O financiamento para o desenvolvimento de protocolo atual é particularmente apoiada por &quot;Aim para o Plano Universidade Top&quot;, da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan (concessão ID-104R350144), bem como o Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (ID concessão: a maioria dos 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente o Centro de Biotecnologia da Universidade Nacional de Taiwan para fornecer uma sala de animais e espaço de laboratório para o estudo atual.

NOTA: Este procedimento é uma modificação de um protocolo de cultura modelo de galinha desenvolvido por Bauer et al 2013 e Nakazawa et al, 2011. 2,9.. 1. Prepare Healthy Embryonic Dia 5 embriões de codorniz japonesa <ol><li> Coloque 1 do sexo masculino e 3 do sexo feminino sexualmente maduros codornas japonesas juntos na mesma gaiola. Alimentação de alimentação e água ad libitum. Ajustar a luz na sala de animal para 14 horas de luz e 10 horas de escuridão. </li><li> Recolher os ovos fertilizados em sacos de plástico a cada dia no período da tarde e mantê-los em um 16 ° C geladeira para retardar a taxa de crescimento dos embriões. </li><li> Após recolha de um número suficiente de ovos dentro de um período de duas semanas, incubar os ovos fertilizados de uma incubadora a 37 ° C com bom arejamento durante cinco dias. </li></ol> 2. Prepare Basal Médio e soluções de lavagem <ol><li> Use DMEM / F-12 (ajustado a pH 7,2) como meio de crescimento, e completá-locom o novo 10% de soro vitelo recém-nascido (NBCS) e 1% de Pen-Strep Ampho. Solução (PSA; penicilina, 10 5 unidades / L; estreptomicina, 100 mg / l; anfotericina B, 0,25 mg / L). </li><li> Preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração 10x para o armazenamento; usar a solução 1x PBS (contendo NaCl, 137,93 mM; KCl, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; acertar a pH 7,2) para lavar e umedecer o tempo membrana saco vitelino separação da endoderme de gema de ovo e albumina. </li><li> Use meio DMEM (ajustado para pH 7,2) para re-suspender as pelotas endoderme. </li></ol> 3. Recolha de EECS primária de japoneses codorniz YSMs <ol><li> Incubar os ovos recolhidos durante 5 dias (passo 1.3). Examine os ovos por um candler ovo para confirmar o desenvolvimento embrionário normal. NOTA: No dia embrionário 5, o limite da YSM mesoderme é muito clara e as 3 camadas embrionárias são menos bem-ligados entre si, por isso é fácil de obendoderme Tain. Utilize apenas os ovos que apresentem o desenvolvimento normal circulação capilar para coleções YSM. </li><li> Limpar a casca de ovo com cuidado usando água doce e 75% de etanol. Abra a casca de ovo a partir da posição das células de ar por um par de tesouras, descascar delicadamente fora e recolher toda a YSM por uma pinça e coloque em um prato de cultura 10 centímetros preenchido com 37 ° C 1x PBS. </li><li> Utilizando um par de tesouras remover o embrião, gema e clara de ovo, e lavar cuidadosamente o YSM com 1x PBS três vezes e colocar YSM em solução de PBS numa placa de cultura de 10 cm. </li><li> Use uma pinça e um par de tesouras para remover o ectoderme de YSM. Use 2 fórceps, um para segurar firmemente a camada de células endoderme, e a outra para segurar o mesoderme capilar. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, separar e separar a endoderme a partir da borda da mesoderme em direcção ao embrião. Recolhe-se o endoderme amarelo claro em 50 ml de tubos de centrífuga usando um conta-gotas e o lugar em 15 ml de meio de crescimento numa Wat 37 ° Cbanho er até que todas as coleções de tecidos estão concluídas. </li></ol> 4. A digestão do Endoderma fatias por digestão de colagenase <ol><li> Recentemente dissolver 6,5 unidades de colagenase tipo IV em 10 ml de DMEM. </li><li> Centrifugar os tubos de 50 ml (3,4) a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o meio e colocar toda a endoderme em uma placa de cultura de 6 centímetros, usando uma pipeta. Adicionar solução de colagenase 1 ml a esta placa de cultura. </li><li> Cortar a endoderme recolhidos a partir de 2 embriões de codorniz com um par de tesouras curvas até que o tamanho de cada fatia é de aproximadamente 2 a 3 mm. Usar um conta-gotas, recolher todas as fatias para um tubo de centrífuga de 50 ml, juntamente com 9 ml de solução de colagenase fresco. </li><li> Digerir o tecido com colagenase durante 30 minutos num banho de água com agitação a 37 ° C a 175 rpm. Esta digestão parcial com colagenase é utilizado para melhorar a proliferação de células dos explantes. </li><li> Centrifugar a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e suavemente remover a fracção do sobrenadante utilizando uma pipeta. Lava-se a pelete por suspensão em 20 ml de DMEM e remover a fracção do sobrenadante após a centrifugação de 130 x g durante 3 min. </li><li> Re-suspender o sedimento com 12 ml de meio de crescimento (DMEM / F12 com 10% de NBCS e 1% de PSA) e sementes suavemente e igualmente numa placa de 24 poços (cada poço uma solução de células com 500 ul). </li><li> Incubar explantes de tecido a 37 ° C em 5% de CO 2 em ar durante 2 dias para permitir que as células a proliferar para fora dos tecidos. </li><li> Incubar as células por mais 2 dias e caracterizar quanto à viabilidade celular por um protocolo de ensaio de viabilidade celular. 