NKS is supported by NIH award K08 AI108690.

Tutti gli studi sono stati condotti in esame rigoroso e linee guida secondo il Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la Harvard Medical School, che risponde alle norme veterinarie stabilite dalla American Association for Laboratory Animal Science (AALAS). 1. orizzontale trasmissione di batteri attraverso Co-housing (opzionale) <ol><li> Per ridurre al minimo la contaminazione esogena (in particolare se si utilizza topi gnotobiotic), praticare la tecnica asettica, mentre l&#39;assemblaggio gabbie sterili monouso, con cibo e acqua che sono stati entrambi in autoclave. </li><li> Utilizzare i punzoni auricolari o tag per contrassegnare individualmente 6 settimane di età C57BL / 6 topi che porto diverse microbiotas e li ospitano nella stessa gabbia. Dato che i topi sono coprofagiche e mangiare pellet fecali dal pavimento della gabbia, i microbi saranno naturalmente trasmesse orizzontalmente tra i topi. </li><li> topi Co-house per ≥1 settimana per dare il tempo per il trasferimento microbica e di cambiamento immunologico prima dell&#39;analisi. </li></ol&gt; 2. Preparazione di una cella singola sospensione dallo strato intraepiteliale piccola intestinale e lamina propria <ol><li> Preparazione delle soluzioni <ol><li> Preparare mezzi di estrazione (per tenue): 30 ml RPMI + 93 microlitri 5% (w / v) ditiotreitolo (DTT) + 60 ml di 0,5 M EDTA + 500 microlitri di siero fetale bovino (FBS). Aggiungere il DTT immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare supporti digestione (per intestino tenue): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispasi + 37,5 mg di collagenasi II + 300 microlitri FBS. Aggiungere il dispasi e collagenasi immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Per tutte le incubazioni eseguite a 37 ° C, le soluzioni Preriscaldate a 37 ° C. </li></ol></li><li> Eutanasia il mouse da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Posizionare il lato del mouse dorsale verso il basso e spruzzare l&#39;addome con il 70% di etanolo. Utilizzare le forbici per eseguire una laparotomia dalla sequenza tagliare la pelle e la fascia poi peritoneale lungo la linea mediana ventrale from sinfisi pubica al processo xifoideo, esponendo così la cavità peritoneale. </li><li> Usare le forbici per separare il piccolo intestino dallo stomaco da sezionare lo sfintere piloro. Rimuovere delicatamente l&#39;intestino tenue dal peritoneo, prendere in giro il grasso mesenterico. <ol><li> Per rimuovere completamente l&#39;intestino tenue, effettuare un secondo taglio alla giunzione ileo-cecale. Posizionare il piccolo intestino isolato in fredda (es., 4 ° C) RPMI contenente 10% FBS per massimizzare la vitalità cellulare. </li></ol></li><li> Rimuovere delicatamente grandi pezzi di grasso con pinze curve. Usare cautela per evitare di strappare il tessuto intestinale in sé durante il tentativo di rimuovere il grasso. </li><li> Per rimuovere contenuto intestinale, intestino delicatamente a filo con 15 - 20 ml di PBS freddo utilizzando un ago di alimentazione 18 G apposto una siringa. </li><li> Usare le forbici per recidere PP, e metterli in RPMI freddo contenente il 5% di FBS. PP si trovano sul lato antimesenterico dell&#39;intestino tenue e appare come un bianco multi-lobulatimassa. A seconda del ceppo specifico, un mouse ha tipicamente 8 - 12 PP. </li><li> Tagliare il piccolo intestino in 3 - 4 segmenti pollici. </li><li> Rimuovere il grasso residuo da dolci ogni piccolo-intestinale segmento su un tovagliolo di carta inumidito con RPMI, utilizzando un bisturi noioso per prendere in giro il grasso dal tessuto. </li><li> Ruotare il tessuto all&#39;interno da cannulating segmenti intestinali con pinze curve e afferrando l&#39;estremità distale del tessuto. Quindi utilizzare un paio di pinze diritte per rimuovere delicatamente il segmento di tessuto dalle pinze curve (a partire dalla fine prossimale), con conseguente tessuto che viene invertita. </li><li> Posizionare i segmenti di tessuto in una tazza contenente 30 ml di mezzi di estrazione e un ancoretta. Fissare il coperchio sulla tazza, e mescolare a 500 rpm per 15 min a 37 ° C; agitazione dovrebbe essere vigoroso, ma non turbolenta. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, utilizzare un filtro in acciaio per separare pezzi di tessuto dal surnatante dell&#39;epitelio contenente, che dovrebbe apparire torbida. Questo surnatante contiene ilinfociti ntraepithelial che può essere ulteriormente analizzati, se desiderato, procedendo a filtrare il campione in passi 2.18 - 2.23. </li><li> Agitare manualmente i pezzi di tessuto in RPMI per lavare via i media di estrazione residui. </li><li> Posizionare il tessuto su un tovagliolo di carta asciutto e capovolgere su se stesso più volte per facilitare la rimozione del muco residui che non è stato liberato dal mezzo di estrazione. </li><li> Posizionare frammenti di tessuto in una provetta da 1,5 ml con 600 ml di mezzo di digestione. </li><li> Usare le forbici per tritare il tessuto fino a pezzi aderiscono più alle forbici e la soluzione appare omogenea. Questo passaggio è fondamentale per garantire la completa digestione enzimatica del tessuto. </li><li> Aggiungere tenue macinata ad una tazza contenente 25 ml di mezzi di digestione. Mescolare a 500 rpm per 30 min a 37 ° C. A metà della digestione (cioè., A 15 min), pipettare su e giù con una pipetta sierologica per contribuire a spezzare eventuali grossi pezzi di tessuto. </li><li> Filtro tessuto digerito (o epithstrato Elial dal punto 2.12 se IELS di elaborazione) attraverso un colino cella di 100 micron in un tubo da 50 ml. Risciacquare il filtro con 20 ml di RPMI contenente 10% FBS. </li><li> Centrifugare la soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> decantare con cautela il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente 10% FBS. </li><li> Filtro risospeso cellule attraverso un filtro 40 micron cellule in una provetta da 50 ml. Lavare il filtro con 20 ml di RPMI contenente 10% FBS. </li><li> Centrifugare soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> decantare con attenzione il surnatante, e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente il 2% FBS. </li></ol> 3. Preparazione di una cella sospensione singola da placche di Peyer <ol><li> Trasferimento asportato PP ad una tazza con 25 ml di mezzi di digestione e di un ancoretta. coperchio sicuro, e far girare a 500 giri al minuto per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Filtro digerito PP attraverso un filtro 40 micron cellule in una provetta da 50 ml. Se una qualsiasi grumi remain, premerli attraverso il filtro utilizzando l&#39;estremità piatta del pistone da una siringa da 1 ml. </li><li> Risciacquare il filtro con 10 ml di RPMI contenente 10% FBS. </li><li> Centrifugare soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> decantare con attenzione il surnatante, e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente il 2% FBS. </li></ol> 4. colorazione della superficie per citometria a flusso <ol><li> Aliquota adeguato volume delle cellule (ad es., 200 ml di LPLS) in un piatto fondo rotondo da 96 pozzetti. </li><li> Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra. </li><li> Risospendere le cellule in 90 ml di RPMI contenente il 2% FBS e una diluizione 1: 100 di CD16 anti-/ 32 (blocco FC). Incubare per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra. </li><li> Risospendere le cellule in 250 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. surnatante decantareinvertendo la piastra. </li><li> cellule Stain (opzionale) con colorante vitalità, se lo si desidera, seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Risospendere le cellule in 100 l 1% di formalina per fissare le cellule. Incubare per 1 ora al buio a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 200 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra. </li><li> Risospendere le cellule in 250 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra. </li><li> Risospendere le cellule in 200 l di PBS. Analizzare le cellule utilizzando un citofluorimetro. </li></ol>

<ol>
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A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice.">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa.">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Vi presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento e il flusso caratterizzazione mediante citometria di piccole-intestinale linfociti, tra cui il LPLS, IELS, e linfociti nel PP. Per chi è interessato a valutare come i cambiamenti nel microbiota influenzano la piccola-intestinale sistema immunitario, ci dettaglio i semplici passaggi coinvolti nella trasmissione orizzontale di organismi tra i topi che ospitano diverse microbiotas. Sebbene questo protocollo concentra sul piccolo intestino, la procedura è la stessa per l&#39;analisi dell&#39;intestino crasso, con la sola differenza che non vi PP rimuovere (sebbene patch colon sono presenti, questi non sono in genere grossolanamente visibile). Ci sono diversi passaggi chiave nel raggiungimento di isolamento ottimale dei linfociti dal tessuto del piccolo intestino. rimozione meticolosa del tessuto adiposo è assolutamente fondamentale