NKS is supported by NIH award K08 AI108690.

وأجريت جميع الدراسات تحت المراجعة الدقيقة والمبادئ التوجيهية وفقا للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في كلية الطب بجامعة هارفارد، والذي يلبي المعايير البيطرية التي وضعتها الجمعية الأمريكية لمختبر علم الحيوان (AALAS). 1. أفقي انتقال البكتيريا عبر شركة الإسكان (اختياري) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من التلوث الخارجية (خاصة إذا باستخدام الفئران معروف المعايشات)، وممارسة تقنية العقيم في حين تجميع أقفاص القابل للتصرف العقيمة، وذلك باستخدام المواد الغذائية والمياه التي على حد سواء تم تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اللكمات الأذن أو علامات للاحتفال بشكل فردي 6 أسابيع من العمر C57BL / 6 الفئران التي تأوي microbiotas مختلفة وإيوائهم في نفس القفص. وبالنظر إلى أن الفئران هي اكل البراز وتأكل الكريات البرازية من الطابق القفص، ومن الطبيعي أن تنتقل الميكروبات أفقيا بين الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران منزل المشارك ل≥1 الأسبوع لإتاحة الوقت لنقل الجراثيم والتغيير المناعية قبل التحليل. </li></رأ&gt; 2. إعداد تعليق خلية واحدة من طبقة داخل الظهاري الصغيرة المعوية والصفيحة المخصوصة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام استخراج (في الأمعاء الدقيقة): 30 مل RPMI + 93 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) dithiothreitol (DTT) + 60 ميكرولتر 0.5 M EDTA + 500 ميكرولتر الجنين مصل بقري (FBS). إضافة DTT مباشرة قبل الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام الهضم (في الأمعاء الدقيقة): 25 مل RPMI + 12.5 ملغ dispase + 37.5 ملغ كولاجيناز الثاني + 300 ميكرولتر FBS. إضافة dispase وكولاجيناز مباشرة قبل الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجميع حضانات أجريت في 37 درجة مئوية، والحلول prewarm إلى 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجانب الظهري الماوس إلى أسفل ورش البطن مع الايثانول 70٪. استخدام المقص لإجراء عملية فتح البطن عن طريق خفض بالتتابع الجلد واللفافة ثم البريتوني على طول خط الوسط بطني جيئة وذهابام والارتفاق العانة لعملية الخنجري، مما يعرض التجويف البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المقص لفصل الأمعاء الدقيقة من المعدة عن طريق transecting العضلة العاصرة البوابية. إزالة بلطف الأمعاء الدقيقة من الصفاق، إغاظة بعيدا الدهون المساريقي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة تماما الأمعاء الدقيقة، وجعل قطع الثاني عند تقاطع اللفائفي الأعور. ضع الأمعاء الدقيقة المعزولة في البرد (أي، 4 ° C) RPMI تحتوي على 10٪ FBS لتعظيم بقاء الخلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف قطع كبيرة من الدهون باستخدام ملقط المنحنية. توخي الحذر لتجنب تمزق الأنسجة المعوية نفسها أثناء محاولة إزالة الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة محتويات الأمعاء، والأمعاء تدفق بلطف مع 15-20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة باستخدام إبرة التغذية 18 G الملصقة على حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص لاستئصال ذكر المكتب الصحفى، ووضعها في RPMI الباردة تحتوي على 5٪ FBS. وتقع ذكر المكتب الصحفى على الجانب مقابل المساريق للأمعاء الدقيقة وتبدو وكأنها متعددة مفصص الأبيضكتلة. اعتمادا على سلالة معينة، والفأر لديه عادة 8-12 ذكر المكتب الصحفى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأمعاء الدقيقة 3-4 شرائح بوصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدهون المتبقية من قبل المتداول كل جزء صغير الأمعاء على منشفة ورقية مبللة مع RPMI، باستخدام مشرط مملة لندف الدهون بعيدا عن الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الأنسجة داخل من قبل cannulating قطاعات المعوية مع ملقط المنحنية واستيعاب نهاية البعيدة للأنسجة. ثم استخدام زوج من ملقط على التوالي لإزالة بلطف قطاع النسيج من ملقط المنحنية (ابتداء من نهاية الداني)، مما أدى إلى الأنسجة التي مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شرائح الأنسجة في كوب تحتوي على 30 مل من وسائل الاعلام استخراج وبقضيب. تأمين غطاء على الكأس، ويقلب في 