מימון לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי נתמך בעיקר על ידי &quot;לשאוף תוכנית Top אוניברסיטת&quot; של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן, טייוואן (מענק ID-104R350144), כמו גם את משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (ID מענק: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). תודה מיוחדת במרכז לביוטכנולוגיה של הלאומית טייוואן אוניברסיטת למתן חדר חיה ומרחב מעבדה לחקר הנוכחי.

הערה: הליך זה הוא שינוי של פרוטוקול תרבות מודל עוף שפותחה על ידי באואר ואח &#39;2013 Nakazawa ואח&#39;, 2011. 2,9.. 1. הכין בריא עוברי יום 5 עובר מן השליו יפני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 זכר ונקבה 3 שליו יפני בוגרים מינית יחד באותו כלוב. Feed היצע כרצונך מים. התאם את האור בחדר חיה ל -14 שעות של אור ו -10 שעות חושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ביצים מופרות בשקיות פלסטיק בכל יום בשעות אחר הצהריים ולשמור אותם במקרר 16 ° C לעכב את קצב הצמיחה של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף מספר מספיק של ביצים בתוך תקופה של שבועיים, לדגור על הביצים המופרות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אוורור טוב במשך חמישה ימים. </li></ol> 2. כן בסל בינוני לשטוף פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש DMEM / F-12 בינוני (מותאם pH 7.2) כמדיום הצמיחה, ומשלימים זהעם 10 סרום חדש נולד% עגל (NBCS) ו -1% פן-סטרפטוקוקוס Ampho. פתרון (PSA; פניצילין, 10 5 יחידות / L; סטרפטומיצין, 100 מ&quot;ג / L; Amphotericin B, 0.25 מ&quot;ג / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בופר פוספט פתרון (PBS) בריכוז 10x לאחסון; לשימוש פתרון PBS 1x (המכיל NaCl, 137.93 מ&quot;מ; KCl, 2.667 מ&quot;מ; KH 2 4 PO, 1.471 מ&quot;מ; Na 2 HPO 4 -7 ש 2 O, 8.06 מ&quot;מ; להסתגל 7.2 pH) כדי לשטוף להרטיב אותו זמן קרום שק החלמון הפרדת endoderm מן החלמון אלבומין ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני DMEM (מותאם pH 7.2) מחדש להשעות כדורי האנדודרם. </li></ol> אוסף 3. EECS ראשית ממנהל YSMs יפני שליו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים שנאספו במשך 5 ימים (שלב 1.3). בדוק את הביצים על ידי בודק ביצים כדי לאשר התפתחות עוברית נורמלית. הערה: ביום עוברי יום 5, הגבול של mesoderm YSM הוא מאוד ברורה ואת 3 השכבות העובריות הן פחות בחוזקה צמודות זו לזו, כך קל OBendoderm טיין. השתמש רק את הביצים מראות פיתוח זרימת נימים נורמלי אוספים YSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את קליפת הביצה באמצעות מים מתוקים בזהירות אתנול 75%. פתח את קליפת הביצה מעמדת תא אוויר על ידי זוג מספריים, לקלף בעדינות החוצה לאסוף את כל YSM ידי מלקחיים ומניחים בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ מלא 37 ° C 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מספריים להסיר את העובר, חלמון ביצה-לבן, לשטוף בעדינות את YSM עם 1x PBS שלוש פעמים ומניחים YSM בתמיסה PBS בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים וזוג מספריים כדי להסיר את האאקטודרם מ YSM. שימוש 2 מלקחיים, אחד להחזיק את שכבת תאי endodermal בתקיפות, ושני להחזיק את המזודרם נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לפרק ולהפריד את endoderm מהקצה של mesoderm בכיוון כלפי העובר. אסוף את endoderm אור צהוב 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגות באמצעות טפטפת ומניחים 15 מ&quot;ל של מדיום הגידול בתוך וואט 37 ° Cאה באמבטיה עד כל אוספי הרקמות הושלמו. </li></ol> 4. עיכול של פרוסות endoderm ידי Collagenase עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי לפזר 6.5 יחידות של collagenase מסוג IV ב 10 מ&quot;ל של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 50 מ&quot;ל צינורות (3.4) ב 130 XG 3 דקות ב RT. לשאוב את המדיום ולמקם כל endoderm בצלחת תרבות 6 ס&quot;מ בעזרת פיפטה. הוסף פתרון collagenase 1 מ&quot;ל ל צלחת תרבות זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את endoderm שנאספו 2 עוברים שליו עם זוג מספריים מעוקל עד לגודל של כל פרוסה הוא כ 2 עד 3 מ&quot;מ. השתמש טפטף, לאסוף את כל הפרוסות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר יחד עם 9 מיליליטר של תמיסת collagenase הטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את הרקמה עם collagenase למשך 30 דקות באמבט מים רועד 37 מעלות צלזיוס ב 175 