per garantire la vitalità dei linfociti e la resa ottimale. Inoltre, DTT è un mucolitico cruciale utilizzato nell&#39;estrazionedi cellule epiteliali. Data la sua natura instabile, si consiglia di memorizzare monouso aliquote di una soluzione al 5% a ≤-20 ° C e non ri-congelamento qualsiasi volume inutilizzato. Sebbene EDTA è usato nel mezzo di estrazione per facilitare la rimozione delle cellule epiteliali 15, la sua presenza - nonché eccesso FBS o muco - durante il processo di digestione possono inibire la collagenasi. La concentrazione di collagenasi utilizzato è stato dimostrato di influenzare in modo differenziale espressione marcatore di superficie e vitalità cellulare 13,16,17. Inoltre, a seconda del marcatore di superficie di interesse, è possibile che una formulazione diversa di collagenasi (ad es., Collagenasi di tipo I, II, VI o VIII) è ottimale 13,17. Alcuni ottimizzazione empirica può essere richiesto in base alla specifica domanda sperimentale e, a causa di molti-a-molti variazione, il lotto specifico e relativo livello di attività della collagenasi. Inoltre, l&#39;ottimizzazione aggiuntivo può essere richiesto a seconda della specific ceppo ed età di mouse utilizzato. Ad esempio, i tempi indicati qui sono stati ottimizzati per un ~ 6 settimane di età C57BL / 6 del mouse; per 8 settimane di età topo ~ Swiss Webster, il tempo di digestione può essere aumentato a 40 minuti. In sintesi, abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l&#39;isolamento dei linfociti piccolo-intestinali dalla lamina propria, strato intraepiteliale, e PPS. Una volta masterizzato, si può ragionevolmente elaborare 4 topi e hanno sospensioni di cellule singole pronte per la colorazione in ~ 4 ore. Anche se si descrive la colorazione immediata di queste cellule per la caratterizzazione citometria a flusso, si può in alternativa stimolare queste cellule per valutare la produzione di citochine, ordinare celle per trascrizionale e / o di analisi proteomica, o la cultura le cellule a guardare le interazioni in vitro con altri tipi di cellule. Inoltre, mentre ci siamo concentrati sulla popolazione linfocitaria, questo protocollo può anche essere utilizzato per esaminare le cellule mieloidi. Nel loro insieme, questo approccio semplificato per isolare singola cepopolazioni ll da vari compartimenti intestinali permette di interrogare sia come vari fattori (ad es., microbioti, antigeni dietetici) influenzano l&#39;ontogenesi del sistema immunitario intestinale e anche come queste cellule possono essere rilevanti in malattie extra-intestinali.

Il compito principale del piccolo intestino è spesso considerata la digestione e l&#39;assorbimento dei nutrienti 1. Anche se questa funzione metabolica è chiaramente essenziale, il piccolo intestino ha un ruolo altrettanto significativo nel proteggere l&#39;host dallo sbarramento continuo di antigeni ambientali presenti all&#39;interno del lume 2. Il tratto intestinale separa il mondo esterno (ad es., Antigeni luminali) dall&#39;ambiente interno dell&#39;ospite con uno strato epiteliale che è soltanto un singolo strato di cellule di spessore. Come tale, il piccolo-intestinale sistema immunitario ha il compito arduo di bilanciare la soglia per la reattività, permettendo antigeni estranei dalla dieta e commensali microbi per immettere la mucosa con minima o nulla, la risposta immunitaria nel montare una risposta forte contro patogeni e altri antigeni &quot;nocivi&quot;. Risposte immunitarie eccessive o inappropriate a questi antigeni possono portare a malattie patologiche (ad es., Infiammazionimalattia Tory intestinali, diabete di tipo I, la sclerosi multipla) e deve essere evitato 3-6. Complessivamente, il tratto gastrointestinale è pensato per rappresentare il più grande organo immunitario del corpo, contenente più del 70% di tutte le cellule secernenti anticorpi 7. Il sistema immunitario del piccolo intestino è composto da 3 compartimenti principali - lamina propria (LP), lo strato intraepiteliale e placche di Peyer (PP) - che ogni contiene un particolare gruppo di linfociti 2. I linfociti LP (LPLS) sono principalmente cellule T TCRαβ con ~ cellule del 20% B; linfociti intraepiteliali (IELS) contengono pochissime cellule B con più cellule T TCRγδ di cellule T TCRαβ; e PP, che sono gli organi linfoidi secondari incorporati nel piccolo-intestinale muro, contengono cellule ~ 80% B. Anche se ciascuna di queste regioni anatomiche ha funzioni leggermente diverse e basi ontologiche, funzionano in ahmoda armonized per proteggere l&#39;host da insulti patogeni. Inoltre, vi è una crescente apprezzamento che il microbiota &#39;critico