Agradecemos Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin para os seus conselhos úteis na criação do protocolo rápida e fornecendo os plasmídeos necessários. Agradecemos também a Dr. Abigail Atir-Lande por sua ajuda no estabelecimento deste protocolo e Dr. Tamar Ziv do Smoler Proteomics Center for sua ajuda com a análise LC-MS / MS. Agradecemos Prof. TG Kinzy (Rutgers) para o anticorpo YEF3. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2011013 do Binacional Science Foundation.

Nota: Inserir uma sequência que consiste em 12 locais de ligação MS2 (MS2 malhas; MS2L) no locus genómico desejado, geralmente entre a grelha de leitura aberta (ORF) e a 3 &#39;UTR. Um protocolo detalhado para essa integração é fornecido em outros lugares 22. Verifique a inserção correta e expressão por PCR, análise de Northern ou RT-PCR 20,23. É importante verificar que a integração não interferiu com a síntese do 3 &#39;UTR. Além disso, um plasmídeo que expressa MS2 CP-fundido com PAS sob a expressão de um promotor indutível (depleção de metionina) também deve ser introduzido nas células 24. Uma estirpe idêntica, excluindo os loops MS12 introduzidas, deve ser utilizado como um controlo para a detecção de sinais não específicos. 1. purificação rápida <ol><li> Cresça 500 ml de células de levedura (250-1,000 usar ml de células de levedura de acordo com o nível da expressão do gene de interesse) que expressam ARNm de MS2-tagged 20 eProteína de fusão MS2-CP-GFP-PAS 24 a DO600 0,8-1,0 a 30 ° C no meio de crescimento apropriado (por exemplo, dextrose sintética (SD) meio selectivo). </li><li> células Centrifugar a 3000 x g durante 4 min a RT e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar células em 1x tampão de fosfatos salino (PBS), de centrifugação, como anteriormente (passo 1.2), ressuspender em um volume igual (passo 1.1) de SD sem metionina, e incubar durante 45 - 60 min a 30 ° C para induzir a expressão da MS2 -CP-GFP-PAS proteína de fusão. Nota: tempo de indução mais longos podem causar agregação de GFP. </li><li> Retiradas 10 ml de células e extrair RNA a partir desta amostra usando o método simples &quot;fenol quente&quot; 25. Atenção: O fenol é altamente tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança. Nota: Este ARN é uma boa referência para a qualidade do ARN isolado (Figura 1A). </li><li> Por 500 ml células, adicionar 1,35 ml de 37% de formaldeído para a final concentration de 0,1% para reticular os complexos de ARN-proteína. Continue incubação a 30 o C por 10 min. Atenção: O formaldeído é altamente tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança. </li><li> Adicionar 26,5 ml de 2,5 M de glicina para uma concentração final de 0,125 M e incuba-se durante 3 minutos para parar a reticulação. A partir deste passo, colocar tudo em gelo para minimizar a degradação do RNA. </li><li> Células centrifugar a 3000 xg durante 4 min a 4 ° C e lavar com 45 ml frio 1x PBS. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de tampão de lise rápida por 100 ml de cultura de células inicial. </li><li> Dividido em alíquotas de 500 mL em tubos de microcentrífuga com tampa de rosca e adicione ~ 400 mg de contas de vidro refrigerada a cada alíquota (cerca de um total de 0,2 ml tubo de PCR). </li><li> Lisar as células em um grânulo batedor durante 3 min. imediatamente colocar o lisado em gelo. Nota: lise celular lançamentos RNases celulares, que são a principal causa de degradação do RNA. tampão de lise rápida contém uma elevada concentração de RNase inhibitors, tais como a heparina não específica inibidor de RNase e inibidores específicos. Trabalhando rapidamente e manter tudo frio também é recomendado. </li><li> Transferir o lisado para novos tubos. Pierce um pequeno orifício na parte inferior de cada tubo de microcentrífuga com uma agulha quente (0,8 mm x 40 mm) e colocar os tubos de microcentrífuga de topo dos tubos de 15 ml. Utilizar a cabeça de uma seringa de 5 ml, como um adaptador entre os tubos de microcentrífuga e os tubos de 15 ml. Centrifugar a montagem de tubos a 3000 xg durante 1 min a 4 o C. </li><li> Transferir o fluxo através do tubo de 15 mL para um novo tubo de 1,5 ml e centrifugar a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar os detritos celulares. </li><li> sobrenadantes de piscina de todos os tubos de 1,5 ml em um único tubo de 15 ml, e reserve 1/50 e 1/100 do volume do lisado para o