סל&quot;ד. עיכול חלקי זה עם collagenase משמש כדי לשפר את התפשטות תאי explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 130 XG 3 דקות ב RT בעדינות להסיר את החלק היחסי supernatant בעזרת פיפטה. שטפו את הכדור על ידי השעיית ב 20 מ&quot;ל DMEM ולהסיר את החלק היחסי supernatant לאחר צנטריפוגה 130 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את גלולה עם 12 מ&quot;ל של מדיום הגידול (DMEM / F12 עם 10% ו -1% NBCS PSA) וזרעי בעדינות שווה לתוך צלחת 24 גם (כל טוב עם 500 פתרון התא μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants רקמות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר במשך 2 ימים כדי לאפשר לתאים להתרבות מתוך הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 2 ימים נוספים ולאפיין עבור כדאיות התא על ידי פרוטוקול assay כדאיות התא. 15 הערה: תאי חיים לשמור על סביבת הפחתה בתוך cytosol. Resazurin, המרכיב הפעיל, הוא תרכובת חדירה רעילה, תא זה כחול בצבע הלא ניאון כמעט. כאשר נוספו בתרביות תאים, resazurin מצטמצם resorufin ב cytosol על ידי אנזימים המיטוכונדריה. Resorufin הוא בצבע אדום ניאון מאוד. תאים חיים להמיר ברציפות resazurin כדי resorufin, increasing הקרינה והצבע הכולל של מדיום תרבות תאים הסובבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בידוד RNA הכולל תא אפיתל endoderm, הפוכה שעתוק בזמן אמת PCR כמותי של ביטוי mRNA הגן סמן כמתואר. 16,17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש PCR transcriptase הפוך לזהות SOAT1 mRNA (במובן: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; antisense: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; PCR מוצר = 168 נ&quot;ב) כסמן ספציפי עבור תאי EEC. השתמש β-תקטין mRNA (במובן: 5&#39;- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; antisense: 5&#39;- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; מוצר PCR = 151 נ&quot;ב) כמו גן משק ובקרה פנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ג&#39;ל אלקטרופורזה כדי לזהות את גודל המוצר של RT-qPCR. כן 1% ג&#39;ל agarose, ומערבב 10 μl מוצר qPCR עם צבע טעינה 2 μl. תערובת טען 10 μl היטב לתוך כל אחד בתוך הג&#39;ל agarose 1%, ולהפעיל את הג&#39;ל על ידי 100V במשך 30 דקות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review.">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li><li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells.">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li><li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age.">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A:+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane,+liver,+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys.">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+(Meleagridis+gallopavo)+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development.">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li><li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac.">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li><li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development.">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li><li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken.">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li><li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo.">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li><li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick.">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li><li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens.">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li><li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos.">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations.">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).</li><li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3&#946;/&#946;-Catenin+signaling+in+mice.">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3&#946;/&#946;-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li></ol>

There is no competing financial interests or other conflicts of interest. We did not get any funding from any private company.

כיוון שמערכת התרבות הקודמת יש הצלחה מוגבלת בלבד, מערכת התרבות טוב יותר הוא זקוק. Endoderm YSM שליו יפני נזקק לטיפול אנזימים מפרקי חלבונים כגון collagenase כדי לשחרר את הצמתים תאים תאים כדי להשיג ביצועים לצמיחה טובה יותר של explants-vivo לשעבר. הנתונים שלנו מראים כי מספרים סלולריים מטיפול עיכול חלקית היו גדולים יותר מן תרבות רקמות המעוכלת לאחר זריעת 2 ימים (איור 1). לכן, עיכול פרוטאוליטים חלקית הוא שלב קריטי כדי לשפר את תשואת תא מן YSM. השינוי הקריטי פרוטוקול התרבות הנוכחי הוא אכול פרוטאוליטים חלקית. טיפול זה משופר תשואת התא מאוד והשיעור המוצלח של קבלת EECS החי. שעת העיכול היא קריטית מאוד כי יתר עיכול יפריד תאים מהרקמות ותאים לא לצרף צלחת, בעוד שלפי עיכול הביא תשואת תא פחות מןexplants רקמות. מצאנו כי 30 עד 40 עיכול דקות באמצעות התנאים שתוארו לעיל הוא אופטימלי. הפרוטוקול הנוכחי דורש הכשרה טכנית גבוהה כדי להשיג EECS. נקודת הזמן של איסוף EECS מוגבלת, למשל, אנחנו רק לאסוף EECS ביום עוברי 5. הסיבה לכך היא כמו עוברי עופות גדלים, הקשרים בין שכבות בקרום צק חלמון מורכבים יותר זה מקטין את השיעור המוצלח של איסוף EECS. הפרוטוקול יכול לשמש כדי להשיג EECS של בעוברים בראשית התפתחותם, אך לא עוברים שלב מאוחר. זה מגביל את האפשרות של מחקר הישיר על EECS בשלב מאוחר. הביטוי של SOAT1 וטריפז ליפופרוטאין, וצבירת שומנים הם מאפיינים מהותיים של 4,5,11 YSM, ובמיוחד EECS. במחקר הנוכחי, SOAT1, LPL, ו perilipin 2 (PLN2) mRNA התבטאו ביותר ב EECS, דבר המצביע על מערכת התרבות יכול לייצר תאים עם charact הפיזיולוגי הנכוןeristics. הטכניקה הנוכחית פיק כמות גדולה של EECS העיקרי. כאשר השתמשנו ההליך המתואר הקודם 9, שיעור ההצלחה של תרבות EEC עמד על כ -60% צלחות תרבית תאים של 24 גם, ואילו הפרוטוקול הנוכחי שנוצר EECS כמעט 100% אחוזי הצלחה. קרום שק החלמון הוא הרקמה העיקרית לקלוט חלבונים, שומנים, כולסטרול מן החלמון, ובכך לתפקד להעביר חומרים מזינים מן החלמון עוברי במהלך הפיתוח. האנזים העיקרי להיווצרות אסתר כולסטרול הוא SOAT1. 11 בגלל SOAT1 מגדיל באופן דרמטי בשלבים המאוחרים של ההתפתחות העוברית העופות כאשר esterification כולסטרול מאסיבי מתרחש 4, השתמשנו בביטוי mRNA SOAT1 כמו הגן סמן להערכת מאפייני EECS תרבותי. הראינו כי מערכת התרבות EEC הראשוני הזה הופק צפוי מאפיינים פיזיולוגיים. לכן, מערכת תרבות EEC יכולה להיות כלי רב ערך כדי ללמוד embryonתחבורה השומנים ic ולהבהיר את התפקיד של גנים המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות.

המשאב התזונתי העיקרי של עובר העופות הוא חלמון, מורכב 33 שומני%, 17% חלבון, ו -1% אפר. 1 במהלך התפתחות עוברית, קרום צק חלמון (YSM) גדל מתוך חלל הבטן העוברי ובהדרגה מכסה את החלמון משטח. החל ביום עוברי 2, ביטוי גנים הקשורים לחילוף חומרי אנגיוגנזה שומנים הוא גדל בהדרגת YSM, ואת YSM מתפתחת לאט תחזיות סיסיות דמויות. 8,9 תחזיות אלו להגדיל ספיגת מזון בגוף חלמון לתמוך התפתחות עוברית. YSM הוא רקמת extraembryonic המכיל שלוש שכבות הנבט, האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם. 14 האאקטודרם שק חלמון פונה חלבון וקישורים עם קרום vitelline כדי לכסות את שק החלמון בעדינות. לתאי האפיתל endodermal מתמודדים ישירות לעבר חלמון ביצה ולשמש פורטלים ניצול מזין. 6 ככל YSM מתרחב, תא אפיתל endodermal (EECS) ניתן לחלק ידי shapדואר ופונקציונלי לשתי קבוצות, vitelline האזור והאזור vasculosa. 7 vitelline פינת מורכב של תאים endodermal והוא רחוק מן העובר; vasculosa באזור מורכב של תאי mesodermal ומכסה EECS בדיל עם כלי דם ורקמות חיבור. על ידי עוברי יום 5, החלמון מכוסה לחלוטין על ידי האאקטודרם ו endoderm של YSM ואזור וסקולרית גדל בקצב מהיר. YSM סופג, גורם לבנייה מחדש ומשחרר שומנים (כמו החלמון נגזר ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד) וחלבונים לתוך מערכת הדם העוברית. 9, 2 לכן, הקימו מערכת תרבית תאי אפיתל endodermal עוברית שליו יפנית עיקרית, כדי לחקור את המנגנונים של שומנים הנצילות YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות. ליפידים כגון triacylglycerol, לציטין, פוספוליפידים ואסתר כולסטרול (CE) הם מקורות האנרגיה העיקריים עוברות עופות. בשלבים המוקדמים של פיתוח, שומני חלמון הם גomposed של CE 1.3% בלבד והוא עולה ל 10-15% ב אמצע הקדנציה של פיתוח 3 עובריים העופות, 11. אסתר כולסטרול הוא מסונתז מכולסטרול על ידי 1-acyltransferase O sterol (SOAT1) ב YSM העובר העופות. 4 צורת האחסון של כולסטרול היא CE, CE מתבצעת ליפופרוטאינים, ו ליפופרוטאינים מועברים על ידי מחזור דם לרקמות. 13 שבוע לפני הצוהר יש צמיחה מהירה של עוברי עופות. כ -68% מתוכן השומנים שנותר חלמון נספגים בשלב זה. 10 המנגנון שבאמצעותו חלמון שומנים מנוצלים ניתן לברר באמצעות מודל מחקר EEC. פרוטוקול תרבות עוף EEC הוקם כדי להשיג את מטרה במחקר זה. 2, 9 עם זאת, עקב שיעור ההצלחה הנמוך של explants רקמות, הליך תרבית תאים משופר EEC נדרש כדי ללמוד את הפונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי עופות במהלך פיתוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="845">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12800-017 10 X 1 L</td>
			<td style="width:167px;">For wash the EECs pellets</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">D-MEM/F-12</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12400-024 10 X 1 L</td>
			<td>As the basal medium in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">NBCS</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">16010-159</td>
			<td>As the supplyment serum in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Pen-Strep Ampho. Solution</td>
			<td style="width:199px;">BI (Biological Industries)</td>
			<td style="width:148px;">03-033-1B 100ml</td>
			<td>For attenuating the possible infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Collagenase Type IV</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">17104-019 1g</td>
			<td>&#160;Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">24 well plate</td>
			<td style="width:199px;">FALCON&#174;</td>
