Wir danken Prof. Jeff Gerst und Boris Slobodin für ihre hilfreiche Ratschläge bei der schnellen Protokoll der Einrichtung und Bereitstellung der erforderlichen Plasmide. Wir danken auch Dr. Avigail Atir-Lande für ihre Hilfe dieses Protokoll und Dr. Tamar Ziv vom Smoler Proteomics Zentrum für ihre Hilfe bei der LC-MS / MS-Analyse zu etablieren. Wir danken Prof. TG Kinzy (Rutgers) für den YEF3 Antikörper. Diese Arbeit wurde durch Gewährung 2011013 vom Binationale Science Foundation unterstützt.

Hinweis: eine Sequenz einfügen, bestehend aus 12 MS2-Bindungsstellen (MS2 Schleifen; MS2L) in den genomischen Locus gewünschten, in der Regel zwischen dem offenen Leserahmen (ORF) und der 3&#39;-UTR. Ein detailliertes Protokoll für diese Integration wird an anderer Stelle 22 vorgesehen. Stellen Sie sicher , die richtige Insertion und Expression durch PCR, Northern - Analyse oder RT-PCR 20,23. Es ist wichtig zu überprüfen, dass die Integration nicht mit der Synthese des 3&#39;-UTR nicht beigetreten sind. Zusätzlich kann ein Plasmid-exprimierenden MS2-CP zu SBP unter der Expression eines induzierbaren Promotors (Methionin Depletion) fusioniert sollte auch in die Zellen 24 eingeführt werden. Ein identischer Stamm, mit Ausnahme der eingeführten MS12 Schleifen sollte als Kontrolle für den Nachweis von nicht-spezifischen Signalen verwendet werden. 1. schnelle Reinigung <ol><li> Wachsen 500 ml Hefezellen (verwenden 250-1,000 ml Hefezellen in Abhängigkeit von dem Expressionsniveau des Gens von Interesse) Exprimieren MS2-markierten mRNA 20 undMS2-CP-GFP-Fusionsprotein SBP 24 bis OD600 von 0,8 bis 1,0 bei 30 o C in dem geeigneten Wachstumsmedium (zB synthetische Dextrose (SD) selektives Medium). </li><li> Centrifuge Zellen bei 3000 × g für 4 min bei RT und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Zellen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), zentrifugieren wie zuvor (Schritt 1.2), Resuspendieren in einem gleichen Volumen (Schritt 1.1) von SD ohne Methionin und Inkubation für 45 - 60 min bei 30 o C Expression der MS2 zu induzieren -CP-GFP-SBP-Fusionsprotein. Hinweis: Längere Induktionszeit-Aggregation von GFP führen kann. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ml Zellen und Extrahieren von RNA aus dieser Probe 25 das einfache &quot;hot Phenol&quot; Methode. Achtung: Phenol ist sehr giftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitshinweisen behandelt werden. Hinweis: Diese RNA für die Qualität der isolierten RNA (1A) eine gute Referenz. </li><li> Für 500 ml Zellen, fügen 1,35 ml 37% Formaldehyd zu einem endgültigen cONZENTRATION von 0,1%, um die RNA-Protein-Komplexe zu vernetzen. Weiterhin Inkubation bei 30 o C für 10 min. Vorsicht: Formaldehyd ist hochgiftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitsanweisungen gehandhabt werden. </li><li> Hinzufügen 26,5 ml 2,5 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M und Inkubation für 3 min Vernetzung zu stoppen. Von diesem Schritt auf, alles auf Eis gelegt RNA-Abbau zu minimieren. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 3.000 × g für 4 min bei 4 ° C und Waschen mit 45 ml kaltem 1x PBS. </li><li> Die Zellen in 1 ml Lysis-Puffer RaPID pro 100 ml der ursprünglichen Zellkultur. </li><li> Geteilt in Aliquots von 500 ul in Schraubdeckelröhrchen Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ~ 400 mg gekühlten Glasperlen zu jedem aliquoten Teil (etwa eine volle 0,2 ml PCR-Röhrchen). </li><li> Lyse-Zellen in einem Wulst 3 min Beater. Sofort legte das Lysat auf Eis. Hinweis: Die Zelllyse Releases zelluläre RNasen, die die Hauptursache für RNA-Abbau sind. RaPID Lysis-Puffer enthält eine hohe Konzentration von RNase INHIsteller, wie die unspezifische RNase Inhibitor Heparin und spezifische Inhibitoren. Arbeiten schnell und halten alles kalt wird auch empfohlen. </li><li> Übertragen Sie das Lysat in neue Röhrchen. Pierce ein kleines Loch in der Unterseite jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer heißen Nadel (0,8 mm x 40 mm) und legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf der 15-ml-Röhrchen. Verwenden Sie den Kopf einer 5-ml-Spritze als Adapter zwischen den Mikrozentrifugenröhrchen und den 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen Montage bei 3000 × g für 1 min bei 4 o C </li><li> Übertragung der Durchfluss von der 15 - ml - Röhrchen in ein neues 1,5 - ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 10.000 xg für 10 min bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Pool Stände aus allen 1,5-ml-Röhrchen in einem einzigen 15-ml-Röhrchen und beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Protein Isolation bzw. eingestellt. Hinweis: Diese als &quot;Input&quot; Proben für die nachfolgende Analyse dienen wird (Abbildung 1). </li><li> In 300 ug Avidin pro 500 ml initial Hefekultur und inkubiere für 30 min (dies auf 10 min reduziert werden können) bei 4 ° C unter konstantem Walzen (10 rpm). Hinweis: Avidin- Blöcke Biotin und biotinylierte Proteine ​​aus den Streptavidin-Kügelchen binden. </li><li> Vorwäsche die Streptavidin-Kügelchen vor der Inkubation mit dem Zelllysat. <ol><li> Übertragen etwa 300 ul der Streptavidin-Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Gülle und die obere Überstand zu entfernen. Dies wird in 250 &amp; mgr; l der Kügelchen führen. Waschen der Kügelchen zweimal mit 1 ml Lysepuffer RaPID. Zentrifugieren Sie die Streptavidin - Kügelchen bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C zwischen jedem Schritt. </li><li> Blockieren die Perlen durch Inkubation für 1 h mit 0,5 ml RaPID Lysispuffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA und 10 ul 10 mg / ml Hefe-tRNA. Perlen können O / N in Blockierungslösung bei 4 ° C unter Rotation bei Bedarf gelassen werden. </li><li> Wasche zweimal mit 1 ml Lysis-Puffer RaPID. Hinweis: Die Magnetkügelchen können auch zur Verringerung der Zeit und backgr verwendet werdenound. Diese haben jedoch geringere Kapazität als Sepharosebeads. </li></ol></li><li> Nach Eintragen von 250 ul der vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen mit dem Avidin enthaltenden Lysat (aus Schritt 1.14) und inkubiere 1 h bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm). Anmerkung: Diese Inkubationszeit ist ein Kompromiß zwischen einer ausreichenden Bindungszeit Bereitstellung und minimiert die Chancen für die RNA-Abbau. </li><li> Zentrifuge bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C die Streptavidin - Kügelchen zu löschen und den Überstand in ein neues 15 - ml - Röhrchen übertragen. Beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Proteinisolierung sind. Hinweis: Diese werden die &quot;Unbound&quot; Proben sein. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Lysepuffer, leicht schütteln, Transfer in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge wie in Schritt 1.17. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Waschpuffer, und dieser Zeit drehen (10 Umdrehungen pro Minute) für 5 min bei 4 ° C. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li&gt; <li> Waschen der Kügelchen mit 1 ml 1x PBS und zentrifugiert wie oben beschrieben. </li><li> Waschen Sie die Perlen wieder mit 120 ul 1x PBS. Zentrifuge nach oben, und nehmen Sie die gesamte Überstand für die RNA-und Proteinextraktion als &quot;Wash&quot; Probe. Hinweis: Diese letzte Waschprobe die Stringenz der Wäschen zeigen werden und sollte als die Elution Probe des gleichen Volumens sein. Dies wird die Verarbeitung und das Laden in den nachfolgenden Tests vereinfachen. </li><li> Zu eluieren, RNA und RNA-assoziierten Proteine ​​aus der Säule, Zugabe von 120 ul 6 mM Biotin in 1x PBS und Inkubation für 45 min bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm). </li><li> Zentrifugieren Sie die wie oben Perlen und übertragen das eluierte Material in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Drehen Sie die eluierten Probe erneut und übertragen Sie die obere Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen keine Verschleppung von Perlen zu gewährleisten. </li><li> Nehmen Sie Proben für die RNA oder Proteinextraktion. Hinweis: genommen Das Volumen auf dem folgenden Assay und Expressionsniveau des RNA oder Protein von Interesse abhängen. Als Richtwert für die Northern - Analyse 26, nehmen 80% der Probe für Western - Blot 23,27 oder RT-PCR 28, 20% nehmen, und für 29 Massenspektrometrie neue Proteine zu entdecken, die gesamte Probe nehmen. </li></ol> 2. RNA-Extraktion <ol><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Crosslinking Reversal Puffer und Inkubation für 45 min bei 65 ° C. Fahren Sie direkt zur RNA-Extraktion. Hinweis: Das Crosslinking Reversal Puffer enthält Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die deutlich RNA - Extraktion 20 verbessert. </li><li> Verwenden Sie die Standard - Phenol: Chloroform - Methode 26 bis RNA aus dem &quot;Input&quot; zu extrahieren und &quot;ungebunden&quot; Proben (Schritte 1.13 und 1.17). Anmerkung: Diese Proben enthalten eine große Menge des RNase - Inhibitors Heparin, das nachfolgende Rück Transcriptase- (RT) unter Verwendung von Assays inhibieren können (zB RT-PCR), also 30 LiCl Fällung empfohlen wird , sie zu entfernen. Die &quot;wash &quot;und&quot; Elution &quot;Proben (Schritte 1.21 und 1.24) enthalten geringe Mengen an RNA und werden durch die folgenden Schritte gefällt. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von 8 M Guanidinium-HCl (GuHCl) und zwei Volumina 100% Ethanol zum &quot;Waschen&quot; und &quot;Elution&quot; Proben. Inkubieren bei -80 ° C für mindestens 2 Std. Hinweis: Guanidinium effizient Proteine ​​denaturieren und dadurch hemmen RNasen und Proteasen, die in der Probe. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g, 4 ° C für 30 min und den Überstand verwerfen. Waschen des Pellets mit kaltem 80% Ethanol und zentrifugiere wieder bei 20.000 × g, 4 ° C für 15 min. </li><li> Man löst das RNA-Pellet in 400 ul RNase freies Wasser und fallen wieder alle übrig gebliebenen GuHCl oder andere Verunreinigungen zu entfernen. Werden 40 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 800 ul 100% Ethanol, Inkubation bei -20 ° C für mindestens 1 Std. </li><li> Zentrifuge und waschen, wie in Schritt 2.4 und alle Ethanol mit einer 10 &amp; mgr; l Spitze zu entfernen. Resuspendieren RNA Pellet in 10 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser. Seien Sie besonders vorsichtig, wie das RNA-Pellet in der Regel nicht sichtbar ist. Hinweis: Die Proben können für Northern - Analyse verwendet werden , wie in 23 (Abbildung 1) beschrieben. </li></ol> 3. Proteinpräparat für Western Blot oder Massenspektrometrie-Analyse <ol><li> Hinzufügen 1/3 Volumen von 4x Laemmli Probenpuffer (LSB) auf Proteinproben und inkubiere 45 min bei 65 ° C die Vernetzung von RNA und Proteine ​​umzukehren. Anmerkung: Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Führen Proteine auf einem SDS - Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) 31. Den Prozent des Gels entsprechend der Größe der Proteine ​​analysiert werden. Anmerkung: 10% Acrylamid-Gel gibt eine breite Palette von Trennung und ist gut als erste Näherung. </li><li> Transferproteine an die Membran , wie in dem Standard - Immunoblot - Analyse 27 zur Steuerung der Isolationswirkungsgrad (1C). Fleck mit entweder Coomassie Blau R250 oder Silberfärbung vor der Massenspektrometrie-Analyse. Anmerkung: Silberfärbung die bevorzugte Wahl, da sie empfindlicher ist , und ermöglicht eine bessere Erkennung (1B). Die Färbung kann entweder mit manuell hergestellten Lösungen oder kommerziellen Kits durchgeführt werden. Die Inkubationszeit des Gels in der endgültigen Färbelösung sollte experimentell bestimmt werden. Lange Inkubation kann niedrig reichlich Proteine ​​zeigen, kann aber stark exprimierten Proteine ​​wie MS2-CP-SBP-GFP führen über gefärbt sein und kann rund um Proteine ​​in ihrer Umgebung verschleiern. Darüber hinaus könnte ein hoher Hintergrund auftreten. Folgen Sie der Reaktion sorgfältig und fügen Stopplösung zu gegebener Zeit. </li><li> Schneiden Sie Banden aus dem Gel und sie auf 1,5-ml-Röhrchen. Proben bei -20 ° C, oder zur Proteinextraktion und Trypsin - Verdau durch LC-MS / MS - Analyse 32 gefolgt senden. </li><li> Als Alternative Proteom-Ansatz, um die Gel-Trennungsschritt auszuschließen, verdauen eluierte Material aus Schritt 1.24 in solution unter Verwendung von Trypsin und vorbehaltlich der LC-MS / MS - Analyse 33. Hinweis: Das Weglassen des SDS-PAGE-Trennung das Protokoll vereinfacht und erhöht die Ausbeute. Jedoch könnten Proben Spuren des Detergens enthalten, NP-40, der Massenspektrometrieanalyse hemmt. Um dieses Problem zu lösen, führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Führen Protein auf SDS-PAGE 31 10 - 15 min. </li><li> Schneiden Sie den gesamten Abschnitt der Spur aus (dh wo die Proteine befinden). Hinweis: Die Proteinprobe kann eine erhebliche Menge des MS2-CP-SBP-Protein umfassen, die Signale mit niedriger Abundanz Proteine ​​verdunkeln kann. </li></ol></li></ol>

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR/Cas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway.">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572 (2015).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li><li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. 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The authors declare no competing financial interests.

