Yazarlar bir enjeksiyon işaretleyici için dbl-1 cDNA ve Dr Christopher Rongo (Waksman Enstitüsü, Rutgers Üniversitesi, NJ) ve hediye için Dr Rick Padgett (Waksman Enstitüsü, Rutgers Üniversitesi, NJ) teşekkür etmek istiyorum. Dr Barth Grant&#39;ın laboratuvar gfp etiketli dbl-1 inşasının düşük kopya sayısı entegrasyonu için gen tabancası bombardımanı yapıldı. Rene Garcia laboratuar texIs100 oluşturulması sırasında teknik yardım sağladı. Rene Garcia, Robyn Lints ve Hongmin Qin laboratuarlar üretken tavsiye sağladı. Bu çalışma, Moleküler ve Hücresel Tıp TAMHSC Bölümü start-up fonları tarafından finanse edildi. Bileşik kapsamı ve iplik diske konfokal departmanı ve Dekan Tıp Ofisi TAMHSC Koleji tarafından sağlanan fonlar ile satın alındı.

1. Eleme gerginlik inşaat Tarama suşunun dikkatli tasarım ekran başarısı için kritik öneme sahiptir ve başka 3 tarif edilmiştir. Bazı araştırmacılar için, transgen görünür bir ürünü ifade eder bir suşu kullanarak deney için gereklidir. Entegre transgenlerin barındıran birçok suşları CGC veya bireysel araştırmacılar mevcuttur. Bir transgenik suşu ekran için gerekli ama mevcut değildir, o zaman bombardıman 4, UV / TMP 5 veya Mos transpozon ekleme 6 gibi bir yayınlanan yöntemi kullanılarak oluşturulabilir. Ilgi bizim proteini canlandırmak için, (yanlarından dbl-1 dizisi kullanılabilir) olgun cDNA sekansı ile çerçeve gfp-kodlama sekansı eklenir. Bu GFP füzyon proteini kapsamı Anatomi ile görünmez olduğu için, görünür olan bir coinjection belirteç kullanılan ve ilgi bizim protein inceleyen etkilemedi (TTX-3p :: rfp </em&gt;, diğer çeşitli standart damgalı bir inceleme için,) 7 bakınız. Daha sonra ekstrakromozomal diziden entegre transgen yarattı. Biz transgen bu bombardımanı ne (Beifuss ve Gumienny, yayınlanmamış) mikroskop fenotipi kurtarıldı ne de GFP-etiketli ürün görünür düzeyde üretilen düşük kopya sayısı entegre hat vermiştir bulundu. Başlangıçta enjeksiyon 8,9 tarafından üretilen bir ekstrakromozal kopya birden dizisinin UV / TMP entegrasyon transgen ürünün seviyeleri (Şekil 3A) kurtarmak, görünür elde edilmiştir. Anti-GFP antikoru ile Western Blot transgen (allel adı texIs100) ifade ve (Beifuss ve Gumienny, yayınlanmamış) doğru işlenir doğruladı. Entegre transgenlerin olursa olsun kaynağı yabancı arka plan mutasyonlar kaldırmak için beş kez outcrossed edilmelidir. Bizim ekran için, ilgi sadece protein transgenik, etiketli formu olmak istedim. Bu nedenle, fonksiyonel bir endojen g çıkarıldıbir kayıp fonksiyon-mutant dbl-1 alel tanıtarak ene. RNAi etkilerine Son olarak, duyarlı süzün. Hayvanların uygun bir seçerken ilgi doku (lar) düşünülmelidir RNAi 10,11 etkilerine hayvanlar duyarlaştırır bir mutasyon içeriyorsa kütüphaneden RNAi, çok sayıda gen için, gen ürünü bir daha ciddi azalma üretecek RNAi arka 11 hassasiyet. Biz tarama gerginlik yapmak için kurallı rrf-3 (pk1426) alel kullanılır. RRF-3 normal somatik RNAi 10 inhibe eden bir RNA-yönelimli RNA polimeraz (RdRP) homolog olduğunu. Eri-1 veya eri-1 lin-15b gibi diğer RNAi hypersensitizing genlerindeki mutasyonlar RNAi 11-13 etkinliğini artırmak yerine kullanılabilir. TexIs100;; dbl-1 (NK3) yaptığımız tarama suşu genotip rrf-3 (pk1426) sahiptir. 