RNA e isolamento de proteínas, respectivamente. Nota: Estes irão servir como as amostras de &quot;input&quot; para posterior análise (Figura 1). </li><li> Adicionar 300 ug de avidina por 500 ml de ie cultura de levedura nitial incubar durante 30 minutos (este pode ser reduzido para 10 min) a 4 ° C sob rolamento constante (10 rpm). Nota: Os blocos de avidina e biotina proteínas biotiniladas se liguem às esferas de estreptavidina. </li><li> A pré-lavagem as esferas de estreptavidina antes da incubação com lisado de células. <ol><li> Transferir cerca de 300 ul de estreptavidina grânulos lama para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e remover o sobrenadante superior. Isto irá resultar em 250 ul de pérolas. Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão de lise rápida. Centrifugar as esferas de estreptavidina a 660 xg durante 2 min a 4 ° C entre cada passo. </li><li> Bloquear as pérolas por incubação durante 1 h com 0,5 ml de tampão de lise rápida, a 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA e 10 uL de 10 mg / ml de ARNt de levedura. Grânulos podem ser deixados O / N em solução de bloqueio a 4 ° C com rotação, se necessário. </li><li> Lavar duas vezes com 1 ml de tampão de lise rápida. Nota: As esferas magnéticas pode também ser utilizado para reduzir o tempo e background. Estes, no entanto, tem menor capacidade do que esferas de sepharose. </li></ol></li><li> Adicionar 250 ul das esferas de estreptavidina pré-lavado para o lisado contendo avidina (a partir do passo de 1,14) e incubar 1 h a 4 ° C com rotação constante (10 rpm). Nota: Este tempo de incubação é um compromisso entre a prestação de tempo de ligação suficiente e minimizando as chances de degradação do RNA. </li><li> Centrifuga-se a 660 xg durante 2 min a 4 ° C para eliminar as esferas de estreptavidina e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml. Separe 1/50 e 1/100 do volume do lisado para o isolamento de ARN e proteína, respectivamente. Nota: Estas serão as amostras não ligadas &quot;&quot;. </li><li> Lavam-se as esferas com 1 ml de tampão de lise rápida, agitar, transferir para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, e centrifuga-se tal como no passo 1.17. Repita este passo três vezes. </li><li> Lavam-se as esferas com 1 ml de tampão de lavagem rápida, e esta gire tempo (10 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Repita esta etapa duas vezes. </li&gt; <li> Lavam-se as esferas com 1 ml de PBS 1x e centrifugação tal como acima. </li><li> Lavam-se as esferas de novo com 120 ul de PBS 1x. Centrifugar como acima, e tomar todo o sobrenadante para o ARN e a extracção de proteínas como a amostra de &quot;lavagem&quot;. Nota: Esta última amostra de lavagem indica o rigor das lavagens e deve ser do mesmo volume que a amostra de eluição. Isto irá simplificar o processamento e carregamento em ensaios subsequentes. </li><li> Para eluir o ARN e proteínas associadas ao ARN a partir da coluna, adicionar 120 ul de biotina 6 mM em PBS 1x e incubar durante 45 min a 4 ° C com rotação constante (10 rpm). </li><li> Centrifugar as esferas como anteriormente e transferir o material fluido para um novo tubo de 1,5 mL. Girar a amostra eluiu-se novamente e transferir a fase superior para um novo tubo de 1,5 mL para garantir que não haja transição de grânulos. </li><li> Colher amostras para RNA ou extração de proteínas. Nota: O volume ocupado deve depender do nível seguinte ensaio e a expressão do ARN ou proteína de interesse. Como orientação, para análise do Norte 26, tomar 80% da amostra, por Western blot 23,27 ou RT-PCR 28, tome 20%, e por espectrometria de massa 29 para descobrir novas proteínas, tome toda a amostra. </li></ol> 2. Extracção de ARN <ol><li> Adicionar um volume igual de tampão de reticulação 2x Reversão e incubar durante 45 min a 65 ° C. Continue diretamente para a extração de RNA. Nota: A reversão de reticulação contém tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), o que melhora de forma significativa a extracção de RNA 20. </li><li> Use o fenol padrão: Método de clorofórmio 26 para extrair RNA do &quot;input&quot; e amostras &quot;não ligados&quot; (passos de 1,13 e 1,17). Nota: Estas amostras contêm uma grande quantidade de heparina o inibidor de RNase, que pode inibir a ensaios utilizando subsequentes Transcriptase- reversa (RT) (por exemplo, RT-PCR), por conseguinte, LiCl precipitação 30 é aconselhada para removê-lo. O WAsh &quot;e&quot; &quot;amostras de eluição (passos 1.21 e 1.24) contêm pequenas quantidades de ARN e são precipitados através dos seguintes passos. </li><li> Adicionar um volume igual de guanidínio 8M-HCI (GuHCI) e dois volumes de etanol a 100% à &quot;lavagem&quot; e amostras de &quot;eluição&quot;. Incubar a -80 ° C durante pelo menos 2 h. Nota: guanidínio será eficiente desnaturar as proteínas e, assim, inibir as RNases e proteases na amostra. </li><li> Centrifuga-se a 20000 xg, a 4 ° C durante 30 min e desprezar o sobrenadante. Lava-se a pastilha com etanol frio a 80% e centrifuga-se novamente a 20000 xg, 4 ° C durante 15 min. </li><li> Dissolver o sedimento RNA em 400 mL de RNase água livre e precipitar novamente para remover qualquer sobra GuHCl ou outros contaminantes. Adicionar 40 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 800 ul de etanol a 100%, incuba-se a -20 ° C durante pelo menos 1 h. </li><li> Centrífuga e lavar como no passo 2.4 e remover todo o etanol com uma ponta de 10 mL. Ressuspender o Pell RNAet em 10 mL RNase água livre. Tome cuidado extra como o sedimento RNA normalmente não é visível. Nota: As amostras podem ser utilizadas para a análise de Northern como descrito em 23 (Figura 1). </li></ol> 3. Proteína Preparação para Western Blot ou Análise Espectrometria de Massa <ol><li> Adicione 1/3 do volume de tampão de amostra de Laemmli 4x (LSB) para amostras de proteína e incubar 45 min a 65 ° C para inverter a ligação cruzada de proteínas e RNA. Nota: As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C. </li><li> Proteínas executado em um gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) 31. Ajustar a percentagem de gel de acordo com o tamanho das proteínas a ser analisada. Nota: gel de acrilamida a 10% dá uma vasta gama de separação e está bem como uma primeira aproximação. </li><li> Transferir as proteínas para a membrana como na análise de imunomarcação padrão 27 para controlo da eficiência de isolamento (Figura 1C). Manchar ou com Coomassie Blue R250 ou prata mancha antes da análise de espectrometria de massa. Nota: mancha de prata é a escolha preferida, pois é mais sensível e permite uma melhor detecção (Figura 1B). A coloração pode ser feito com qualquer soluções preparadas manualmente ou kits comerciais. O tempo de incubação do gel na solução final corante deve ser determinada experimentalmente. Longo incubação pode revelar proteínas abundantes de baixo, mas pode causar proteínas altamente expressos tais como MS2-CP-PAS-GFP para ser mais manchado e podem mascarar proteínas circundantes na sua vizinhança. Além disso, pode ocorrer um fundo alta. Siga a reação com cuidado, e adicionar solução de parada no momento apropriado. </li><li> Cortar bandas do gel e transferi-los para tubos de 1,5 ml. Armazenar as amostras a -20 ° C, ou enviar para a extracção de proteína e digestão com tripsina seguida por análise por LC-MS / MS 32. </li><li> Como uma abordagem alternativa para proteómica exclui a etapa de separação em gel, digerir material eluído a partir do passo 1.24 em tãolução utilizando tripsina e sujeita a análise por LC-MS / MS 33. Nota: Omitir a separação SDS-PAGE simplifica o protocolo e aumenta o rendimento. No entanto, as amostras podem conter vestígios de detergente NP-40, que inibe a análise de espectrometria de massa. Para ultrapassar este problema, execute os seguintes passos: <ol><li> Executar proteína em SDS-PAGE a 31 por 10 - 15 min. </li><li> Cortar toda a porção de pista (isto é, onde as proteínas estão localizados). Nota: A amostra de proteína pode incluir uma quantidade significativa de proteína-MS2 CP-PAS que podem obscurecer os sinais de proteínas de baixa abundância. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Vários métodos utilizam o isolamento de ARNm específicos para identificar as suas proteínas associadas 11,34 35. Estes métodos aplicam-se in vitro e in vivo em estratégias para investigar interacções ARN-proteína. Métodos in vitro incubar exogenamente ARN transcrito com lisado celular para capturar RBPs e isolar complexos de RNP 36,37. Uma abordagem eficaz deste tipo foi apresentado recentemente, o que permitiu a identificação de novas proteínas que se ligam um motivo RNA regulamentar 18. Uma desvantagem destes métodos é a ligação do RBPs não específicos porque a associação ocorre fora do ambiente