15 NOTA: Living células manter um ambiente de redução dentro do citoplasma. Resazurina, o ingrediente activo, é, de um composto não-tóxico permeável célula que é azul em cor e virtualmente não fluorescente. Quando adicionado a culturas de células, a Resazurina é reduzida a resorufina no citosol por enzimas mitocondriais. Resorufina é de cor vermelha e altamente fluorescente. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina a resorufina, increasing a fluorescência global e cor do meio de cultura de células circundante. </li><li> Realizar endoderme célula epitelial de isolamento de ARN total, a transcrição e quantitativa PCR em tempo real de expressão de ARNm de gene marcador reversa como descrito 16,17. <ol><li> Use de PCR de transcriptase reversa para detectar SOAT1 ARNm (sentido directo: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; anti-sentido: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; produto de PCR = 168 pb) como um marcador específico para as células CEE. Use β-actina de ARNm (sentido directo: 5&#39;-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; anti-sentido: 5&#39;-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; produto de PCR = 151 pb), como um gene de manutenção e o controlo interno. </li><li> Use electroforese em gel para detectar o tamanho do produto de RT-qPCR. Prepare 1% de gel de agarose, e misturam 10 jil do produto qPCR com 2 ul de corante de carga. Carga de 10 ul de mistura em cada poço em gel de agarose a 1%, e executar o gel por 100V durante 30 minutos. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review.">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li><li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells.">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li><li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age.">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A:+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane,+liver,+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys.">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+(Meleagridis+gallopavo)+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development.">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li><li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac.">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li><li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development.">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li><li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken.">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li><li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo.">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li><li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick.">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li><li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens.">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li><li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos.">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations.">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).</li><li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3&#946;/&#946;-Catenin+signaling+in+mice.">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3&#946;/&#946;-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li></ol>

There is no competing financial interests or other conflicts of interest. We did not get any funding from any private company.

Uma vez que o sistema de cultura anterior tem apenas um sucesso limitado, é necessário um sistema de cultura melhor. A endoderme codornizes YSM japonesa requer tratamento com enzimas proteolíticas tais como a colagenase para soltar as junções célula-célula para alcançar um melhor desempenho do crescimento nos explantes ex-vivo. Os nossos dados mostram que o número de células de tratamento digestão parcial foi maior do que a partir da cultura de tecido não digerido após a sementeira, durante 2 dias (Figura 1). Portanto, a digestão proteolítica parcial é um passo crítico para aumentar o rendimento de células a partir do ADM. A modificação crítica na cultura protocolo actual é a digestão proteolítica parcial. Este tratamento melhorou substancialmente o rendimento celular e a taxa de sucesso de obtenção EECS vivo. O tempo de digestão é muito crítico, porque o excesso de digestão vai separar as células do tecido e as células não irá anexar à