, 10 &#181;g/ml Aprotinin, 10 &#181;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &#181;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&#160; Inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Cross-linking reversal buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RaPID wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&#160; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0449</td>
			<td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SD selective medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td>
			<td colspan="2">Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td>
			<td>1:5,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8334</td>
			<td>1:3,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9169</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Rapid ilişkili proteinler ile spesifik bir hedef RNA&#39;nın izolasyonu sağlar. başarısı için kritik böylece proteinin yeterli miktarda elde edilmesi mümkün olduğu kadar sağlam RNA tutmak. RNA izolasyonu etkinliğini ve kalitesini saptamak için northern analizi (Şekil 1A) gerçekleştirilir. Kuzey analizi doğrudan Rapid verimliliğini ve kalitesini raporlama avantajına sahiptir. Bu nedenle, tam uzunluktaki ve bozunma ürünlerinin nispi miktarları tek bir vadede belirlenebilir. Ribozomal RNA (rRNA) etidyum bromür boyama kolaylıkla tespit edilir, ve elüsyon örnek rRNA eksikliği saflaştırma katılığını ifade eder. saflaştırma sıkılığı ve özgüllüğü, bundan başka elüsyon örneklerinde etiketlenmemiş bir mRNA&#39;nın bir sinyal olmaması (ACT1 alt panel) ile gösterilmektedir. ACT1 büyüklüğü değil FPR1 şeritte, belirgin sinyal, ön bir artık olanMS2L probu ile geçirilmifl hibridizasyon. kuzey analizi de giriş RNA sıcak fenol protokolü ile saflaştırılarak RNA oranla biraz daha bozulmuş olduğunu ortaya koymaktadır (/ ACT1 o sonda paneline c). Bu uzun zaman alır ve daha karmaşık bir hızlı bir protokol ilişkilendirilir. Bununla birlikte, tam uzunlukta bir önemli miktarda elüsyon fraksiyonu (MS2L prob) &#39;de güçlü bir sinyal ortaya gibi RNA, özellikle izole edilir etiketli. Protein Numuneler proteomik analizi (Şekil 1B), SDS-PAGE üzerinde işlenmiş ve gümüş boya ile boyanmış olabilir. kontrol izole bir numune, etiketsiz hücreleri (-MS2L) RNA&#39;ya bağlı olanlar ayırt spesifik olmayan dernekler yararlıdır. Bu nedenle, etiketli örnek (+ MS2L) güçlü sadece bantlar jel kesilmiş ve LC-MS / MS alınmaktadır. Genel RBPS ile Western analizi, protein eş saflaştırma etkinliğini göstermek için tavsiye edilir (Şekil1C). Burada, izolasyon verimini ve özgüllüğünü gösterir PMP1 20 veya GFP ile etkileştiği bilinmektedir Yef3 kullanılır. İlginçtir, Yef3 izolasyon verimi PMP1 ve FPR1 arasında farklılık göstermektedir ve GFP ile karşılaştırıldığında çok daha düşüktür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54467/54467fig1.jpg" /> Rapid (PMP1 ve FPR1) tabi tutuldu MS2L-etiketli RNA&#39;lar ve İlişkili Proteinlerin Tanımlanması. İki farklı RNA&#39;ların Sonuçlarının Şekil 1. Belirli İzolasyon. Sunulan hızlı deney saflaştırılmış RNA örnekleri (A) Northern blot analizi vardır. RNA, bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür ve etidyum bromid (üst panel) ile boyandı. Jel naylon zara şişelendi ve belirtilen problar (alt paneller) ile hibridizasyona tabi tutuldu. analiz örnekleri şunlardır: hızlı hücre erimesi (sıcak fenol [adım 1.4]), RaPID hücre erimesi (giriş [adım 1.13]) ve biotin ile elüsyon sonra (elüsyon [adım 1.24]). MS2 etiketli ve etiketsiz hücrelerden Rapid proteinlerin (B) Gümüş leke. MS2-etiketli PMP1 (+ MS2L) veya etiketlenmemiş (-MS2L) kontrol elüsyon fraksiyonları Protein numuneleri lekeli SDS-PAGE ve gümüş çalıştırılmıştır. (Yıldız ile gösterilen) diferansiyel yoğunluk ile bantlar jel kesilmiş ve kütle spektrometrisi analizi ile belirlenmiştir. Ok, eşit bir protein yükleme gösterir MS2-CP-GFP SBP füzyon proteinini belirtir. Alakasız şerit. Açıklık için dışarı kırpılmış pozitif kontrollerin (C) Batı analiz edildi. MS2-CP kaynaşma proteini Yef3 veya GFP kısmı tanıyan antikorlar ile Western blot yürütülmüştür. Alakasız şerit netlik için dışarı kesilmiş bulundu. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54467/54467fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Görüntüleme.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

Video: Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Genetik

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...