celular. Métodos in vivo, em que as proteínas são reticuladas enquanto nos seus ambientes naturais, pode proporcionar uma melhor vista de associação ARN-proteína. Além disso, a reticulação permite maior rigor durante o isolamento e, por conseguinte, uma maior especificidade. A abordagem utiliza a de 17 pares de transfecção do anti-sentidosequência com o ARN alvo, a fim de dirigir uma porção de peptídeo para a vizinhança da RBPs. O péptido-RBPs pode então ser reticulado e isolado através de grânulos que estão ligadas a uma sequência que é complementar à sequência anti-sentido. A metodologia par é muito vantajoso devido a sua aplicação simples para vários tipos de células, sem a necessidade de manipulações complexas genómicos. É, no entanto, dependente da eficiência de transfecção, e os casos em que uma baixa percentagem de células aceitam o anti-sentido terá baixa eficácia. Além disso, o isolamento da sequência de RBP-péptido anti-sentido é obtido por meio de esferas de estreptavidina magnéticas que são acopladas com o oligonucleótido biotinilado complementar ao ácido nucleico anti-sentido. A multiplicidade de interacções (contas magnéticas de estreptavidina-biotina, e o emparelhamento de bases) pode limitar o rigor e a eficiência do isolamento. O método de rápida 24 descrito aqui fornece uma alternativa a estas limitações em vários aspectos. Em primeiro lugar, tele integração da MS2 laços em loci genómico assegura que todas as células que expressam, aumentando assim o seu rendimento. Em segundo lugar, que utiliza a interacção de elevada afinidade da MS2-CP-GFP-PAS para doze MS2 sequências de loop e permite que eles se ligam in vivo. Em terceiro lugar, a fixação da interacção RNA-proteína permite lavagens mais rigorosas e reduz a identificação de proteínas não-especificamente ligadas. Finalmente, o domínio PAS esferas de estreptavidina liga-se com elevada afinidade e pode ser facilmente eluo com biotina livre. A inserção do loop MS2 para o ARN é aconselhável entre a ORF e a UTR 3 &#39;para minimizar a perturbação e tradução para assegurar a expressão de todos os laços. Seis a 24 MS2 loop se repete foram usadas previamente para a visualização de ARNm localização 38-40. No entanto, a inserção de uma sequência longa de MS2 laços podem causar alterações no processamento e a estrutura do ARN; que poderia desestabilizar a transcrição ou alterar o repertório de RBPs ligadoa ele. Em nossa experiência, 12 voltas são suficientes para obter uma eluição eficiente da MS2-marcado RNA 20. A este respeito, notamos que normalmente observamos transcrições mais curtos adicionais em nossas hibridações do norte. Análises Northern com sondas diferentes revelaram que estas formas mais curtas incluído o MS2L e parte da UTR 3 &#39;de 20, indicativo de terminação prematura da transcrição. Tais casos, são susceptíveis de reduzir a eficiência do isolamento de proteínas associadas com a UTR 3 &#39;. Portanto, o número de lacetes inseridos e sua localização no interior do ARN deve ser equilibrada entre alta eficiência suspenso e estabilidade transcrição. O ARN tem de permanecer intacto durante todo o protocolo para permitir o isolamento eficiente e detecção da matriz máxima de proteínas ligadas. As chances de contaminação RNase externo pode ser reduzido através do uso de luvas, garantindo uma área de trabalho limpa, preparando solução com água livre de RNase, e trabalhando de forma concisae eficiente para reduzir o tempo de protocolo. No entanto, verificou-se que o maior contribuinte para a degradação de RNA é a libertação de RNases celulares ao lisado sobre a lise celular. Foi proposto que moagem criogênica de células de levedura com uma mecânicos resultados moinho na melhoria da purificação de RNA 41. Isto pode ser julgado nos casos em que a degradação significativa é observada com este protocolo. Uma desvantagem comum de ensaios suspensos é o isolamento de numerosas proteínas que se ligam inespecificamente à coluna. Portanto, o uso de uma estirpe de levedura com ARN não marcado é um controlo importante. Esta estirpe expressa a proteína de fusão MS2-CP-GFP-PAS para excluir ainda mais proteínas que se ligam à proteína de fusão e não o ARN alvo. Notamos que isso não exclui proteínas que podem se ligam o laço MS2 em si, e estes precisam de uma validação adicional com o ensaio de pull-down proteína. A Figura 1B mostra que fomos capazes de identificar várias