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وينبغي أن يكون التحريك قوي ولكن ليس المضطرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، واستخدام مصفاة الصلب لفصل قطعة نسيج من طاف التي تحتوي على ظهارة، والتي يجب أن تظهر غائم. هذا طاف يحتوي طالخلايا الليمفاوية ntraepithelial التي يمكن تحليلها، إذا رغبت في ذلك، من خلال الشروع في تصفية عينة في الخطوات 2،18-2،23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم يدويا قطعة نسيج في RPMI ليغسل وسائل الاعلام استخراج المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع النسيج على منشفة ورقية جافة والوجه أن تنتهي خلال نهاية عدة مرات لتسهيل إزالة المخاط المتبقية التي لم تتحرر من قبل متوسطة الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شظايا الأنسجة في أنبوب 1.5 مل مع 600 ميكرولتر من المتوسطة الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المقص لتخطر على الأنسجة حتى قطع لم يعد التمسك مقص والحل يبدو متجانسا. هذه الخطوة مهمة لضمان الهضم الأنزيمي كاملة من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأمعاء الدقيقة المفروم إلى كوب تحتوي على 25 مل من وسائل الاعلام الهضم. إثارة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في منتصف الطريق من خلال عملية الهضم (أي، في 15 دقيقة)، الماصة صعودا ونزولا مع الماصة المصلية للمساعدة في تفريق أي أجزاء كبيرة من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح النسيج هضمها (أو epithطبقة elial من الخطوة 2.12 إذا IELs التجهيز) من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. شطف مصفاة مع 20 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الحل تصفيتها في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية صب طاف و resuspend بيليه في 1 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح معلق الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل. شطف مصفاة مع 20 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي تصفية حل في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية صب طاف، وبيليه resuspend في 1 مل من RPMI تحتوي على 2٪ FBS. </li></ol> 3. إعداد تعليق خلية واحدة من بقع باير ل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل يستأصل ذكر المكتب الصحفى للكوب مع 25 مل من وسائل الاعلام الهضم وبقضيب. غطاء آمن، وتدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضمها مرشح ذكر المكتب الصحفى من خلال مصفاة 40 ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل. إن وجدت ريما كتلفي، الضغط عليها من خلال مصفاة باستخدام نهاية شقة من المكبس من حقنة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مصفاة مع 10 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي تصفية حل في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية صب طاف، وبيليه resuspend في 1 مل من RPMI تحتوي على 2٪ FBS. </li></ol> 4. تلطيخ السطح لالتدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة حجم مناسب من الخلايا (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر من LPLs) في لوحة ذهابا والقاع 96-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 90 ميكرولتر من RPMI تحتوي على 2٪ FBS والتخفيف 1: 100 CD16 المضادة لل/ 32 (كتلة بورتو). احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. طاف صب من قبلقلب اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) خلايا وصمة عار مع صبغة الجدوى، إذا رغبت في ذلك، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر 1٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا. احتضان لمدة 1 ساعة في الظلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. </li></ol>

<ol>