			<td style="width:148px;">REF-353047</td>
			<td>For EECs to attach and extension</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">50 ML PP centrifuge tubes</td>
			<td style="width:199px;">Corning&#174; CentriStarTM</td>
			<td style="width:148px;">430829</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">50ML Conical bottomed Tube with Cap</td>
			<td style="width:199px;">PRO TECH</td>
			<td>CT-50-PL-TW</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Reciprocal shaking bath</td>
			<td>DEAGLE</td>
			<td style="width:148px;">SB302</td>
			<td>For better enzymatic digestion on membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary endodermal epithelial cell culture from the yolk sac membrane of japanese quail embryos

הקמנו מודל תרבית תאים endodermal אפיתל (EEC) ללימוד פונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי העופות במהלך הפיתוח. ביצי שליו יפניות מופרות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים ולאחר מכן חלמון ממברנות צק (YSM) נאספו להקים מערכת התרבות EEC. בודדנו את שכבת endoderm העוברית YSM, וחתכתי את הממברנה לתוך 2 - 3 חתיכות מ&quot;מ ו מעוכל חלקית עם collagenase לפני זריעת צלחות תרבות 24 גם. EECS להתרבות מתוך הרקמה והם מוכנים ללימודי תרבית תאים. מצאנו כי EECS היו מאפיינים טיפוסיים של YSM in vivo, למשל, הצטברות של טיפות השומנים, ביטוי sterol O-acyltransferase וטריפז השומנים בדם. טיפול עיכול חלקי גדיל משמעותי את השיעור המוצלח של תרבות EEC. ניצול EECS, הראינו כי הביטוי של SOAT1 הוסדר על ידי ד cAMPחלבון ependent kinase מסלול רציף קשור. מערכת תרבות EEC שליו היפנית העיקרית זהו כלים שימושיים ללמוד תחבורת שומנים עוברית להבהיר את התפקיד של גני המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך התפתחות עוברית עופות.

על מנת להשיג את המטרה של הקמת מודל תא עקבי ושימושי, אנחנו צריכים להרחיב ולייצב את קצב ההתפשטות וביצועים של EECS עופות. השווינו דגירה ישירה של endoderm ללא עיכול אנזים עם endoderm מעוכל חלקית עם אנזימים פרוטאוליטים, כגון collagenase או collagenase בתוספת 0.6 U של dispase. Dispase הוא-endopeptidase אמינו hydrolyzes אג&quot;ח פפטיד N- מסוף של שאריות חומצת אמינו לא-קוטביות. בעוד טיפולי עיכול פרוטאז גדלו התפשטות תאים בהשוואה להעדר עיכול (איור 1), צמיחת תאים לא הייתה שונה במידה ניכרת בין שני טיפולי האנזים לאחר דגירת חמש ימים (איור 2). עם זאת, טיפול collagenase הביא עקומת צמיחה טובה והראה כי EECS התרבה ​​בהתמדה במשך 6-9 ימים (איור 2). לכן, עיכול collagenase חלקית שיפור צמיחה של EECS מןלשעבר vivo explants והוא מומלץ להשיג EEC מספיק ופונקציונלי. לאחר דגירה 4 ימים, היה EECS הופעה adipocyte דמוי זוהה לאחר קיבוע בפורמלין שמן-האדום מכתים O (איור 3), מה שמרמז על מאפיינים פיזיולוגיים הנכון של תאים בתרבית. החוקרים שיערו כי monophosphate אדנוזין מחזורית (cAMP) הוא סוכן רגולטוריות שעתוק, מעכב phosphodiesterase cAMP, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; להפחית השפלה של cAMP) ואת activator cyclase adenyl, forskolin (להגדיל סינתזה של cAMP) הן מגורה ביטוי mRNA SOAT1 לאחר 24 טיפול שע &#39;(איור 4). טיפולים אלה גם הגדילו את הביטוי של SREBP2, גורם שעתוק רגולטוריות יצור כולסטרול, ואת forskolin משופר הבעת perilipin-2 (PLIN2), O את סמן חלבון המשטחטיפות שומני f (איור 5). פרופילי mRNA EEC עבור גני lipogenic לכמת ידי PCR בזמן האמת דומים adipocytes (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig1.jpg" /> איור 1. השפעת עיכול Collagenase חלקית על תאי אפיתל Endodermal. Explants רקמות הודגרו במשך 2 ימים כדי לאפשר לתאים להתרבות מתוך הרקמה. צפינו וחשבנו את המספרים של EECS גדל בהצלחה. מספרים חושבו עבור תאים ללא עיכול ותאי מעוכלים חלקית עם collagenase; הן גדלו ב 24 גם הצלחות. ציר Y הוא מספר גם של EECS התרבו בהצלחה בצלחת תרבית תאים של היטב 24. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח נקבע על ידי מבחן t מזווג. P &lt;0.0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן</a>כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig2.jpg" /> איור 2. ביצועי צמיחת תאים של EECS לאחר עיכול אנזים חלקי. שיעור התפשטות זוהה על ידי assay כדאיות התא. את assay הכלול resazurin, תרכובת כחולה כי יש קרינה חלשה resazurin מצטמצם resorufin בכניסת תאים. תאים חיים ברציפות להמיר resazurin כדי resorufin, הגדלת הקרינה ואת הצבע הכללי של התקשורתי סביב התאים. תאי חיים התגלו על ידי ספיגה ב 570 ננומטר עם נורמליזציה ב 600 ננומטר. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח נקבעו על ידי דו כיוונית ANOVA עם Bonferroni שלאחר הבדיקה (קבוצת collagenase n = 10; collagenase + dispase קבוצת n = 11). * P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** p &lt;0.001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig2large.jpg" target="_blank">אנא CLI</a>CK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig3.jpg" /> איור 3. מורפולוגיה של מתורבתות EECS. לאחר דגירה 4 ימים, היה EECS הופעה adipocyte דמוי זוהה לאחר קיבוע בפורמלין שמן-אדום O מכתים. משמאל לימין: EEC של בתחום בהיר עם הגדלה 100X, בתחום בהיר עם הגדלה 200X ו בהגדלה 200X לאחר צביעה עם O ו hematoxylin שמן-אדום. הכתם הכהה בצד שמאל של הדמות השמאל הקיצוני הוא endoderm מעוכל חלקית (ממברנה). סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig4.jpg" /> איור 4. טרנס SOAT1cription של EECS נידון cAMP מטהרים. התייחסו EECS עם ריכוז גדל והולך של IBMX או forskolin ביום 5 למשך 24 שעות. שחילצנו mRNAs מתאי שטופלו והמיר את RNA לתוך cDNA על ידי שעתוק לאחור PCR. ניתחנו רמות שעתוק על ידי PCR כמותי בזמן אמת. β-תקטין שמש גן המשק. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח היו ידי ANOVA חד כיווני עם שלאחר הבדיקה של Tukey (n = 6) (* 0.05 P≤, ** 0.01 P≤). IBMX הוא מעכב phosphodiesterase nonselective תחרותי אשר מעלה cAMP תאיים, מפעיל PKA, מעכב TNF-Alpha וסינתזה leukotriene, מפחית דלקת חסינות מולדת והוא אנטגוניסט לקולטן לאדנוזין לא סלקטיבי. Forskolin הוא מפעיל בכל מקום של cyclase adenylyl איקריוטיים, נפוץ להעלות רמות של cAMP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של figu זה</a>מִחָדָשׁ. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig5.jpg" /> איור 5. ביטויי mRNA של Grown של EEC במשך חמישה ימים, ואז טפלו עם cAMP מטהרים למשך 24 שעות. את cDNA של באיור 4 שמשו לנתח רמות ביטוי גנים על ידי בזמן אמת PCR כמוני. β-יקטין שמש גן המשק ושמש הבקרה הפנימית. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. ניתוח היו ידי ANOVA חד כיווני עם שלאחר הבדיקה של Tukey (n≤ 6) כדי להשוות טיפולים לשליטה. SREBP2, אלמנט מחייב רגולטוריות sterol חלבון 2; LPL, lipase ליפופרוטאין; PLIN2, perilipin-2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos at JoVE.com

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Views.  National Taiwan University. To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Video: Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...