per lo sviluppo del sistema immunitario intestinale, con crescente riconoscimento del rapporto tra cognate microbi specifici e l&#39;ontogenesi di particolari linee cellulari 8,9. Inoltre, dato che l&#39;educazione del sistema immunitario intestinale colpisce risposte immunitarie nei siti anatomicamente distanti (ad es., L&#39;artrite, la sclerosi multipla, la polmonite), è diventato chiaro che lo sviluppo del sistema immunitario intestinale è rilevante per più processi di malattia rispetto al passato riconosciuto 10 -12. Come tale, l&#39;interesse per quantitativamente valutazione del sistema immunitario intestinale si è esteso al di là di interazioni ospite-patogeno per includere ora interazioni ospite-commensale e la patogenesi di molte malattie sistemiche come bene. Data la variabilità dei metodi attuali nellaisolamento dei linfociti intestinali, un metodo che è ottimizzato per la resa, la vitalità e la coerenza bilanciando il tempo richiesto è sempre più critica. I protocolli che coinvolgono gradienti di Percoll sono tempo e lavoro e potenzialmente più inclini a errori umani, che porta a rendimento variabile e la vitalità 13. Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l&#39;isolamento e la caratterizzazione dei linfociti da tutti e 3 i comparti del sistema immunitario del piccolo intestino. Inoltre, data crescente interesse alterazioni microbo indotte nel sistema immunitario mucosale, includiamo passi che possono essere utilizzati per consentire la trasmissione orizzontale di microrganismi tra i topi di valutare come questi cambiamenti influenzano quantitativamente il sistema immunitario intestinale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>555092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile mouse cage</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>MS2-AD</td>
			<td>contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal feeder</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>M-FEED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bottle</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>M-WB-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>card holder</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>CRD-HLD-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclavable rodent chow (NIH-31M)</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>4131207530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GemBio</td>
			<td>100-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type II&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>feeding needle (18 G, 2&#34; length)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>FN-7905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (15 blade)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-purpose cups, 120 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-position stir plate, 9-position</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel conical strainer, 3 inch&#160;</td>
			<td>RSVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate, round-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32 (Fc block)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(optional) fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin, neutral buffered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric characterization of murine small intestinal lymphocytes

L&#39;intestino - che contengono il maggior numero di cellule immunitarie di qualsiasi organo del corpo - sono costantemente esposti ad antigeni estranei, sia microbica e dietetici. Dato una maggiore comprensione che questi antigeni luminali contribuiscono a formare la risposta immunitaria e che l&#39;istruzione di cellule immunitarie all&#39;interno dell&#39;intestino è critica per un certo numero di malattie sistemiche, c&#39;è stato un crescente interesse nel caratterizzare il sistema immunitario intestinale. Tuttavia, molti protocolli pubblicati sono arduo e richiede tempo. Presentiamo qui un protocollo semplificato per l&#39;isolamento dei linfociti dalla propria nell&#39;intestino tenue lamina strato intraepiteliale e placche di Peyer che è rapido, riproducibile e non richiede laboriose gradienti di Percoll. Sebbene il protocollo concentra sul piccolo intestino, è adatto anche per l&#39;analisi del colon. Inoltre, si segnalano alcuni aspetti che possono avere bisogno di ulteriore ottimizzazione a seconda della specifica ques scientificozione. Questo approccio si traduce in l&#39;isolamento di un gran numero di linfociti vitali che possono poi essere utilizzati per analisi di citometria di flusso o sistemi alternativi per la caratterizzazione.