	<li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+regulation+of+food+intake.">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease.">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li><li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases.">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li><li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+bacteria+(normal+microflora),+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes.">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut.">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides:+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA.">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li><li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system.">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li><li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia.">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li><li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease.">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li><li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells.">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota.">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li><li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice.">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa.">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

نقدم بروتوكول لعزل وتوصيف تدفق cytometric من الخلايا الليمفاوية الصغيرة الأمعاء، بما في ذلك LPLs، IELs، والخلايا الليمفاوية في ذكر المكتب الصحفى. للراغبين في تقييم كيف يمكن للتغييرات في الجراثيم التي تؤثر على نظام المناعة الصغيرة الأمعاء، ونحن بالتفصيل الخطوات واضحة المشاركة في نقل الأفقي للكائنات الحية بين الفئران إيواء microbiotas مختلفة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على الأمعاء الدقيقة، والإجراء هو نفسه لتحليل الأمعاء الغليظة، مع الفارق الوحيد هو أنه لا توجد ذكر المكتب الصحفى لإزالة (على الرغم من بقع القولون موجودة، وهذه عادة ما تكون غير مرئية بشكل فاضح). هناك العديد من الخطوات الرئيسية في تحقيق العزلة المثلى من الخلايا الليمفاوية من الأنسجة الصغيرة المعوية. إزالة الدقيق من الأنسجة الدهنية هي في غاية الأهمية لضمان بقاء الخلايا اللمفاوية والعائد الأمثل. بالإضافة إلى ذلك، DTT هو حال للبلغم حاسما المستخدمة في استخراجمن الخلايا الظهارية. نظرا لطبيعتها غير مستقرة، نقترح تخزين قسامات تستخدم مرة واحدة من محلول 5٪ في ≤ 20 درجة مئوية، وعدم إعادة تجميد أي حجم غير المستخدمة. على الرغم من أن يستخدم EDTA في المتوسط ​​استخراج للمساعدة في إزالة الخلايا الظهارية 15، وجودها - وكذلك الزائد FBS أو مخاط - أثناء عملية الهضم يمكن أن تمنع كولاجيناز. وقد تجلى تركيز كولاجيناز تستخدم لتؤثر بشكل مختلف التعبير سطح علامة و13،16،17 بقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، اعتمادا على علامة السطح من الفائدة، قد يكون من أن صيغة مختلفة من كولاجيناز (على سبيل المثال، نوع كولاجيناز الأول والثاني والسادس، والثامن) هو الأمثل 13،17. قد تكون هناك حاجة بعض التحسين المجرب اعتمادا على مسألة تجريبية محددة، ونظرا لاختلاف الكثير إلى الكثير، والكثير محددة ومستوى النشاط النسبي للكولاجيناز. وعلاوة على ذلك، قد تكون هناك حاجة الأمثل إضافية اعتمادا على specifجيم سلالة وعمر الفأر استخدامها. على سبيل المثال، وقد تم تحسين الأوقات المذكورة هنا ل~ 6 أسابيع من العمر C57BL / 6 الماوس؛ ل~ 8 أسابيع من العمر الماوس بستر السويسرية، ويمكن زيادة الوقت الهضم إلى 40 دقيقة. باختصار، لقد قدمنا ​​بروتوكول مفصلة لعزل الخلايا الليمفاوية الصغيرة الأمعاء من الصفيحة المخصوصة، طبقة داخل الظهاري، وذكر المكتب الصحفى. مرة واحدة يتقن، يمكن للمرء أن معالجة معقول 4 الفئران وديك تعليق خلية واحدة جاهزة للتلوين في ~ 4 ساعات. على الرغم من أننا وصف تلطيخ الفوري لهذه الخلايا لتوصيف تدفق cytometric، يمكن للمرء أن تحفز بدلا من هذه الخلايا لتقييم إنتاج السيتوكينات، فرز الخلايا للالنسخي و / أو التحليلات البروتين، أو ثقافة الخلايا لننظر في المختبر التفاعل مع أنواع أخرى من الخلايا. وعلاوة على ذلك، في حين ركزنا على السكان لمفاوية، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لفحص خلايا الدم النخاعي. أخذت معا، وهذا نهج مبسط لعزل م واحدالسكان ليرة لبنانية من مختلف الأجزاء المعوية يسمح احد لاستجواب كلا كيف عوامل مختلفة (على سبيل المثال، الجراثيم، المستضدات الغذائية) تؤثر على تطور الجنين من الجهاز المناعي في الأمعاء وأيضا كيف يمكن أن تكون هذه الخلايا ذات الصلة في أمراض خارج الأمعاء.

وغالبا ما تعتبر المهمة الرئيسية من الأمعاء الدقيقة لتكون عملية الهضم وامتصاص المواد الغذائية 1. في حين أن هذا ظيفة التمثيل الغذائي أمر ضروري بشكل واضح، والأمعاء الدقيقة لديه دورا هاما على قدم المساواة في حماية المضيف من وابل متواصل من المضادات البيئية الموجودة داخل التجويف 2. الأمعاء يفصل بين العالم الخارجي (على سبيل المثال، المضادات اللمعية) من البيئة الداخلية للمضيف مع طبقة الظهارية التي ليست سوى طبقة خلية واحدة سميكة. على هذا النحو، والجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء لديه مهمة هائلة من موازنة عتبته للتفاعل، مما يسمح المستضدات الأجنبية من النظام الغذائي والمتعايشة الميكروبات لدخول الغشاء المخاطي مع الحد الأدنى، إن وجدت، استجابة مناعية بينما تصاعد ردا قويا ضد غزو الجراثيم و غيرها من مستضدات &quot;الضارة&quot;. الاستجابات المناعية المفرطة أو غير لائقة لهذه المستضدات يمكن أن يؤدي إلى مرض مرضية (على سبيل المثال، inflammaمرض المحافظين الأمعاء، نوع الأول من مرض السكري، والتصلب المتعدد) ويجب تجنب 3-6. وبشكل عام، يعتقد أن الجهاز الهضمي لتمثيل أكبر جهاز المناعة في الجسم، وتحتوي على أكثر من 70٪ من جميع الخلايا المفرزة للأجسام المضادة 7. ويتكون الجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء من 3 المقصورات الرئيسية - الصفيحة المخصوصة (LP)، وطبقة داخل الظهاري، وبقع باير ل(PPS) - أن كل يحتوي على مجموعة مميزة من الخلايا الليمفاوية 2. الخلايا اللمفية ليرة لبنانية (LPLs) هي في المقام الأول خلايا TCRαβ + T مع ~ الخلايا البائية 20٪. الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري (IELs) تحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا البائية مع المزيد من الخلايا TCRγδ + T من الخلايا TCRαβ + T. وذكر المكتب الصحفى، وهما جهازان اللمفاوية الثانوية جزءا لا يتجزأ من جدار الأمعاء الصغيرة، تحتوي على حوالي 80٪ الخلايا البائية. على الرغم من أن كل من هذه المناطق التشريحية وظائف متميزة قليلا والقواعد وجودي، أنها تعمل في آهالأزياء armonized لحماية المضيف من الشتائم المسببة للأمراض. وعلاوة على ذلك، هناك إدراك متزايد بأن الجراثيم عامل حاسم لتطوير نظام المناعة في الأمعاء، مع زيادة الاعتراف علاقة المشابهة بين الميكروبات محددة وتطور الجنين معينة الأنساب الخلية 8،9. وعلاوة على ذلك، بالنظر إلى أن التعليم من نظام المناعة في الأمعاء يؤثر على الاستجابات المناعية في مواقع بعيدة تشريحيا (على سبيل المثال، التهاب المفاصل، والتصلب المتعدد، والتهاب رئوي)، أصبح من الواضح أن تطوير نظام المناعة المعوية هي ذات الصلة لمزيد من عمليات المرض مما هو معروف في السابق 10 -12. على هذا النحو، وقد امتد الاهتمام تقييم كمي لجهاز المناعة المعوية وراء التفاعلات المضيف الممرض لتشمل الآن التفاعلات المضيف المتعايشة والتسبب في العديد من الأمراض الجهازية كذلك. ونظرا لتنوع الأساليب المتبعة حاليا فيعزل الخلايا الليمفاوية المعوية، وهو الأسلوب الذي هو الأمثل لالعائد، والسلامة، والاتساق حين تحقيق التوازن بين الوقت المطلوب أمر بالغ الأهمية على نحو متزايد. البروتوكولات التي تنطوي على التدرجات Percoll هي الوقت والعمل المكثف ويحتمل أن تكون أكثر عرضة للخطأ البشري، مما أدى إلى العائد المتغير وقدرتها على البقاء 13. هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية من جميع المقصورات المناعة الصغيرة المعوية 3. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لتزايد الاهتمام في التعديلات التي يسببها ميكروب في الجهاز المناعي المخاطي، ندرج الخطوات التي يمكن أن تستخدم للسماح لنقل أفقي من الكائنات الحية الدقيقة بين الفئران لتقييم مدى تؤثر هذه التغييرات على الكمية جهاز المناعة المعوية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>555092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile mouse cage</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>MS2-AD</td>