proteínas que se ligamespecificamente a ARNm Pmp1, e alguns foram subsequentemente validado por um ensaio de co-IP 20. A metodologia rápida está actualmente limitada a sistemas de levedura, utilizando as suas metodologias de integração específicas do local bem estabelecidos. Protocolos de integração específicas do local estão actualmente a ser desenvolvido para genes em outros sistemas que utilizam o sistema CRISPR-cas 42,43. Estes serão de grande importância na expansão da utilização de rápida aos sistemas adicionais. Outra aplicação do futuro é rápida para o isolamento de ARN que estão associados com um mRNA de interesse. Isto pode ser facilmente conseguido, submetendo o material isolado a ARN-SEQ em vez de LC-MS / MS. Considerando-se os papéis importantes de pequenos RNAs na regulação da expressão de ARNm, esta aplicação é susceptível de ser de grande importância. Finalmente, as melhorias na espectrometria de massa (MS) e análise da utilização de métodos quantitativos, tais como MS SILAC resultará na medida quantitativa de ARNm protei-boundns sob diferentes condições. Rápido pode ser usado com leveduras cultivadas em meios enriquecidos com isótopos pesados e comparados com células cultivadas em condições diferentes (por exemplo, stress) com meios não marcados 44,45. Aplicando o método rápido juntamente com a análise quantitativa MS irá produzir medidas precisas das alterações no repertório de RBP que estão associados com um ARNm específico.

Proteínas de ligação a ARN (RBPs) representar cerca de 10% de S. proteínas cerevisiae 1,2 e cerca de 15% de proteínas de mamífero 3-5. Eles estão envolvidos em muitos processos celulares, tais como processamento de mRNA pós-transcricional e regulação, tradução, biogênese do ribossomo, tRNA aminoacilaï¿½o e modificação, a remodelação da cromatina, e muito mais. Um subgrupo importante de RBPs é as proteínas de ligação ao ARNm (mRNPs) 6,7. No decurso da maturação do mRNA, diferentes RBPs ligar a transcrição e mediar a transformação nuclear, exportação para fora do núcleo, a localização celular, tradução e degradação 6-8. Assim, o conjunto distinto de RBPs ligados a um transcrito particular, a qualquer ponto de tempo determina o seu processamento e em última análise o seu destino. A identificação de RBPs associados a um mRNA poderia melhorar significativamente a nossa compreensão dos processos subjacentes à sua regulação pós-transcricional. Diverse genética, Métodos microscópicos, bioquímicos e de bioinformática têm sido utilizados para identificar proteínas envolvidas na regulação do ARNm (revisto em 9-11). No entanto, apenas alguns desses métodos permitem a identificação de proteínas associadas a um ARNm alvo particular. Digno de nota é o sistema híbrido de levedura Três (Y3H), que utiliza o mRNA de interesse como isca para pesquisar uma biblioteca de expressão em células de levedura. Os clones positivos são observados geralmente através de uma selecção de crescimento ou repórter expressão 12-14. A principal vantagem deste método é o grande número de proteínas que podem ser digitalizados num ambiente celular e a capacidade para medir a força da interacção RNA-proteína. Desvantagens incluem o número relativamente grande de resultados falsos positivos devido à ligação não específica, eo alto potencial de resultados falsos negativos devido, em parte, a misfolding da presa proteína de fusão ou o RNA isca. Uma alternativa à abordagem genética é purifi afinidadecatião de ARN com as suas proteínas associadas. Poli A contendo ARNm pode ser isolado através da utilização de colunas de oligo dT, e as suas proteínas associadas são detectados por espectrometria de massa. A interacção RNA-proteína é conservado no seu contexto celular por reticulação, o que faz com que as ligações covalentes de curto alcance. A utilização da coluna de oligo dT proporciona uma visão global de todo o proteoma que está associado com qualquer poli A de mRNA contendo 3,5,15. No entanto, este não fornece uma lista de proteínas que estão associadas com um ARNm específico. Muito poucos métodos estão disponíveis para realizar uma tal identificação. O método implica a transfecção PAR de ácido nucleico com complementaridade com o mRNA alvo 16,17. O ácido nucleico está também ligado a um péptido, o que permite a reticulação de RBPs em estreita proximidade ao local de interacção. Após a reticulação, o ácido nucleico RBP-péptido