Flusso citometria di sospensioni singola cella di piccole-intestinale linfociti dovrebbe produrre una popolazione discreta di cellule che hanno caratteristiche simili in avanti e scatter laterale come splenociti (Figure 1A e 1B). I linfociti possono cominciare a morire se il tessuto non viene mantenuta a 4 ° C durante le fasi iniziali della isolamento, con conseguente popolazione linfocitaria avente un forward scatter inferiore ed essere più difficile da separare da altre cellule epiteliali e morti (Figura 1C) . Inoltre, se il tessuto del piccolo intestino non è completamente pulito del suo grasso mesenterico, vi è praticamente una completa perdita di linfociti (Figura 1D). Queste caratteristiche illustrano come lavorare rapidamente (es., Non permettendo il tessuto si riscaldi) e prestando attenzione ai dettagli (es., Eliminando anche piccole quantità di grasso mesenterico) è necessario per garantire la qualità del campione. typically, otteniamo ~ 80% la redditività per le piccole-intestinale LPLS (Figura 1E). Figura 2A mostra come la composizione della flora batterica può influire notevolmente il numero di specifiche popolazioni cellulari. Come abbiamo già dimostrato, (GF) topi germ-free, che sono completamente prive di eventuali microrganismi, hanno un piccolo-intestinale sistema immunitario che è decisamente immaturo rispetto a specifiche topi esenti da organismi patogeni (SPF), e la colonizzazione di topi GF con un normale microbiota del mouse (MMB) risultati di recupero dei piccoli-intestinale sistema immunitario 14. Al contrario, i topi gnotobiotic ospitare un microbiota umano normale (HMB) - e che hanno un numero e la diversità dei batteri fecali come topi MMB simile - hanno un piccolo-intestinale sistema immunitario che è indistinguibile da quella dei topi GF 14. Sfruttandola natura coprofagiche dei topi, i topi co-housing rappresenta insieme un metodo semplice ma potente per consentire la trasmissione orizzontale di organismi tra i topi. Questo approccio permette di verificare se il cambiamento conseguente microbiota colpisce il piccolo-intestinale sistema immunitario. Come esempio, abbiamo dimostrato che topi co-housing HMB con topi MMB per 4 settimane portato alla normalizzazione del numero di cellule T CD3 + CD8 + nel SI LP (Figura 2B) 14. Questo risultato conferma che le differenze tra topi MMB e HMB osservati nella Figura 2A è dovuta a variazioni nel microbiota tra questi topi - variazioni che sono superati dalla co-housing topi insieme. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig1.jpg" /> Figura 1. intestinale linfociti hanno FSC e SSC caratteristiche simili splenociti A -. D. Dtrame ot raffiguranti SSC e FSC per splenociti preparati in modo ottimale (A) e le cellule del piccolo intestino lamina propria (SI LP) (B - D). campione B. Il SI LP è stato preparato secondo il protocollo descritto. C. Il tessuto intestinale è stata intenzionalmente lasciata riscaldare a dimostrare che le cellule SI LP iniziano ad avere un FSC inferiore. D. Il grasso mesenterico non veniva fuori tenue prima di preparare singole cellule, con conseguente perdita di una discernibile SI LP popolazione linfocitaria. E. Il campione raffigurato nel pannello B era macchiata al passo 4.7 con la tintura la vitalità risolvibile (ad es., EFluor 780) secondo le istruzioni del produttore. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54114/54114fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig2.jpg" /> Figura 2. Il microbiota impatti maturazione della piccola intestinale sistema immunitario. A. Cellule T CD3 + CD8 sono stati enumerati nella SI LP di SPF, MMB, HMB, e topi GF. Topi B. HMB sono stati co-ospitato con i topi MMB per 4 settimane prima di enumerare le cellule T CD3 + + CD8 nel SI LP. topi MMB e HMB che non sono stati co-ospitati sono stati analizzati per il confronto. Ciascun punto di dati rappresenta un mouse individuale, e le barre orizzontali riflettono la media. NS, non significativo; *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,01; ***, P &lt;0.001. Le figure sono riprodotte-con il permesso-da di riferimento 14, con leggera modifica B. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54114/54114fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.3K Views.  Boston Children’s Hospital. There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization. 

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Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

L&#39;isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...