			<td>contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal feeder</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>M-FEED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bottle</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>M-WB-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>card holder</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>CRD-HLD-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclavable rodent chow (NIH-31M)</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>4131207530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GemBio</td>
			<td>100-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type II&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>feeding needle (18 G, 2&#34; length)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>FN-7905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (15 blade)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-purpose cups, 120 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-position stir plate, 9-position</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel conical strainer, 3 inch&#160;</td>
			<td>RSVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate, round-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32 (Fc block)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(optional) fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin, neutral buffered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric characterization of murine small intestinal lymphocytes

الأمعاء - والتي تحتوي على أكبر عدد من الخلايا المناعية من أي جهاز في الجسم - تتعرض باستمرار لمستضدات أجنبية، سواء الميكروبية والغذائية. نظرا فهم متزايد بأن هذه المضادات اللمعية تساعد في تشكيل استجابة مناعية وأن التعليم من الخلايا المناعية داخل الأمعاء أمر بالغ الأهمية لعدد من الأمراض الجهازية، هناك اهتمام متزايد في وصف نظام المناعة في الأمعاء. ومع ذلك، العديد من البروتوكولات المنشورة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. نقدم هنا بروتوكول مبسط لعزل الخلايا الليمفاوية من المخصوصة صغيرة في الأمعاء الصفيحة، طبقة داخل الظهاري، وبقع باير، على أن يكون سريع ومفيد، ولا يتطلب التدرجات Percoll شاقة. على الرغم من أن البروتوكول يركز على الأمعاء الدقيقة، بل هو أيضا مناسبة لتحليل القولون. وعلاوة على ذلك، فإننا نسلط الضوء على بعض الجوانب التي قد تحتاج إلى التحسين إضافية تبعا لسؤال كان علمي محددنشوئها. وقد أدى هذا النهج في عزل أعداد كبيرة من الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتحليل تدفق cytometric أو وسائل بديلة لالتوصيف.

تحليل تدفق cytometric من تعليق خلية واحدة من الخلايا الليمفاوية الصغيرة الأمعاء يجب أن تسفر عن السكان منفصلة من الخلايا التي لها خصائص مماثلة إلى الأمام والجانب مبعثر كما splenocytes (الشكلان 1A و 1B). قد تبدأ الخلايا الليمفاوية للموت إذا لم يتم الحفاظ على الأنسجة عند 4 درجات مئوية خلال المراحل الأولى من العزلة، مما أدى إلى السكان لمفاوية وجود مبعثر إلى الأمام أقل ويكون أكثر صعوبة في فصل من الخلايا الظهارية والميتة الأخرى (الشكل 1C) . وعلاوة على ذلك، إذا لم يتم تنظيف الأنسجة الصغيرة الأمعاء تماما من الدهون المساريقي لها، تكاد تكون هناك خسارة كاملة من الخلايا