pode ser isolado e submetido a análise proteómica. Recentemente, uma metodologia baseada na aptâmero eraaplicado com sucesso a extractos de linhas de células de mamíferos 18. Um aptâmero de ARN com afinidade melhorada para estreptavidina e foi desenvolvido fundido com uma sequência de interesse (elemento ricos em AU (ARE), neste caso). O ARN aptâmero-ARE foi ligado a esferas de estreptavidina e misturados com o lisado celular. As proteínas associadas a que a sequência são foram purificados e identificados por espectrometria de massa (MS). Embora este método detectado associações que ocorrem fora das definições celulares (isto é, in vitro), é susceptível de ser modificado no futuro, de modo a introduzir os aptâmeros no genoma e, assim, permitir o isolamento de proteínas associadas com o ARNm enquanto que na meio celular (isto é, in vivo). Em leveduras, onde manipulações genéticas estão bem estabelecidos, o método rápido (desenvolvido no laboratório do Prof. Jeff Gerst) fornece uma visão in vivo associações 19. Rápida combina o específico e forte ligação da proteína de revestimento de MS2 (MS2-CP) para a sequência de ARN MS2, e do domínio de ligação a estreptavidina (SBP) a estreptavidina esferas conjugadas. Isso permite a purificação eficiente de mRNAs MS2-marcadas através de contas de estreptavidina. Além disso, a expressão de 12 cópias de MS2 laços permite até seis MS2-CPS de se ligar simultaneamente para o RNA e aumentar a eficiência do seu isolamento. Este protocolo foi, portanto, sugerida para permitir a identificação de novas proteínas associadas à ARNm uma vez que as amostras eluídas são sujeitas a análise por espectrometria de massa proteómica. Recentemente, utilizou rápido para identificar novas proteínas associadas com a levedura Pmp1 ARNm 20. Pmp1 ARNm foi anteriormente mostrado para ser associado com a membrana do RE e do seu 3 &#39;não traduzida (UTR) foi encontrado para ser um dos principais determinantes nesta associação 21. Assim, RBPs que se ligam Pmp1 UTR 3 &#39;são susceptíveis de desempenhar um papel importante na sua localização. Rápida seguida de cromatografia líquiday-espectrometria de massa / espectrometria de massa (LC-MS / MS) resultou na identificação de várias novas proteínas que interagem com Pmp1 20. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado da metodologia rápida, controles importantes que precisam ser feitas, e dicas técnicas que podem melhorar o rendimento e especificidade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tris</td>
			<td style="width:107px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">1981232300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol (pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>bio-lab</td>
			<td align="right">3080521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td align="right">5551820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonuclease&#160; Inhibitor</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Beads</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BBI-8541701</td>
			<td>0.4-0.6mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini BeadBeater</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td colspan="2">Mini BeadBeater 16</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td dir="LTR">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot phenol lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 M Sodium Acetate pH 5.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RaPID lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &#181;g/ml Leupeptin, 10 &#181;g/ml Aprotinin, 10 &#181;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &#181;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&#160; Inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Cross-linking reversal buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RaPID wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&#160; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Stain Plus Kit</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0449</td>
			<td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SD selective medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td>
			<td colspan="2">Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td>
			<td>1:5,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8334</td>
