Mevcut protokolün geliştirilmesi için finansman özellikle Ulusal Tayvan Üniversitesi, Tayvan (hibe ID-104R350144) yanı sıra, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (hibe kimliği &quot;Top Üniversitesi Planı Amaç&quot; tarafından desteklenmektedir: EN 104 -2313-B-002-039-My3). Biz özellikle mevcut çalışma için bir hayvan odası ve laboratuar alanı sağlamak için Ulusal Tayvan Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi teşekkür ederiz.

Not:.. Bu prosedür ve Bauer ve ark, 2013 ve Nakazawa ve arkadaşları, 2011 tarafından geliştirilen 2,9 tavuk modeli Kültür Protokolü bir modifikasyonudur 1. Sağlıklı Embriyonik Gün 5 embriyolar Japon Bıldırcınlarında gelen hazırlayın <ol><li> Aynı kafeste birlikte 1 erkek ve 3 kadın cinsel olgun Japon bıldırcın yerleştirin. Besleme yem ve su ad libitum verilmiştir. Işığın 14 saat ve karanlığın 10 saat hayvan odasında ışık ayarlayabilirsiniz. </li><li> öğleden sonra her gün plastik torbalarda döllenmiş yumurta toplamak ve embriyoların büyüme hızını yavaşlatmak için bir 16 ° C buzdolabında saklayın. </li><li> İki haftalık bir süre içinde yumurta yeterli sayıda topladıktan sonra, beş gün boyunca iyi bir havalandırma ile 37 ° C inkübatör döllenmiş yumurta kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 2. Bazal Orta ve Yıkama Çözümleri hazırlayın <ol><li> Büyüme ortamı olarak (pH 7.2 a ayarlanmıştır), DMEM / F-12 ortamı kullanın, ve ek% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NBCs) ve% 1 Pen-Strep Ampho ile. Çözelti (PSA, penisilin, 10 5 birim / L streptomisin, 100 mg / l; amfoterisin B, 0.25 mg / L). </li><li> depolama için 10x konsantrasyonda fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın; yıkamak için (pH 7.2 ayarlamak, KCI, 2,667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM;; Na 2 HPO 4 -7 2 O, 8.06 mM NaCl, 137,93 mM içeren) ve yolk kesesi membran süre nemlendirin 1x PBS çözümü kullanın yumurta sarısı ve albümin gelen endoderm ayıran. </li><li> endoderm pelet yeniden askıya (pH 7.2 a ayarlanmıştır) DMEM ortamı kullanın. </li></ol> Japon Bıldırcın YSMs Primary EECS 3. Koleksiyonu <ol><li> 5 gün (adım 1.3) için toplanan yumurta kuluçkaya yatmaktadır. normal embriyonik gelişmeyi teyit etmek için bir yumurta Candler tarafından yumurta inceleyin. NOT: embriyonik 5. günde, YSM mezodermin sınır çok net ve 3 embriyonik tabakalar daha az birbirine sıkıca bağlı olan, bu nedenle ob kolaydırtain Endoderm. Sadece YSM koleksiyonları normal kapiller dolaşımı gelişim gösteren yumurta kullanın. </li><li> dikkatle taze su ve% 75 etanol kullanarak kabuğu temizleyin. nazikçe, bir makas ile hava hücre konumundan yumurta kabuğu açın dışarı soyun ve 37 ° C 1x PBS ile dolu bir 10 cm kültür çanak forseps ve yerine göre bütün YSM toplamak. </li><li> bir makas embriyo, yumurta sarısı ve yumurta beyazı kaldırmak ve nazikçe 1x PBS ile YSM yıkayın üç kez ve 10 cm kültür çanak PBS çözüm YSM yerleştirin kullanma. </li><li> YSM gelen ektoderm kaldırmak için forseps ve bir makas kullanın. 2 forseps kullanabilir, bir sıkıca endodermal hücre tabakası tutmak için, ve diğer kılcal mezoderm tutun. </li><li> bir mikroskop altında ayrı çekin ve embriyo doğru yönde mezodermin kenarından endoderm ayırın. 37 ° C wat büyüme ortamına, 15 ml bir damlalık ve yer kullanarak 50 ml santrifüj tüplerine açık sarı endoderm toplamaker banyosu tüm doku koleksiyonları tamamlanana kadar. </li></ol> Kollajenaz Sindirim tarafından Endoderm Dilimleri 4. Sindirim <ol><li> Taze DMEM, 10 ml tip IV kollajenaz 6.5 birim çözülür. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g&#39;de 50 ml tüpler (3.4) santrifüjleyin. orta aspire ve bir pipet kullanarak 6 cm kültür çanak tüm endoderm yerleştirin. Bu kültür kabı 1 ml kolajenaz çözeltisi ekleyin. </li><li> Her dilimin büyüklüğüne kadar kavisli bir makasla 2 bıldırcın embriyolardan alınan endoderm dilimleyin yaklaşık 2 ila 3 mm. Bir damlalık kullanarak taze kolajenaz çözeltisi 9 ml ile birlikte bir 50 ml santrifüj tüpüne tüm dilimleri toplar. </li><li> 175 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de ve çalkalama su banyosunda 30 dakika boyunca kolajenaz ile doku Digest. kollajenaz ile Bu kısmi sindirim eksplant hücre çoğalmasını iyileştirmek için kullanılır. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g&#39;de santrifüj ve yavaşça bir pipet kullanılarak süpernatan fraksiyonu kaldırma. 20 ml DMEM içinde süspansiyon pelet yıkayın ve 3 dakika boyunca 130 x g santrifüj sonra süpernatan fraksiyonu çıkarın. </li><li> Yeniden askıya büyüme ortamında (% 10 NBCs ve% 1 PSA DMEM / F12) 12 ml pelet ve 24 oyuklu bir plakaya yavaşça ve eşit (her bir 500 ul hücre çözelti) tohum. </li><li> Hücreler doku üzerinden çoğalmaya izin 2 gün boyunca havada% 5, 37 ° C&#39;de CO2 doku eksplantlarında inkübe edin. </li><li> Başka bir 2 gün boyunca inkübe hücreleri ve hücre canlılığı tahlil protokolü tarafından hücre canlılığı için karakterize eder. 15 NOT: Yaşayan hücreler sitoplazmada içinde bir indirgeyici bir ortam sağlamak. Resazurin, aktif terkip maddesi, mavi renkte ve hemen hemen floresan olmayan bir toksik-olmayan, hücre geçirgen bir bileşiktir. hücre kültürlerine eklendiğinde, resazurin mitokondriyal enzimlerin sitosolde resorufine azaltılır. Resorufm kırmızı renkte ve oldukça floresan olduğunu. Canlı hücreler sürekli resazurin Resorufm dönüştürmek, artışlarlahücreleri çevreleyen kültür ortamının genel floresans ve renk asing. </li><li> Açıklandığı gibi transkripsiyon ve PCR marker geni mRNA kantitatif gerçek zamanlı ters endoderm epitel hücresi total RNA izolasyonu gerçekleştirin. 16,17 <ol><li> SOAT1 mRNA tespit etmek için ters transkriptaz PCR kullanarak (sens: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; antisens: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39; PCR ürünü = 168 bp) EEC hücreleri için bir özgün bir işaret olarak. Bir temizlik geni ve iç kontrol olarak β-Aktin mRNA (PCR ürünü = 151 bp: &#39;;; 5&#39;-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 anlamsız&#39; 5&#39;TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 duygusu) kullanın. </li><li> RT-qPCR ürün boyutunu tespit etmek için jel elektroforezi kullanın. % 1 agaroz jeli hazırlayın ve 2 ul yükleme boyası 10 ul qPCR karıştırın. Yük 10 ul de% 1 agaroz jeli içinde her birine Karışım 30 dakika süre ile 100V ile jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review.">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li><li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells.">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li><li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age.">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A:+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane,+liver,+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys.">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+(Meleagridis+gallopavo)+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development.">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li><li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac.">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li><li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development.">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li><li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken.">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li><li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo.">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li><li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick.">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li><li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens.">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li><li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos.">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations.">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).</li><li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3&#946;/&#946;-Catenin+signaling+in+mice.">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3&#946;/&#946;-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li></ol>

There is no competing financial interests or other conflicts of interest. We did not get any funding from any private company.