Verschiedene Methoden verwenden , um die Isolierung von spezifischen mRNAs ihre zugehörigen Proteine 11,34 35 zu identifizieren. Diese Verfahren gelten in vitro und in vivo - Strategien RNA-Protein - Wechselwirkungen zu untersuchen. In - vitro - Verfahren inkubieren exogen RNA mit Zelllysat transkribiert RBPs zu erfassen und RNP - Komplexe 36,37 isolieren. Ein wirksames Konzept dieser Art wurde kürzlich vorgestellt, die die Identifizierung neuer Prot...

RNA-bindende Proteine (RBPs) stellen etwa 10% der S. cerevisiae Proteine 1,2 und etwa 15% von Säugetierproteinen 3-5. Sie sind in vielen zellulären Prozessen wie mRNA posttranskriptionales Verarbeitung und Regulation, Übersetzung, Ribosomenbiogenese, tRNA-Aminoacylierung und Modifikation, Chromatin-Remodeling beteiligt, und vieles mehr. Eine wichtige Untergruppe von RBPs ist die mRNA-bindende Proteine (mRNPs) 6,7. Im Zuge der mRNA Reifung, binden verschiedene RBPs das Transkript und vermitteln ihre Kern Verarbeitung, Export aus dem Zellkern, zelluläre Lokalisation, Übersetzung und Abbau 6-8. Somit bestimmt die unterschiedliche Menge von RBPs auf ein bestimmtes Transkript zu jedem Zeitpunkt verpflichtet, ihre Verarbeitung und letztlich sein Schicksal. Die Identifizierung von RBPs mit einer mRNA verbunden sind, könnten unser Verständnis der Prozesse zugrunde liegen, ihre Post-Transkriptionsregulation verbessern. Diverse genetischeWurden in mRNA Regulation beteiligten Proteine zu identifizieren (in 9-11 prüft), mikroskopische, biochemische und bioinformatische Methoden verwendet. Jedoch nur wenige dieser Verfahren ermöglichen die Identifizierung von Proteinen mit einer bestimmten Ziel-mRNA assoziiert. Bemerkenswert ist die Hefe-Drei-Hybrid-System (Y3H), die die mRNA von Interesse als Köder verwendet eine Expressionsbibliothek in Hefezellen zu screenen. Positive Klone werden in der Regel durch eine Wachstumsselektion oder Reporterexpression 12-14 beobachtet. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die große Anzahl von Proteinen, die in einer zellulären Umgebung und die Fähigkeit, abgetastet werden kann, die Festigkeit des RNA-Protein-Wechselwirkung zu messen. Nachteile sind die relativ große Anzahl an falsch positiven Ergebnissen aufgrund der unspezifischen Bindung, und das hohe Potenzial für falsch negative Ergebnisse darauf zurückzuführen, zum Teil auf Fehlfaltungen des Fusionsproteins Beute oder der Köder-RNA. Eine Alternative zur genetischen Ansatz ist Affinität purifiKation RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Poly A enthaltenden mRNAs kann durch die Verwendung von Oligo-dT-Säulen isoliert werden, und deren assoziierte Proteine ​​durch Massenspektrometrie detektiert werden. Die RNA-Protein-Wechselwirkung in seinem zellulären Kontext durch Vernetzung erhalten, die Kurzstrecken-kovalente Bindungen macht. Die Verwendung der Oligo - dT - Säule ergibt eine globale Sicht auf die gesamte Proteom , die mit jeder Poly - A-haltige mRNA 3,5,15 zugeordnet ist. Allerdings bedeutet dies nicht eine Liste von Proteinen bereitzustellen, die mit einer bestimmten mRNA assoziiert sind. Nur sehr wenige Methoden zur Verfügung, eine solche Identifikation zu erreichen. Das Paar Verfahren beinhaltet die Transfektion von Nukleinsäure mit Komplementarität zum Ziel - mRNA 16,17. Die Nukleinsäure wird auch an ein Peptid gebunden, das in der Nähe des Interaktionsstelle zu RBPs Vernetzung ermöglicht. Nach der Vernetzung kann das RBP-Peptid-Nukleinsäure isoliert und Proteomik-Analyse unterzogen werden. Vor kurzem wurde ein Aptamer-basierte Methodikerfolgreich angewendet 18 aus Säugerzelllinien extrahiert. Ein RNA-Aptamer mit verbesserter Affinität an Streptavidin wurde auf eine Sequenz von Interesse (AU-rich Element (ARE) in diesem Fall) entwickelt und aufgeschmolzen. Das Aptamer-ARE-RNA wurde an Streptavidin-Kügelchen und gemischt mit Zelllysat angebracht. Proteine, die mit der ARE-Sequenz zugeordnet wurden gereinigt und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Obwohl dieses Verfahren Verbände detektiert , die außerhalb der zellulären Einstellungen auftreten (dh in vitro), ist es wahrscheinlich in der Zukunft modifiziert werden , um die Aptamere in das Genom einzuführen und somit die Isolierung von Proteinen mit der mRNA , während in der zugeordneten Freigabe