placa, enquanto sub-digestão resultou em menor produção de células doexplantes de tecido. Verificou-se que 30 a 40 min de digestão utilizando as condições descritas acima é óptima. O protocolo atual exige uma formação de alto nível técnico para obter EECS. O ponto de tempo da recolha EECS é limitado, por exemplo, apenas recolhe EECS no dia embrionário 5. A razão é que, como embriões de aves crescem, as ligações entre as camadas na membrana vitelina são mais complexos e diminui a taxa de sucesso de recolha EECS. O protocolo pode ser usado para obter EECS de embriões em estágio inicial, mas não de embriões em estágio final. Isso limita a possibilidade de pesquisa direta sobre os EECS fase tardia. A expressão de SOAT1 e lipoproteína lipase, acumulação de lípidos e são características essenciais da YSM 4,5,11, especialmente o EECS. No estudo atual, SOAT1, LPL e perilipin 2 (PLN2) mRNA foram expressos altamente na EECS, sugerindo que o sistema de cultura pode gerar células com o charact fisiológica corretaeristics. A técnica corrente produzida uma grande quantidade de EECS primárias. Quando foi utilizado o procedimento descrito anterior 9, a taxa de sucesso da cultura CEE foi de aproximadamente 60% ​​em placas de cultura celular de 24 poços, enquanto que o protocolo de corrente gerada EECS na taxa de sucesso de quase 100%. membrana saco vitelino é o tecido principal para absorver as proteínas, lípidos e colesterol a partir de gema, funcionando, assim, a transferência de nutrientes a partir de gema de embriões durante o desenvolvimento. A principal enzima para a formação de éster de colesterol é SOAT1. 11 Porque SOAT1 aumenta drasticamente nos últimos estágios do desenvolvimento embrionário das aves quando maciça esterificação do colesterol ocorre 4, usamos a expressão do mRNA SOAT1 como o gene marcador para avaliar as características do EECS cultivadas. Nós demonstramos que este sistema de cultura CEE primário produzido esperado características fisiológicas. Portanto, o sistema de cultura CEE pode ser uma ferramenta valiosa para estudar embriãotransporte lipídico ic e clarificar o papel dos genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

O recurso principal nutricional do embrião aviário é gema, composto de 33% de lípidos, proteínas 17%, e 1% de cinzas. 1 durante o desenvolvimento embrionário, a membrana vitelina (YSM) cresce a partir de dentro da cavidade abdominal embrionário e cobre gradualmente a gema superfície. Começando no dia embrionário 2, a expressão de genes associados com o metabolismo dos lípidos e a angiogénese é gradualmente aumentada em YSM, e o YSM desenvolve lentamente projecções das vilosidades semelhantes. Estas projecções 8,9 aumentar a absorção de nutrientes gema para suportar o desenvolvimento embrionário. O YSM é um tecido extra-embrionário que contém três camadas germinativas, endoderme, mesoderme e ectoderme. 14 do ectoderma saco vitelino enfrenta a clara e links com a membrana vitelina para cobrir suavemente o saco vitelino. As células epiteliais da endoderme são confrontados diretamente para a gema de ovo e servir como portais de utilização de nutrientes. 6 À medida que a ADM se expande, células epiteliais endodérmico (EECS) pode ser dividido por shape e funcionalidade em dois grupos, a área vitelínicas e vasculosa área. 7 vitelina área é composta por células da endoderme e está distante do embrião; vasculosa área é composta por células mesodérmicas e cobre EECS diferenciadas com vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos. Por dia embrionário 5, a gema é totalmente coberta por ectoderma e endoderma de YSM ea área vascular tem crescido rapidamente. O YSM absorve, recompõe e liberta lípidos (como-gema derivado lipoproteína de muito baixa densidade) e proteínas no sistema circulatório embrionário. 9, 2 Assim, foi estabelecido um embrionário sistema de codorniz japonesa primária endodérmica epitelial de cultura de células, para estudar os mecanismos de lípido utilização em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária. Os lípidos tais como triglicerídeos, lecitina, de fosfolípidos e ésteres de colesterol (CE) são as fontes de energia primárias para embriões de aves. Nas fases iniciais de desenvolvimento, lípidos da gema são Composed de apenas 1,3% do CE e ele sobe para 10-15% a meio do período de desenvolvimento embrionário aviária 3, 11. éster de colesterol é sintetizado a partir do colesterol, esteróis O-aciltransferase 1 (SOAT1) em YSM embrião aviária. 4 A forma de armazenamento de colesterol é CE, CE é realizada nas lipoproteínas e lipoproteínas são transportados pela circulação para os tecidos. 13 Uma semana antes escotilha há um crescimento rápido dos embriões de aves. Aproximadamente 68% do conteúdo de lípidos restantes na gema são absorvidos durante esta fase. 10 O mecanismo pelo qual a gema de lípidos são utilizados pode ser clarificada por um modelo de pesquisa CEE. Um protocolo de cultura de frango CEE foi estabelecido para atingir este objectivo de pesquisa. 2, 9 No entanto, devido à baixa taxa de sucesso de explantes de tecidos, um processo de cultura de células CEE melhorada é necessária para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de a utilização de nutrientes pelos embriões de aves durante o desenvolvimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="845">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12800-017 10 X 1 L</td>