Önceki kültürü sistemi, sadece sınırlı bir başarı olduğundan, daha iyi bir kültür sistemi gereklidir. Japon bıldırcın YSM endoderm gibi ex-vivo eksplant daha iyi bir büyüme performansı elde etmek için hücre-hücre kavşakları gevşetmek için kollajenaz gibi proteolitik enzimlerle tedavi gerektirir. Verilerimiz kısmi sindirimi tedavi hücre sayısı 2 gün sonra (Şekil 1) için tohumlama sonra sindirilmemiş doku kültüründen daha fazla olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kısmi proteolitik sindirim YSM hücre verimini artırmak için kritik bir adımdır. Geçerli kültür protokolü kritik değişiklik kısmi proteolitik sindirim olduğunu. Bu tedavi büyük hücre verimi canlı EECS elde başarı oranını artırmıştır. aşırı sindirim dokusu hücreleri ayıracak ve hücreler, plaka takmak çünkü altında sindirim az hücre verimi ile sonuçlanmıştır oysa sindirim süresi çok kritikDoku eksplantlar. Yukarıda tarif edilen koşullar kullanılarak 30 ila 40 dakika sindirim uygun olduğu bulunmuştur. Geçerli protokol EECS elde etmek için yüksek teknik eğitim gerektirir. EECS toplama zamanı noktası, örneğin, biz sadece embriyonik 5. günde EECS toplamak sınırlıdır nedeni kuş embriyoları büyüdükçe, yumurta sarısı kese zarında katmanları arasındaki bağlantılar daha karmaşıktır ve toplama başarılı oranını azaltır olduğunu EECS. Protokol erken evre embriyo EECS fakat geç aşama embriyolar elde etmek için kullanılabilir. Geç evre EECS doğrudan araştırma olanağını sınırlandırmaktadır. SOAT1 ve lipoprotein lipaz ve lipid birikimin sentezleme YSM 4,5,11 özellikle EECS temel özelliğidir. Bu çalışmada, SOAT1, LPL ve 2 (PLN2) mRNA perilipin doğru fizyolojik charact hücreleri oluşturabilir kültür sistemi gösteren, EECS son derece olarak ifade edilmiştireristics. Mevcut teknik, primer EECS büyük miktarda üretti. Önceki tarif edilen prosedür 9 kullanıldığında, EEC kültür başarı oranı 24-çukurlu, mevcut protokolü EECS oluşturulan ise neredeyse% 100&#39;lük bir başarı oranı hücre kültür plakaları içinde, yaklaşık% 60 idi. Sarısı kese zarının, böylece gelişimi sırasında embriyolar yumurta sarısı besin aktarmak için saptanmıştır, proteinler, lipidler, ve yumurta sarısı kolesterol absorbe temel bir dokudur. Kolesterol ester oluşumu için temel bir enzimdir SOAT1. 11 büyük kolesterol esterifikasyon 4 oluştuğunda SOAT1 avian embriyonik gelişim geç evrelerinde önemli ölçüde artar, Kültür haline EECS özelliklerini değerlendirmek için işaretleyici gen olarak SOAT1 mRNA ekspresyonunu kullanılır. Biz bu birincil AET kültür sistemi fizyolojik özelliklerini beklenen üretilen olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, AET kültür sistemi embryo incelemek için değerli bir araç olabiliric lipit ulaşım kuş embriyonik gelişim sırasında YSM besin kullanımını aracılık yer alan genlerin rolü açıklığa kavuşturmak ve.

Kuş embriyo önemli beslenme kaynağı% 33 lipit,% 17 protein oluşan sarısı, ve% 1 kül. 1 embriyo gelişimi sırasında, sarısı kese zarının (YSM) embriyonik karın boşluğu içinde yetişen ve yavaş yavaş sarısı kapsar yüzey. Embriyonik gün 2 başlayarak, lipit metabolizması ve anjiyojenez ile ilişkili gen ekspresyonu kademeli YSM artar ve YSM yavaş tüy benzeri çıkıntılar geliştirir. 8,9 Bu çıkıntılar embriyo gelişimini desteklemek için sarısı besin emilimini artırır. YSM üç germ katmanları, endoderm, mezoderm ve ektoderm içeren bir extraembryonic dokudur. 14 yolk kesesi ektoderm nazikçe sarısı kesesi kapsayacak şekilde vitellin membran ile albümin ve bağlantılar ile karşı karşıyadır. Endodermal epitel hücreleri Kadm bölünebilir yumurta sarısı doğru doğrudan karşı karşıya ve besin kullanım portalları olarak hizmet vermektedir. 6 YSM genişledikçe, Endodermal epitel hücre (EECS) vardırİki grup, bölge vitelline ve alan vaskulosa içine e ve işlevsellik. 7 Konum Vitellin endodermal hücrelerden oluşan ve embriyo uzak olmaktadır; Konum vaskulosa mezodermal hücrelerden oluşan ve kan damarları ve bağ dokuları ile farklılaştırılmış EECS kapsar. embriyonik gün 5 ile, yumurta sarısı tamamen YSM ve ektoderm ve endoderm ile kaplıdır ve vasküler alan hızla büyüdü. YSM embriyonik dolaşım sistemine (sarısı türetilen çok düşük yoğunluklu lipoprotein) ve proteinler. 9, 2 Bu nedenle, lipit mekanizmaları incelemek için, birincil Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültür sistemi tesis yeniden oluşturur ve serbest bırakır lipidler, emer kuş embriyonik gelişim sırasında YSM içinde kullanımı. Böyle triaçilgliserol, lesitin, fosfolipid ve kolesterol esteri (CE) olarak lipidler kuş embriyolar için birincil enerji kaynaklarıdır. gelişiminin erken aşamalarında, yumurta sarısı lipidler c vardırsadece% 1.3 CE omposed ve kuş embriyonik gelişim 3 orta vadede% 10-15 yükselir, 11. Kolesterol ester kuş embriyo YSM sterol O-asiltransferaz 1 (SOAT1) tarafından kolesterolden sentezlenir. 4 Kolesterol depo formu CE, CE lipoproteinler taşınır ve lipoproteinler dokulara dolaşımı ile taşınmaktadır. 13 Bir hafta ambar önce kuş embriyoların hızlı bir büyüme var. Yaklaşık sarısı kalan lipit içeriğinin% 68, bu aşamada emilir. 10 lipidler bir AET araştırma modeli ile açıklık kazanabilir kullanılmaktadır sarısı hangi mekanizma. Bir tavuk EEC kültürü protokolü bu araştırma hedefe ulaşmak için kurulmuştur. 2, 9 Ancak, gelişmiş AET hücre kültürü prosedürü ile besin kullanımını aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için gerekli doku eksplant düşük başarı oranına gelişimi sırasında kuş embriyolar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="845">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12800-017 10 X 1 L</td>
			<td style="width:167px;">For wash the EECs pellets</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">D-MEM/F-12</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12400-024 10 X 1 L</td>
			<td>As the basal medium in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">NBCS</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">16010-159</td>
			<td>As the supplyment serum in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Pen-Strep Ampho. Solution</td>
			<td style="width:199px;">BI (Biological Industries)</td>
			<td style="width:148px;">03-033-1B 100ml</td>
			<td>For attenuating the possible infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Collagenase Type IV</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">17104-019 1g</td>
			<td>&#160;Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">24 well plate</td>
			<td style="width:199px;">FALCON&#174;</td>
			<td style="width:148px;">REF-353047</td>
			<td>For EECs to attach and extension</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">50 ML PP centrifuge tubes</td>