2. Seçimi ve hazırlanmasıRNAi kütüphane Ticari olarak mevcut C. elegans cDNA kütüphanelerinden C&#39;de tahmin edilen genlerin yaklaşık% 55 veya% 87 temsil elegans bireysel (Vidal laboratuar veya Ahringer laboratuar kütüphaneler, sırasıyla). Bireysel klonlar alım (Açık Biosystems, Geneservice, Ltd) için kullanılabilir. Onun klonları çoğunlukla tam uzunlukta cDNAlarının Geçidi klonlanmış ve downstream uygulamaları (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) hazır çünkü Vidal laboratuar (Açık Biosystems) tarafından inşa ORF-RNAi kütüphane seçti. Orijinal Ahringer laboratuar genomik cDNA kütüphanesi aşağı karakterizasyon çalışmaları 14,15 için yaygın olarak yararlı değildir cDNA parçacıklarını içerir. Her ikisi kütüphane eki (Şekil 1) sınırdaş iki T7 promotor içeren bir vektör kullanın. Yapıları izopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) indüksiyon üzerine T7 polimeraz ifade bakterinin HT115, yetiştirilmektedir. Kütüphane klonlarını içeren bakterilerin IPTG ile indüklenirdsRNA (Adım 3.4) üretirler. Aldıktan sonra tüm arşivinizi çoğaltın ve tüm deneyler için yinelenen kullanın. Orijinal ve yinelenen kütüphaneler elektrik hatları ayırmak bağlı farklı -80 ° C derin dondurucularda muhafaza edilmelidir. 3. Kütüphane klonları ile bakteri hazırlanması <ol><li> Seçilen besleme kütüphane klon yanı sıra pozitif ve negatif kontroller, etiketli LB-karbenisilin / tetrasiklin tabaklarda (biz 100 mm plaka başına 8 kültürleri büyümek) den Streak bakteri (iki deney ay içinde) ve 37 ° C de bir gece (inkübe &gt; 16 saat) (Şekil 1). Her 24-iyi plaka için iki kontrolleri kullanın. Pozitif kontrol, bli-4 (K04F10.4), doza bağımlı bir post-embriyonik pheontype 16,17 üretir. Negatif kontrol, C06C3.5, öngörülen bir sözde (yani <a href="http://WormBase.org">WormBase.org</a> hiçbir gözlenen fenotipleri (Beifuss ve Gumienny, yayınlanmamış) neden olur). </li&gt; <li> 50 mcg / ml karbenisilin ve 1mM IPTG - (deney iki ay içinde, tercihen er) 25 içeren 24-iyi Nematodu Büyüme Orta (NGM) tabak hazırlayın. 4 ° C&#39;de depolamak </li><li> (Gün 1) Her klon, standart steril tekniği kullanarak damarlı plaka (lar) (Adım 3.1) tek bir koloni ile 50 mcg / ml karbenisilin içeren 2 ml LB medya aşılamak. 37 inkübe ° C de bir gece (&gt; 16 saat) bir çalkalayıcı 220 set - 240 rpm (Şekil 1). Çözelti 16 saat sonra bulanık bir olmalıdır. </li><li> (2 gün) Ertesi sabah, 1 mM nihai bir konsantrasyona kültürlere IPTG ilave edilerek RNA (dsRNA) üretimi çift indüklemek. 5 saat - ek bir 4 için 240 rpm, - 37 ° C&#39;de, 220 de kültürler inkübe. Bu adımda NGM plakası (Basamak 3.5) ile agar sadece IPTG dayanarak daha gen ürününün daha tutarlı ve sağlam RNAi indüklenen demonte sağlar. </li><li> Her kaynaklı bakteriyel cu Spot 30 ul50 mcg / ml karbenisilin ve 1mM IPTG (Şekil 1, RNAi denemeleri izlemek için kullanılan şablon için bakınız Şekil 4) - 25 içeren 24-iyi NGM RNAi plakası ayrı kuyulara lture. 20 dakika steril bir akış başlık veya bakteriyel lekeler kuru hale gelene kadar ortaya çıkarılan plakalar, koyun. Overdry yapmayın. Aşırı kurumasını agar kenarları sonuçlanan yarıklar şeklinde tarama halinde onarılamaz olacak plakası ve hayvanlar çekilmesine neden olur. </li></ol> 4. Nematodlar hazırlanması Nematod aşamalı bir nüfus ile başlayın. Hayvanlar Sahneleme kontrol ve deney RNAi çalışmalar arasında görülen farklılıklar (RNAi bir gelişimsel gecikme neden olursa ancak, bu (Şekil 2) screener tarafından unutulmamalıdır) sadece hayvanların gelişim aşamasında farklılıklar nedeniyle olduğu olasılığını azaltır . Ayrıca, L1 larvaları ile RNAi deney başlangıç ​​gen ile RNAi tarafından embriyonik letalitesinin potansiyel karıştırıcı etkileri ortadan kaldırıres olması da ilgi postembryonic roller oynayabilir. Evreleme ilk tek yumurta kabuğu korumalı embriyoların hayatta tarama suşu, karışık bir dönem nüfus beyazlatma sağlanır. 20 ° C&#39;de yaklaşık 12 saat veya 16 ° C&#39;de 18 azından yaklaşık 18 saat içinde, bu aşamada hayvanlar. Için daha sıkı aşamada hayvanlar, gıda olmadan M9 ortamda embriyolar yumurtadan vererek ilk larva evresi (L1) tutuklu hayvanlar. Starved L1 hayvanlar 19 aynı başlangıç ​​yaşı gıda özgeçmiş büyümesi üzerine yerleştirilir. <ol><li> (Gün 1) beslenen üç 100 mm plakalar, gravida yetişkin ve embriyo içeren temiz tarama suşu hayvan kullanın. Hayvanlar ve embriyo gevşetmek için yavaşça plaka yüzeyi boyunca sıvı pipeting tarafından steril M9 kullanarak plakalardan hayvanlar yıkayın. Vidalı kapaklı steril 15 ml tüp içine yıkama aktarın. </li><li> Yıkama 3.5 ml büyükse, hayvanlar (30 saniye ~ 3000 rpm) aşağı spin ve 3.5 ml sıvı çıkarın. Yıkama l ise3.5 ml daha ess, 3.5 ml toplam tüp H 2 0 veya M9 ekleyin. </li><li> Kimyevi maddeler ise uygun koruyucu giysiler (laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük) kullanın. 1 ml taze çamaşır suyu (% 5 sodyum hipoklorit, eski 1 yıldan az) ile 0,5 ml 5 N NaOH karıştırın. 3.5 ml nematod yıkama için bu karışımı ekleyin. Sayan zamanlayıcı başlatın. Bu işlem 10 dakikadan fazla sürmemelidir. Eğer, daha sonra embriyoların tehlikeye edilecek ve verim azalabilir veya çamaşır suyu eski ve değiştirilmesi gerekir. </li><li> Yaklaşık 10 saniye Vortex tüp. Vorteksleme 4 ila 10 dakika boyunca her iki dakikada bir tekrarlayın. Her vorteksleme sonra, hayvan leşleri için bir kesme kapsamında çözüm gözlemlemek. </li><li> Embriyo yayımlanan ve yetişkinler (6 - 8 dakika) parçalanmış Bir masa üstü santrifüj (~ 3000 rpm, 30 saniye) tüpün iplik tarafından pelet, embriyoların. </li><li> Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar çok süpernatan aspire. Dikkatli olun, değilaçgözlü. </li><li> ~ 10ml steril M9 ekleyin. Vorteks kısaca veya pelletini iyi sallayın. </li><li> Spin ve tekrar supernatant çıkarın. Çamaşır suyu kokusu tüp tespit edilebiliyorsa, gerekli durulama tekrarlayın. </li><li> 10. Pastör pipetiyle embriyosu - 15 ml steril M9 ve küçük (25 ml) bir Erlenmeyer şişesinde (havalandırma için) transfer. Gece (20&gt; 16 saat ° C). - Zorlanma ve deney için uygun sıcaklıkta (25 ° C 15) de Shake Bu süre içinde, tüm hayvanlara yumurtadan ve L1 diapause tutuklu. </li><li> 1 ml M9 (~ 3000 rpm, 30 sn.) - (Gün 2) 0.5, 15 ml tüp ve Pastör pipetiyle L1 sahne hayvanlar aşağı Spin. Ayrı bir plaka üzerinde 5 uL çözüm yerleştirin ve hayvanların sayısını. 10 uL çözüm - gerekirse 30 solucanlar / 3 elde etmek için, ses ayarlamalar yapın. </li><li> Hazırlanan 24-kuyulu plakanın her olarak bakteriler üzerinde yaklaşık 30 hipoklorit senkronize L1 aşaması hayvanları ayırt. Çok fazla moayrıca başına 30 hayvanlardan daha yeniden olgunluk ulaşmadan açlıktan nüfusu neden olabilir. Kapakları askew kuru plaka edelim. Kapağı yerine takın ve lastik bir bant ile tutturun. Plakası tersine ve istenen aşamada skor için gerekli süre için uygun bir sıcaklıkta yerleştirin. Rrf-3 (pk1426) bir ısıya duyarlı alel olduğu için, tarama gerginlik hayvanlar 15 yetiştirilmiştir - 17 ° C üç dört gün için yetişkin sahne hayvanlar (Şekil 1) L4 gözlemlemek. </li></ol> 5.. Nematodların Gözlem Nematodlar istenen aşamada (Şekil 2A) büyüdü sonra (Gün 5), pozitif ve negatif kontrollerin bir mikroskop kullanılarak beklenen fenotipler üretirler onaylayın. Bu doza bağımlı bir post-embriyonik kusurları üretir, çünkü RNAi etkinlik için bir kontrol olarak bli-4 kullanmanız kabarmış yetişkin (hafif RNAi fenotipi gösterilmemiştir) aralık gelişimsel tutuklandı, küçük larvaları (güçlü, expected RNAi fenotip) (Şekil 2B). Sonra iyi RNAi (Şekil 2C) ile oluşturulan bir mikroskop ve not belirgin anormal fenotipleri kullanarak her bir deneysel hayvan gözlemlemek. Denetimleri doğruladı ve brüt fenotipleri belirtilmiştir sonra, ilgilenilen fenotipleri için RNAi deneyler gizliyorum. Biz denetimleri (Şekil 3) ile başlayan, floresans ve her RNAi deney en az beş hayvan gözlemlemek için bir 63x objektif ile donatılmış bir bileşik mikroskop kullanın. <ol><li> % 4 agar pad (H 2 O% 4 agar) yaparak bir slayt (standart 75 x 25 mm) hazırlayın. Agar pad üniform bir kalınlık sağlamak için, iki ara parçaları (her boşluk üzerinde laboratuvar bant iki kat olan bir mikroskop slayt yapılır) arasında temiz bir cam slayt yerleştirin. Temiz cam slayt merkezi üzerine erimiş% 4 agar 100 uL (cam pasteur pipeti iki ila üç damla) hakkında Pipet. Spacerların üst bir hızla fakat nazikçe yerleştirilmiş ek bir slayt kullanarak erimiş agar kaplayarak bir agar pedi Formund erimiş agar. Yavaşça pedi bir slayt bağlı kalarak bırakarak, apart cam slaytlar kaydırarak agar pad Açığa. </li><li> Agar pad üzerinde bir anestezik ~ 5 uL damla (levamizol veya sodyum azid, örneğin) yerleştirin. Dağı 8 - anestezik 12 hayvan. 22 x 22 mm # 1.5 coverslip (veya en iyi bileşik mikroskop için uygun lameller kalınlığı) ve bileşik mikroskop kullanılarak hayvanlar gözlemlemek ile kaplayın. </li><li> Her bir deney için kayda RNAi geni, gözlenen hayvan sayısı ve fenotip sonuçlanır. Bir ekran için, yapmak ve bir standart şablon (bkz. örnek, Şekil 5) kullanın. </li><li> Mümkünse, ve deney yineleyerek, bir başka, ikincil fenotipi RNAi üretilen fenotip doğrulayın. (Örneğin, örnek ekranda ikinci bir ekran 20 olarak birincil ekran ve vücut ölçüleri gibi GFP-tagged DBL-1 yerelleştirme değiştirilmesi kullanılır gibi gösterilmektedir.) Bakteri kadar aynı çizgi (4 ° C&#39;de saklanır) ile kullanılabilir iki ay. Eski çizgiler r olabilirSıvı gecede kültürlerde ve kötü büyüme esult ilk restreaked edilmelidir. </li><li> Sıra en az bir ekleme kütüphane etiket (Ahringer kütüphane yapılan bir güvenirlik analizi olmuştur; görmek eşleşen doğrulamak için cDNA&#39;nın sonu <a href="http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/">http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/</a> ) 21. 5&#39;-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 &#39;ve 5&#39;-GTAAAACGACGGCCAGT-3&#39; (M13f20 astar): önerilen primerler (ya kütüphanesinden uçlar için) L4440-türevi vektör ve yan ekleme sitesi sitelerde tavlama. </li></ol> Bu yöntemi kullanarak, tek bir kişinin makul sahnelemek ve deneyler iki ila dört takım her hafta izleyebilirsiniz. Örneğin, hayvanlar Pazartesi günü sahnelenecek ve Salı günü ise, Perşembe ve Cuma görülebilir ve yine pazartesi ve salı gözlem için Cuma ve Cumartesi günleri sahnelenecek edilebilir. Her gün taranması fenotip (ler) bağlı olarak, bir dizi bileşik mikro tarafından bir 24-kuyulu plakalı içerebilecektirSkopi veya fenotip hızla tespit ise daha fazla. Böylece, en azından 88 farklı RNAi deneyler hesabı pozitif ve negatif kontroller ve tarama hızı dikkate alınarak, bir hafta içinde görülebilir. Bir kesme kapsamı ekran görüntüleme için slayt üzerinde hayvan montaj için gerek kalmadan, çok daha hızlı yapılabilir. Birden fazla kişi aynı zamanda birden fazla mikroskoplar kullanılarak şaşırtıcı programları ve / veya bir laboratuvar verimi artırabilir. Agar ince bir film üzerinde hayvan büyüyen ve görüntüleme için bir slayt doğrudan hayvanların bulunduğu agar bir dilim aktarmak için alternatif bir yöntem zamandan tasarruf edebilir. Bu varyasyon başarıyla 400x büyütme at 22 erkek kuyruk anormallikleri taranması için kullanılmıştır. 6. Temsilcisi Sonuçlar GFP-etiketli DBL-1 normal ve değiştirilmiş Lokalizasyon örnekleri, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. GFP-tagged DBL-1 Normal ifade ventral sinir kordonu hücre gövdeleri ve punctae (Şekil 3A) bir satır içerir. DBL-1 is hayvanların RNA beslendiği zaman ciddi zayıflatılmış dbl-1 mRNA çeviri engeller (Şekil 3B). dbl-1 (RNAi) de, bu örnekte (veriler gösterilmemiştir), ikincil ekran küçük hayvanlar üretir. DBL-1 yerelleştirme etkileyen genler kolaylıkla Bu ekran (Şekil 3C) için tasarlanmış bir yük kullanarak RNAi ile tanımlanır. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Ekran düzeni DBL-1 sinyal dışı düzenleyiciler tanımlamak için. Besleme kütüphanesinden bakteriler, bir gece boyunca yetiştirilen IPTG ile uyarılan, ve bakteriler çift sarmal RNA (dsRNA) üretmek için izin vermek için ek bir 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Endüklenen bakteriyel kültür 30 ul 25 ug / ml karbenisilin ve 1 mM IPTG ihtiva eden bir 24-kuyucuklu NGM (nematodu büyüme medyumu) ​​plakası üzerine sıra başına gördü ve steril bir akış davlumbaz kurumaya bırakılır. Biz hipoklorit ile tedavi edilen embr sağlayarak ilk larva evresi (L1) larvalarının sahneleyecekyo bir L1 diapause (tutuklandı geliştirme) indükler gıda olmadan medyada çıkar. Yaklaşık 30 senkronize L1 aşamasında hayvanların büyümesini devam ettirmek ve bakteriler 23 tarafından oluşturulan dsRNA tüketmek hayvanların sahnelenen sağlar RNAi kütüphane, her bir kuyunun içeren bakteriler üzerine kaplanır. 15 ° C, genç erişkin solucanlar görünür bir fenotip için taranmaktadır az 72 saat sonra. Bu yaşta, vücut büyüklüğü kusurları belirgindir ve floresan texIs100 transgen ifadeden parlak. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Tarama öncesinde tanımlamak için fenotipleri örnekler. Bir tabak hayvanların tüm görüntüler iyi bir mikroskop kullanılarak aynı büyütme alındı. Hayvanlar bütün hasret L1 larva gibi kaplama sonrası 72 saat görüntülendi. Tüm görüntüler aynı şekilde tedavi edildi. A) Hiçbir brüt morfolojik bozukluk veren bir genin RNAi. Hayvanlar vahşi tip görünür. B) RNBli-4 Ai. Hayvanlar dpy-13 RNAi) tutuklandı gelişmeler gösteren ve paneli A. C hayvanlara kıyasla çok düşük. Hayvanlar panelinde bir hayvan gibi aynı gelişim aşamasında olan, ancak bir &quot;bodur&quot; beden morfolojiye sahiptir. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Floresan etiketli protein örnekleri ve nasıl RNAi spesifik genlerin lokalizasyon desen değiştirir. Tüm görüntüler iplik Disk konfokal mikroskopi, 5 sn ile 630x büyütme alındı. pozlama. Ölçek çubuğu = 10 mikron. Tüm görüntüler aynı şekilde tedavi edildi. Açık ok uçları hücre gövdeleri göstermektedir. Oklar punctae hattı işaretleyin. Dolgulu ok uçları bazı aberrantly lokalize GFP-tagged DBL-1 gösterir. A) RNAi beslenen sözde C06C3.5 (&quot;wild-tip&quot;). B) dbl-1 (RNAi) kontrolü. C) GFP-tagged DBL-1 normal yerleşim için gerekli bir genin RNAi. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig4.jpg" alt= &quot;Şekil 4&quot; /&gt; Şekil 4. 24-iyi plakaları RNAi deneyler (kütüphane klonlar) izlemek için Şablon örneği. Bu şablon, doğrudan levhalar etiketleme aksine deney kalıcı bir kayıt oluşturmak için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Kayıt RNAi fenotipleri için Şablon örneği. Gerektiği gibi genişletin.

<ol>