الليمفاوية (1D الشكل). توضح هذه الميزات كيف تعمل بسرعة (أي، وعدم السماح الأنسجة في عملية الاحماء) والاهتمام بالتفاصيل (أي، وإزالة حتى كميات صغيرة من الدهون المساريقي) هو ضروري لضمان جودة العينة. TypicaLLY، نحصل ~ بقاء 80٪ للLPLs الصغيرة المعوية (الشكل 1E). يوضح الشكل 2A كيفية تكوين الجراثيم يمكن أن تؤثر بشكل كبير على أعداد السكان خلية معينة. كما أننا أثبتنا سابقا، (GF) الفئران خالية من الجراثيم، التي تخلو تماما من أي الكائنات الحية الدقيقة، لديها نظام المناعة الصغيرة المعوية التي هي غير ناضجة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع (SPF) الفئران محددة خالية من مسببات الأمراض، والاستعمار من الفئران GF مع العادية الجراثيم الماوس (MMB) النتائج في استعادة النظام المناعي صغيرة في الأمعاء 14. في المقابل، الفئران معروف المعايشات إيواء الميكروبات البشرية العادية (HMB) - والتي لديها عدد وتنوع البكتيريا البرازية، الفئران MMB مماثل - لديها نظام المناعة الصغيرة المعوية التي لا يمكن تمييزها عن تلك التي GF الفئران 14. الاستفادة منطبيعة اكل البراز من الفئران، الفئران زملاء السكن يمثل معا، طريقة بسيطة لكنها قوية للسماح نقل الأفقي للكائنات الحية بين الفئران. هذا النهج يسمح احد لاختبار ما إذا كان التغير الناتج في الجراثيم يؤثر على الجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء. وكمثال على ذلك، أثبتنا أن الفئران HMB زملاء السكن مع الفئران MMB لمدة 4 أسابيع أدى إلى تطبيع عدد الخلايا CD3 + CD8 + T في SI ليرة لبنانية (الشكل 2B) 14. هذه النتيجة تؤكد أن الخلافات بين MMB وHMB الفئران التي لوحظت في الشكل 2A ومن المقرر أن الاختلافات في الجراثيم بين هذه الفئران - الاختلافات التي يتم التغلب عليها من قبل زملاء السكن الفئران معا. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig1.jpg" /> الشكل 1. المعوية الخلايا اللمفاوية يكون FSC والتعاون بين بلدان الجنوب خصائص مشابهة لSplenocytes أ - دال Dقطع بعد التمديد تصور SSC وFSC لsplenocytes أعد أمثل (A) والصغيرة الأمعاء الصفيحة المخصوصة (SI ليرة لبنانية) خلايا (B - D). تم إعداد نموذج B. الاشتراكية ليرة لبنانية وفقا لبروتوكول صفها. وسمح جيم الأنسجة المعوية عمدا لتدفئة لإثبات أن الخلايا SI ليرة لبنانية تبدأ في الحصول على FSC أقل. D. لم يكن تنظيف الدهون المساريقي من الأمعاء الدقيقة قبل إعداد الخلايا واحد، مما أدى إلى فقدان ملحوظ SI ليرة لبنانية السكان لمفاوية. E. كانت ملطخة نموذج يصور في لوحة B في الخطوة 4.7 مع صبغة الجدوى قابل للتثبيت (على سبيل المثال، eFluor 780) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54114/54114fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig2.jpg" /> الشكل 2. الجراثيم الآثار النضج للintest الصغيرةإينال الجهاز المناعي. أ. وعددت خلايا CD3 + CD8 + T في SI ليرة لبنانية من SPF، MMB، HMB، والفئران GF. وكانت الفئران ب HMB شارك في مقرها مع الفئران MMB لمدة 4 أسابيع قبل تعداد خلايا CD3 + CD8 + T في SI ليرة لبنانية. وقد تم تحليل MMB وHMB الفئران التي لم تشارك في إيواء للمقارنة. تمثل كل نقطة بيانات الماوس الفردية، وقضبان أفقية تعكس المتوسط. م، لم تكن كبيرة. *، ف &lt;0.05. **، ف &lt;0.01. ***، ف &lt;0.001. وترد مع الأرقام إذن، من إشارة 14، مع تعديل طفيف من B. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54114/54114fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes at JoVE.com

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.3K Views.  Boston Children’s Hospital. There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization. 

Video: Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...