			<td style="width:199px;">Corning&#174; CentriStarTM</td>
			<td style="width:148px;">430829</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">50ML Conical bottomed Tube with Cap</td>
			<td style="width:199px;">PRO TECH</td>
			<td>CT-50-PL-TW</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Reciprocal shaking bath</td>
			<td>DEAGLE</td>
			<td style="width:148px;">SB302</td>
			<td>For better enzymatic digestion on membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary endodermal epithelial cell culture from the yolk sac membrane of japanese quail embryos

Biz gelişim sırasında kuş embriyolar tarafından besin kullanımı aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için bir Endodermal epitel hücre kültürü modeli (AET) kuruldu. Döllenmiş Japon bıldırcın yumurta 5 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edildi ve daha sonra SAC membranları (YSM) EEC kültür sistemi kurmak için toplandı sarısı edildi. Biz YSM embriyonik endoderm katman izole edilir ve 2&#39;ye membran dilimlenmiş - 3 mm parçalar kısmen 24 oyuklu kültür plakaları içinde, tohumlamadan önce kollajenaz ile sindirilir. EECS dokusu içinde çoğalan ve hücre kültür çalışmaları için hazırdır. Bu EECS, örneğin, in vivo olarak YSM tipik özelliklerini, lipid damlaları birikimine, sterol O-asiltransferaz ve lipoprotein lipaz ekspresyonunu olduğu bulundu. Kısmi sindirim tedavisi önemli ölçüde AET kültürünün başarılı oranı arttı. EECS kullanarak, biz SOAT1 sentezlenmesi cAMP d düzenlenir olduğunu göstermiştirependent protein A ile ilgili yol kinaz. Bu birincil Japon bıldırcın EEC kültür sistemi embriyonik lipid ulaşım incelemek ve kuş embriyonik gelişim sırasında YSM besin kullanımını aracılık yer alan genlerin rolü açıklığa kavuşturmak için bir araçtır.

tutarlı ve yararlı bir hücre modeli oluşturulması amaca ulaşmak için, biz uzanan ve çoğalma hızı ve avyan EECS performansını stabilize etmek gerekir. Bu kısmen, kolajenaz ya da kollajenaz artı dispase 0.6 U gibi proteolitik enzimler ile sindirilmiş endoderm ile bir enzimi sindirimi ile endoderm doğrudan inkübasyon karşılaştırıldı. Dispase polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize bir amino-endopeptidazdır. Proteaz sindirimi tedavileri Resim sindirim (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında, hücre çoğalması artmıştır ise, hücre büyümesi beş gün inkübe edildikten (Şekil 2) sonra iki enzim muameleleri arasında belirgin bir farklılık göstermemiştir. Bununla birlikte, kolajenaz işleme daha iyi bir büyüme eğrisi sağladı ve EECS 6-9 gün (Şekil 2) için istikrarlı bir şekilde prolifere gösterdi. Bu durumda, kısmen kolajenaz sindirimden EECS büyümesini geliştirilmişEx vivo eksplantlar ve yeterli ve fonksiyonel EEC elde edilmesi için tavsiye edilir. 4 gün inkübasyondan sonra, EECS kültür hücrelerinin doğru fizyolojik özelliklerini öne formalin fiksasyonu ve Petrol-Kırmızı O boyama (Şekil 3) sonra tespit bir adiposit gibi bir görünüm vardı. (IBMX, cAMP bozulmasını azaltmak için) siklik adenosin monofosfat (cAMP), bir transkripsiyon düzenleyici madde, cAMP fosfodiesteraz inhibitörü olan 3-izobutil-1-metilksantin varsayıldı ve adenil siklaz aktivatörü forskolin (cAMP sentezini artırmak için) hem 24 saat tedavi (Şekil 4) sonra SOAT1 mRNA ekspresyonunu uyarmıştır. Yüzey proteini markör o Bu tedaviler de SREBP2, bir kolesterol sentez düzenleyici bir transkripsiyon faktörünün ifadesi artmış, forskolin perilipin-2 (PLIN2) ekspresyonunu artırmıştırf lipid damlacıkları (Şekil 5). Gerçek zamanlı PCR ile ölçülmüştür lipojenik genler için AT mRNA bulunmaktadır (Şekil 5) adipositlerce benzerdir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig1.jpg" /> Şekil 1. Endodermal epitel hücrelerindeki Kısmi kollajenaz sindirimi Etkisi. Doku eksplantlarında hücrelerin doku üzerinden çoğalmaya izin 2 gün inkübe edildi. Biz gözlenen ve başarılı yetiştirilen EECS sayısını hesapladı. Sayılar, kısmen kolajenaz ile sindirilir Resim sindirim ve hücreler ile hücre için hesaplandı; hem 24-çukurlu tablalarda büyütülmüştür. Y-ekseni 24 oyuklu hücre kültürü plakasının başarıyla çoğaldı EECS iyi bir sayıdır. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analizler ikili t-testi ile belirlenmiştir. P &lt;0.0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig1large.jpg" target="_blank">Tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig2.jpg" /> Kısmi Enzim Sindirim sonra EECS Hücre Büyüme Performansı 2. Şekil. proliferasyon hızı hücre canlılığı deneyi ile tespit edilmiştir. Deney ihtiva resazurin, zayıf bir floresans ve resazurin bir mavi bileşim hücreleri girdikten sonra resorufine azaltılır. Canlı hücreler sürekli hücreleri çevreleyen ortamın genel floresan ve renk artan Resorufm için resazurin dönüştürmek. Canlı hücreler, 600 nm&#39;de normalizasyonlu 570 nm&#39;de absorbans ile tespit edildi. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analiz Bonferroni son test (; kolajenaz + dispaz grubu N = 11 kolajenaz grubu n = 10) ile birlikte iki yönlü ANOVA ile belirlenmiştir. * P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig2large.jpg" target="_blank">Lütfen cli</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya ck. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53624/53624fig3.jpg" /> Şekil 3. Kültür EECS Morfoloji. 4 gün inkübasyondan sonra, EECS formalin fiksasyonu ve Petrol-Kırmızı O boyamadan sonra tespit bir adiposit gibi bir görünüm vardı. Soldan sağa: AET aydınlık alanda 100X büyütme ile, 200X büyütme ile aydınlık alanda ve 200X büyütme Petrol-kırmızı O ve hematoksilen ile boyandıktan sonra. En soldaki rakam soldaki karanlık nokta kısmen sindirilmiş endoderm (membran) &#39;dir. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53624/53624fig4.jpg" /> Şekil 4. SOAT1 TranscAMP aktivatörleri ile işlemden EECS arasında cription. Bu 24 saat süre ile 5. günde IBMX konsantrasyonlarını ya da forskolin artan EECS işlemden geçirildi. Bu muamele edilmiş hücrelerden mRNA özütlendi ve ters transkripsiyon PCR ile cDNA&#39;ya RNA&#39;nın dönüştürülür. Biz gerçek zamanlı kantitatif PCR ile transkripsiyon seviyeleri analiz ettik. β-aktin ev bakıcısı geni olarak kullanılmıştır. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analizler Tukey post-testi ile tek yönlü ANOVA ile (n = 6) (* p≤ 0.05, ** p≤ 0.01). IBMX, hücre içi cAMP yükseltir PKA aktive TNF-alfa ve lökotrien sentezini inhibe iltihap ve doğal bağışıklığı azaltan ve seçici olmayan bir adenozin reseptör antagonisti olan bir rekabetçi seçici olmayan fosfodiesteraz inhibitörüdür. Forskolin, yaygın cAMP seviyelerini yükseltmek için kullanılan ökaryotik adenilat siklaz bir yerde aktivatörü olduğunu. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig4large.jpg" target="_blank">Bu figu büyük halini görmek için tıklayınız</a>yeniden. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53624/53624fig5.jpg" /> Şekil 5 beş gün boyunca EEC&#39;nin yetiştirilmiş mRNA ekspresyonu, sonra. 24 saat cAMP aktivatörleri ile işlemden Şekil 4&#39;te cDNA en kantitatif PCR, gerçek-zaman gen ekspresyon düzeyleri analiz etmek için kullanıldı. β-aktin temizlik gen olarak kullanılan ve iç kontrol olarak görev almıştı. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analizler kontrol tedavileri karşılaştırmak için Tukey post-testi (n≤ 6) ile tek yönlü ANOVA ile idi. SREBP2, sterol düzenleyici elementi bağlayan protein 2; LPL, lipoprotein lipaz; PLIN2, perilipin-2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos at JoVE.com

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Görüntüleme.  National Taiwan University. To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Video: Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...