Zellmilieu (dh in vivo). In Hefe, wo genetische Manipulationen gut etabliert sind, bietet die schnelle Methode (entwickelt von Prof. Jeff Gerst Labor) eine Ansicht der in vivo - Vereinigungen 19. RaPID kombiniert die spezifische und starke Bindung des MS2-Hüllprotein (MS2-CP) an die MS2-RNA-Sequenz und der Streptavidin-Bindungsdomäne (SBP) konjugierte Kügelchen an Streptavidin. Dies ermöglicht eine effiziente Reinigung von MS2-markierten mRNAs durch Streptavidinkügelchen. Darüber hinaus wird die Expression von 12 Kopien von MS2-Schleifen können bis zu sechs MS2-CPs bis gleichzeitig an die RNA binden und die Effizienz seiner Isolation zu erhöhen. Dieses Protokoll wurde daher vorgeschlagen, die Identifizierung neuer mRNA-assoziierten Proteinen zu ermöglichen, sobald die eluierten Proben Proteomik-Analyse durch Massenspektrometrie unterzogen werden. Wir RaPID kürzlich verwendet , um neue Proteine zu identifizieren mit der Hefe assoziiert PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA wurde zuvor gezeigt , mit der ER - Membran und dessen 3&#39; - untranslatierten Region (UTR) wurde 21 in diesem Verband eine wichtige Determinante erwiesen assoziiert. So RBPs die PMP1 3 &#39;UTR binden , sind wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Lokalisierung zu spielen. RaPID gefolgt von Flüssigkeitschromatographeny-Massenspektrometrie / Massenspektrometrie (LC-MS / MS) führte zur Identifizierung vieler neuer Proteine , die mit PMP1 20 interagieren. Wir berichten hier über ein detailliertes Protokoll der Methodik RaPID bieten, wichtige Kontrollen, die getan werden müssen, und technische Tipps, die Ausbeute und Spezifität verbessern kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tris</td>
			<td style="width:107px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">1981232300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol (pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">3080521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td align="right">5551820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonuclease&#160; Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Beads</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BBI-8541701</td>
			<td>0.4-0.6mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini BeadBeater</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td colspan="2">Mini BeadBeater 16</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot phenol lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 M Sodium Acetate pH 5.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RaPID lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &#181;g/ml Leupeptin, 10 &#181;g/ml Aprotinin, 10 &#181;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &#181;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&#160; Inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Cross-linking reversal buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RaPID wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&#160; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0449</td>
			<td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SD selective medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td>
			<td colspan="2">Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td>
			<td>1:5,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8334</td>
			<td>1:3,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9169</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RaPID ermöglicht die Isolierung einer spezifischen Ziel-RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Kritisch für den Erfolg hält die RNA intakt, so viel wie möglich, wodurch eine ausreichende Menge der Proteine ​​zu erhalten. Um die Isolation Effizienz und Qualität der RNA, Northern - Analyse durchgeführt (Abbildung 1A) bestimmen. Die Northern-Analyse hat den Vorteil, unmittelbar auf die Effizienz und die Qualität der raschen Meldung. Somit können die relativen Me...

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

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Serie: Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Forschung

Genetik

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Neue Sequenz Entdeckung durch subtraktive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik