Protein in vivo'ya bağlanmanın, RNA'nın karmaşık doğası ve proteinlerle etkileşimini etkileyen birçok faktör nedeniyle önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. RNA bağlayıcı protein veya RBP-RNA afinite canlı bakteri hücrelerinin içinde ölçülür. Hücresel ortam hem RNA yapısını hem de ortaya çıkan RBP-RNA bağlanmasını etkilediği için, vivo'daki yakınlığın ölçülmesi doğal sistemlerdeki bu etkileşimleri anlamak için çok önemlidir.
Başarının sırrı plazmidlerin tasarımındadır. Tasarım delta birkaç dalgalar kullanmalı ve stop kodon ve frameshift mutasyonlar ekleme önlemek. Bağlama site kaseti tasarlayarak bu protokolü başlatın.
Her mini gen bir EagI kısıtlama sitesi, kanamisin direnç geninin beş asal ucundan 40 baz, pLac/Ara promotörü, ribozom bağlayıcı bölge, mCherry geninin AUG'u, bir spacer, RBP bağlama alanı, mCherry geninin beş asal ucundan 80 baz ve ApaLI kısıtlama alanı içerir. Talın başarı oranını artırmak için, her bağlayıcı site için en az bir, iki ve üç tabandan oluşan boşluklarla üç bağlayıcı site kaseti tasarlayın. Sindirmeksütun arıtma yapmadan önce EagI HF ve ApaLI ile hem mini genleri hem de hedef vektörü çift sindirin.
Sindirilmiş mini genleri, mCherry muhabiri geninin geri kalanını, terminatörve kanamisin direnç genini içeren bağlayıcı bölge omurgasına indirin. Sonra Escherichia coli top 10 hücreleri içine ligasyon çözeltisi dönüştürmek. Sanger sıralama yoluyla pozitif transformantlar belirledikten sonra, eksi 20 santigrat derece 96 kuyu formatında saflaştırılmış plazmidler saklayın.
Ayrıca eksi 80 santigrat derece 96 iyi formatında gliserol stokları olarak bakteriyel suşları saklayın. Özel sipariş uçlarında kısıtlama siteleri ile çift telli DNA mini gen olarak bir stop kodonu yoksun gerekli RBP dizisi. Hazırlanan plazmidleri zaten rbp mCerulean plazmid içeren kimyasal olarak yetkin bakteri hücrelerine dönüştürün.
Zaman kazanmak için, ilgili antibiyotikler ile Luria-Bertani agar içeren sekiz şeritli plakalar üzerinde sekiz kanal pipet kullanarak hücreleri plaka. Koloniler 16 saat içinde 37 derecede ortaya çıkacak. Her çift transformant için tek bir koloni seçin ve uygun antibiyotikler ile LB 1,5 mililitre içeren 48 kuyu plakaları aktarın.
250 RPM sallayarak 37 derece santigrat 18 saatlik bir süre içinde hücreleri büyütün. 96 kuyu plakaları eksi 80 derece santigrat gliserol stokları olarak geceleme saklayın. Sabah, 96 kuyu plakaları yarı gözenek orta veya SPM 180 mikrolitre ısınmak için robot program.
Robotu indükleyici plakasını hazırlamak için programlayın. Temiz bir 96 kuyu plaka,% 95 BA ve% 5 LB oluşan SPM ile kuyu hazırlamak. Kuyu sayısı istenilen sayıda indükleyici konsantrasyonuna karşılık gelir.
En yüksek indükleyici konsantrasyonu içerecek indükleyici plakadaki kuyulara C4-HSL ekleyin. Daha sonra, robotu en yüksek konsantrasyondaki kuyuların her birinden sıfırdan 218 nanomolar'a kadar 23 daha düşük konsantrasyona kadar ortayı seri olarak seyreltecek şekilde programla. Her indükleyici seyreltme hacmi tüm suşları için yeterli olmalıdır.
Bir gecede suşları seyreltmek için, robotu 48 kuyu plakasında 180 mikrolitre SPM ile 20 mikrolitre bakteriyi karıştırarak 10 kat daha seyreltmeye programla. Daha sonra seyreltilmiş çözeltiden 20 mikrolitre yi alarak floresan ölçüme uygun önceden hazırlanmış gerilme plakasına 10 kat daha seyreltin. Şimdi son konsantrasyonlarına göre seyreltilmiş suşları ile 96 kuyu plakaları indükleyici plaka seyreltilmiş indükleyici eklemek için robot programlayın.
96 kuyu plakasını 37 derecede altı saat boyunca sallayın. Bu süre zarfında, her 30 dakikada bir plaka okuyucu aracılığıyla 595 nanometrede optik yoğunluk veya OD ölçümleri, mCherry ve mCerulean floresan ölçümleri alın. Normalleştirme amacıyla, hiçbir hücre eklenmeden SPM'nin büyümesini ölçün.
Burada gösterilen olumlu bir gerginlik için üç boyutlu çizimler vardır. Arsalar zaman ve indükleyici konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak ham OD düzeyleri, mCerulean floresan ve mCherry floresan tasvir. mCerulean steady-state ekspresyon düzeyleri hem pozitif hem de negatif suşlar için her indükleyici konsantrasyon için hesaplandı.
MCherry üretim oranı da pozitif ve negatif suşları için her indükleyici konsantrasyonu için hesaplandı. mCherry üretim oranı ortalama mCerulean floresan bir fonksiyonu olarak iki suşlar için iki biyolojik kopyaları üzerinde ortalama olarak çizilmiştir. Uygun formülü kullanan uygun KRBP, belirli bir bağlayıcı yanıt gösteren pozitif gerinim için gösterilir.
Negatif gerinim için KRBP değeri ayıklandı. Normalleştirilmiş doz yanıt eğrileri, farklı yerlerde 10 bağlama alanı olarak iki RTÜk'e dayalı 30 farklı suş için belirlendi. Üç tür yanıt gözlenir, yüksek yakınlık, düşük yakınlık, ve hiçbir yakınlık.
Burada gösterilen iki RPP, MS2 kat protein ve PP7 kat protein 10 farklı bağlayıcı site kasetleri ile kantitatif KRBP sonuçlarıdır. Dört farklı yerde mutant bağlama yeri olan MS2 kat proteini için doz yanıt eğrileri, mutant aralığının mCherry üretimi üzerindeki etkisini göstermek için burada gösterilmiştir. Test edilmiş mutasyona uğramış bağlama sitesinin sırası gösterilir.
Protein-RNA kompleksinin yapısını kimyasal olarak araştırmak ve hangi mRNA bölgelerinin RNA bağlanmasından etkilendiğini görselleştirmek için şekil araması gibi yapısal bir teknik kullanmak önemlidir. Son zamanlarda, aynı anda 10,000 bağlama sitelerine KP'lerin yakınlık ölçmek için yüksek bir iş verme şekilde bu tekniği kullanılır.