	<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li><li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+RNA+interference.">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans.">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li><li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants.">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li><li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains.">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+bli-4+(I)+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development.">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li><li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2/subtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology.">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes &#38; Development. 9, 956-971 (1995).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library:+a+guide+for+genome-wide+screens.">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li><li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing.">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan RNAi tarama yöntemi, normal bir (ya da transgenik) postembryonic fenotipi için gerekli gen ürünlerinin hassas ve hızlı bir analizi sağlar. Gösterilen örnek bir floresan etiketli proteinin hücre içi lokalizasyonu ilgili genler için bir ekran. Ancak, bu protokolün diğer ilgi postembryonic fenotipleri etkileyen genleri tanımlamak için değiştirilebilir. Bu yöntem, bir RNAi kütüphanesi kullanarak bir aday gen yaklaşımı yararlanır. Mutagenez tekniklerini kullanarak İleri genetik ekranlar rastgele uyarılan romanı allel tespit, ancak bu alleller 24 tanımlamak için önemli bir zaman, çaba ve / veya fonlar gerektirir. CDNA kütüphanesi ile birlikte, diğer yandan, ilgilenilen bir fenotip RNAi hızla aday gen teyit neden cDNA ucun sekanslama. Ayrıca, klonlama hazır cDNA ekler belirlenen adayların aşağı analizleri kolaylaştırmak. Mutasyona uğramış zaman ölümcül Ayrıca, genbelirlendi ve RNAi kullanılarak analiz edilebilir. Endüklenen bakteriler üzerinde kuluçkadan hayvanlar yerleştirerek, bu yöntem ayrıca önemli bir rol oynarlar embriyonik genleri için postembryonic kusurların gözlem izin verir. Gözlenen hayvanlar açlıktan olmadığını teyit etmek için özen gösterin. Açlık hayvanın fenotipi etkileyebilir. Roman RNAi fenotipleri aç hayvanlarda belirlenirse, fenotip RNAi değil açlıktan bir sonucu olduğunu onaylamak için tekrarlayın. Açlık önlemek için, sabit faz (besi çok &quot;bulutlu&quot; olduğu) için büyüdü edilmiş taze bakteri kullanıyoruz, ve iyi başına sadece ~ 30 hayvan kullanın.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> NGM Agar </td><td> Nematodu büyüme ortamının </td><td> IPM Bilimsel, Inc </td><td> NGM agar protokolü 25 takip hazırlanabilir </td></tr><tr><td> M9 Orta </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1 mM MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> Agar-Agar </td><td> Merck Kimyasalları A.Ş. </td><td> 1.01614.1000 </td><td> NGM levhalar için su içinde% 2. Mikroskop lamı pedler için su içinde% 4 (başlangıçta ve daha sonra eritmek için mikrodalga otoklavlama). </td></tr><tr><td> Bacto Peptonlu </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> % 0.25 </td&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> Araştırma ürünleri International Corp </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 mM nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> karbenisilin </td><td> Araştırma ürünleri International Corp </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 mcg / ml çalışma seyreltme </td></tr><tr><td> LB Broth Lennox </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 g / litre </td></tr><tr><td> tetrasiklin </td><td> Sigma </td><td> 268054 </td><td> 12.5 mg / ml çalışma seyreltme </td></tr><tr><td> sodyum hipoklorit </td><td> Herhangi bir marka </td><td> % 5 çamaşır suyu </td><td> Taze çamaşır suyu kullanın. </td></tr><tr><td> sodyum hidroksit </td><td> Herhangi Marka </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N stok </td></tr><tr><td> M9 orta </td><td> Wormlab Yemek Kitabı </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> Sigma </td><td> 31742 </td><td> 100 uM - 1 mM çalışma seyreltme </td></tr><tr><td> Sodyum azid </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227 </td><td> M9 çalışma dilüsyonu, 10 mM </td></tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 662160 </td><td> VWR distribütörü </td></tr><tr><td> mikroskop lamı </td><td> Herhangi bir marka </td><td> 75 x 25 x 1 mm </td><td></td></tr><tr><td> mikroskop kapak slipleri </td><td> Herhangi bir marka </td><td> 22 x 22 mm No.1.5 </td><td> Mikroskop üreticisi tarafından önerilen kalınlığı kullanın. </td></tr><tr><td> bileşik mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> A1M </td><td> Deneyin ihtiyaçlarına uygun hedefleri ve filtreleri kullanın. </td></tr><tr><td> medya pompası</td><td> Manostat Varistaltic pompası </td><td> Kate Model # 72-620-000 </td><td> Boru ve makine için uygun ayarları kullan </td></tr></tbody></table>

rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans

C. elegans çok sayıda gen ve gen yolları 1 keşfi ve fonksiyonel karakterizasyonu için değerli bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Daha gelişmiş araçları ve bu sistemde çalışmaları için kaynakların daha ince fenotipleri veya rollere sahip genlerin sürekli keşif kolaylaştırır. Burada biz C. tanımlamak için adapte genelleştirilmiş bir protokol sunmak RNAi 2 ile ilgi postembryonic fenotipleri ile elegans genleri. Bu işlem kolay olmadığını bir kesme veya bileşik mikroskop ışık veya floresan optik tarafından, tahlil tercih fenotipi değiştirilir. Bu tarama protokolü organizmanın fiziksel varlıkların ve moleküler araçlar C. istifade elegans araştırma topluluğu üretti. Bir örnek olarak, bu normal Lokalizasyon için gerekli olan genlerin tanımlanması için bir RNAi ekranda bir floresan ürünü ifade entegre bir transgen kullanımını göstermektedirgeç dönem larva ve yetişkinlerde ürün. İlk olarak, tam uzunluktaki cDNA uçları ile ticari olarak mevcut genomik RNAi kütüphanesi kullanılabilir. Bu kütüphane aday gen ürününün RNAi indirgenmesiyle birden aday hızlı bir şekilde tespit kolaylaştırmaktadır. İkincisi, biz bir RNAi duyarlı arka planda ilgi bizim fluorecently tagged proteini ifade eden bir entegre transgen oluşturulur. Üçüncüsü, RNAi için yumurtadan hayvanların teşhir ederek, bu ekran aksi ilgi protein düzenleyen bir post-embriyonik rolünü maskeleyeceği hayati bir role sahip embriyonik gen ürünlerinin belirlenmesi izin verir. Son olarak, bu ekran tek hücre çözümü için donanımlı bir bileşik mikroskop kullanır.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans at JoVE.com

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem tarif<em&gt; C. elegans</em&gt; Bir RNAi tabanlı ekran genomik ve işlevsel, floresan etiketli protein ifade entegre bir transgen kullanarak.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

17.0K Görüntüleme.  Texas A&M University System Health Science Center. Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem tarif C. elegans Bir RNAi tabanlı ekran genomik ve işlevsel, floresan etiketli protein ifade entegre bir transgen kullanarak.

Video: RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...