			<td style="width:167px;">For wash the EECs pellets</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">D-MEM/F-12</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12400-024 10 X 1 L</td>
			<td>As the basal medium in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">NBCS</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">16010-159</td>
			<td>As the supplyment serum in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Pen-Strep Ampho. Solution</td>
			<td style="width:199px;">BI (Biological Industries)</td>
			<td style="width:148px;">03-033-1B 100ml</td>
			<td>For attenuating the possible infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Collagenase Type IV</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">17104-019 1g</td>
			<td>&#160;Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">24 well plate</td>
			<td style="width:199px;">FALCON&#174;</td>
			<td style="width:148px;">REF-353047</td>
			<td>For EECs to attach and extension</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">50 ML PP centrifuge tubes</td>
			<td style="width:199px;">Corning&#174; CentriStarTM</td>
			<td style="width:148px;">430829</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">50ML Conical bottomed Tube with Cap</td>
			<td style="width:199px;">PRO TECH</td>
			<td>CT-50-PL-TW</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Reciprocal shaking bath</td>
			<td>DEAGLE</td>
			<td style="width:148px;">SB302</td>
			<td>For better enzymatic digestion on membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary endodermal epithelial cell culture from the yolk sac membrane of japanese quail embryos

Nós estabelecemos um modelo de cultura de células epiteliais endodérmico (CEE) para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de utilização de nutrientes por embriões de aves durante o desenvolvimento. Fertilizados ovos de codorniz Japonesa foram incubadas a 37 ° C durante 5 dias e, em seguida, yolk sac membranas (YSM) foram recolhidas para se estabelecer o sistema de cultura de CEE. Isolamos a camada endoderma embrionário de YSM, e cortado da membrana em 2 - 3 mm pedaços e parcialmente digerido com colagenase antes de semear em placas de cultura de 24 poços. O EECS proliferam para fora do tecido e estão prontos para os estudos de cultura de células. Descobrimos que o EECS tinha características típicas de YSM in vivo, por exemplo, acúmulo de gotículas lipídicas, expressão de esteróis O-aciltransferase e lipoproteína lipase. O tratamento a digestão parcial aumentou significativamente a taxa de sucesso da cultura CEE. Utilizando o EECS, foi demonstrado que a expressão de SOAT1 foi regulado pelo AMPc dproteína quinase ependent Um caminho relacionado. Este sistema de cultura de codorna japonesa CEE primária é uma ferramenta útil para estudar o transporte de lipídios embrionário e para esclarecer o papel de genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

A fim de alcançar o objetivo de estabelecer um modelo de celular consistente e útil, nós precisamos de alargar e estabilizar a taxa de proliferação e desempenho dos EECS aviária. Comparamos a incubação directa da endoderme sem digestão com enzima endoderme parcialmente digerido com enzimas proteolíticas, tais como colagenase ou colagenase mais 0,6 L de dispase. Dispase é um amino-endopeptidase que hidrolisa as ligações peptidicas N-terminais de resíduos de aminoácidos não-polares. Considerando que os tratamentos de digestão da protease do aumento da proliferação celular em comparação com nenhuma digestão (Figura 1), o crescimento celular não foi significativamente diferente entre os dois tratamentos enzimáticos após cinco dias de incubação (Figura 2). No entanto, o tratamento com colagenase resultou em uma melhor curva de crescimento e mostraram que EECS proliferaram de forma constante durante 6-9 dias (Figura 2). Assim, a digestão de colagenase parcial o aumento do crescimento de EECS doexplantes ex-vivo e é recomendado para obter CEE suficiente e funcional. Após 4 dias de incubação, tinham uma aparência EECS-adipócito como detectada após fixação em formalina e óleo vermelho-ó coloração (Figura 3), sugerindo características fisiológicas correcção das células cultivadas. Colocámos a hipótese de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é um agente de transcrição reguladora, o inibidor de fosfodiesterase AMPc, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX; para diminuir a degradação do AMPc) e o activador de adenilciclase, forscolina (para aumentar a síntese de cAMP) tanto estimulada a expressão de ARNm SOAT1 após 24 horas de tratamento (Figura 4). Estes tratamentos também aumentou a expressão de SREBP2, um factor de transcrição regulador da síntese de colesterol, e forscolina aumentou a expressão de perilipin-2 (PLIN2), a superfície de marcador de proteína Sf gotículas de lípidos (Figura 5). Os perfis de mRNA de genes CEE lipogênicas quantificados por PCR em tempo real são semelhantes aos adipócitos (Figura 5). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig1.jpg" /> Figura 1. Efeito de digestão parcial de colagenase em células endodérmicas epitélio. Explantes de tecido foram incubadas durante 2 dias para permitir que as células a proliferar para fora do tecido. Observamos e calculou os números dos EECS cultivadas com sucesso. Números foram calculados para células sem células digestão e parcialmente digerido com colagenase; ambas foram cultivadas em placas de 24 poços. O eixo dos Y é o número do poço EECS proliferaram com sucesso em placa de cultura celular de 24 poços. Os dados foram apresentados como média ± SEM. Análise foram determinadas pelo teste t emparelhado. P &lt;0,0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig2.jpg" /> Figura 2. O desempenho da célula Crescimento de EECS Após parcial digestão enzimática. A taxa de proliferação celular foi detectada por ensaio de viabilidade celular. O ensaio continha resazurina, um composto azul que tem fluorescência fraca e resazurina é reduzido a resorufina ao entrar em células. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina para resorufina, aumentando a fluorescência geral ea cor dos media células circundantes. As células viáveis ​​foram detectados por absorvância a 570 nm com normalização a 600 nm. Os dados foram apresentados como média ± SEM. Análise foram determinados por ANOVA de duas vias com Bonferroni pós-teste (colagenase grupo n = 10; colagenase + dispase grupo n = 11). * P &lt;0,05, ** P &lt;0,01, *** P &lt;0,001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig2large.jpg" target="_blank">Por favor cli</a>ck aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig3.jpg" /> Figura 3. A morfologia do Cultivadas EECS. Após 4 dias de incubação, EECS tinha uma aparência adipócito-like detectado após coloração fixação formalina e Oil-O vermelho. Da esquerda para a direita: CEE do no campo brilhante com ampliação de 100X, no campo luminoso, com uma ampliação de 200X e 200X após coloração com O Óleo-vermelho e hematoxilina. A mancha escura na esquerda da figura à esquerda é a endoderme parcialmente digerido (membrana). Barra de escala representa 200 m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig4.jpg" /> Figura 4. A SOAT1 Transcrição de EECS tratados com o acampamento de ativadores. Nós tratada EECS com concentrações crescentes de IBMX ou forskolin no dia 5, durante 24 horas. Foram extraídos os mRNAs a partir de células tratadas e convertido o ARN em ADNc por PCR de transcrição inversa. Foram analisados ​​os níveis de transcrição por PCR em tempo real quantitativo. β-actina foi utilizado como o gene de manutenção. Os dados foram apresentados como média ± SEM. As análises foram de one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (n = 6) (* p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01). IBMX é um inibidor da fosfodiesterase não selectivo competitiva o que aumenta o AMPc intracelular, activa PKA, inibe o TNF-alfa e a síntese de leucotrienos, reduz a inflamação e a imunidade inata e é um antagonista do receptor de adenosina não selectivo. Forskolin é um activador onipresente da guanilato ciclase eucariótica, comumente usado para elevar os níveis de cAMP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figu</a>ré. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53624/53624fig5.jpg" /> Figura 5. O ARNm de Expressões crescidas de CEE durante cinco dias, depois tratou-se com Activadores de cAMP durante 24 horas. O cDNA do na Figura 4 foram usados ​​para analisar os níveis de expressão de genes por PCR em tempo real quantitativa. β-actina foi utilizado como o gene de manutenção e serviu como o controlo interno. Os dados foram apresentados como média ± SEM. As análises foram por ANOVA de uma via com o pós-teste de Tukey (n≤ 6) para comparar os tratamentos com o controlo. SREBP2, esterol reguladora proteína 2 de ligação ao elemento; LPL, lipoproteína lipase; PLIN2, perilipin-2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53624/53624fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K visualizações.  National Taiwan University. To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...