			<td>1:3,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9169</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RAPID permite o isolamento de um ARN alvo específico com as suas proteínas associadas. Crítico para o seu sucesso é manter o ARN intacto, tanto quanto possível, obtendo-se assim uma quantidade suficiente de proteínas. Para determinar a eficiência e a qualidade de isolamento de ARN, análise de Northern é realizado (Figura 1A). análise do Norte tem a vantagem de reportar diretamente a eficiência e qualidade dos rápidos. Assim, as quantidades relativas dos produtos de degradação e de comprimento completo pode ser determinada num único ensaio. ARN ribossomal (ARNr) são detectados facilmente na coloração com brometo de etídio, e a falta de rRNAs na amostra de eluição indica a severidade da purificação. O rigor e a especificidade da purificação são adicionalmente demonstrada pela ausência de um sinal de um ARNm não marcado nas amostras de eluição (ACT1 painel inferior). O sinal aparente na pista FPR1, que não é do tamanho de ACT1, é um resto de préhibridação vio com a sonda MS2L. A análise de Northern também revela que o ARN de entrada é um tanto mais degradado em comparação com RNA que foi purificado por o protocolo de fenol quente (c / o painel ACT1 sonda). Isto é atribuído ao protocolo RAPID mais longas e mais complicadas. No entanto, uma quantidade significativa de todo o comprimento, com etiquetas de ARN é isolado especificamente, como revelado pelo sinal forte na fracção de eluição (sonda MS2L). As amostras de proteínas podem ser executados em SDS-PAGE e coradas por coloração de prata antes da análise proteómica (Figura 1B). Uma amostra isolada do controle, as células não marcadas (-MS2L) é útil em associações não específicas distintivas de os dependentes de ARN. Por conseguinte, apenas as bandas que são mais fortes na amostra com a etiqueta (+ MS2L) são cortados do gel e levado para a LC-MS / MS. Análise de Western com RBPs gerais também é recomendado para indicar a eficiência de co-purificação de proteína (Figura1C). Aqui, utilizou-se Yef3, que é conhecido por interagir com Pmp1 20, ou GFP, o que indica a eficiência global e a especificidade do isolamento. Curiosamente, a eficácia do isolamento Yef3 parece diferir entre Pmp1 e FPR1, e é muito mais baixa em comparação com a GFP. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54467/54467fig1.jpg" /> Figura 1. Isolamento específica de RNAs MS2L-marcadas e Identificação de Proteínas Associadas. Os resultados de dois RNAs diferentes que foram submetidos a um rápido (Pmp1 e FPR1) são apresentados. (A) Análise de transferência de Northern de amostras de RNA purificados a partir de uma experiência rápida. ARN foi corrido num gel de agarose e corados com brometo de etídio (painel superior). O gel foi transferido para membrana de nylon e sujeitos a hibridação com as sondas indicadas (painéis inferiores). As amostras analisadas são: lise de células rápida (fenol quente [passo 1.4]), RaLise PID celular (input [passo 1,13]) e após eluição com biotina (eluição [passo 1,24]). (B) mancha de prata de proteínas de Rapid com células MS2-marcados e não marcados. As amostras de proteínas de frações de eluição de Pmp1 MS2-tagged (+ MS2L) ou controlo não marcado (-MS2L) foram executados em SDS-PAGE e corados com prata. Bandas com intensidade diferencial (indicadas por asteriscos) foram cortadas do gel e determinada por análise de espectrometria de massa. A seta indica a proteína de fusão MS2-CP-GFP-PAS, o que demonstra Carga igual de proteína. Pistas irrelevantes foram recortadas para maior clareza. (C) análise de Western de controlos positivos. foi realizada por Western blot com anticorpos que reconhecem a porção Yef3 GFP ou da proteína de fusão MS2-CP. Pistas irrelevantes foram recortadas para maior clareza. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54467/54467fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K visualizações.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

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Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Genética

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA  In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Espectrometria de massa-baseado Proteomics análises usando banco de dados OpenProt para desvendar novas proteínas traduzidas de Frames de leitura abertos não-canônicos

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...