Biz Jonatan Lucas besleyici hücre kültürü, Servei Estabulari de la UAB hayvan bakımı için ve Domènec video kayıt için Martín ile onun teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser "gayri resmi" de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R ve Generalitat de tarafından desteklenen Catalunya 2014 SGR-524. MVC PIF-UAB bursu yararlanıcı olduğunu.

Aşağıdaki bölümlerde açıklanan hayvanlar kullanımı etik Komite, hayvan ve insan araştırma Universitat Autònoma de Barcelona ve Departament d tarafından onaylanıp &#39; tarımsal, Ramaderia, Pesco ben Alimentació Generalitat de Catalunya (iletişim kuralı #8741).
 1. Besleyici hücre Inactivation ve depolama Not: insan sünnet derisi fibroblastlar (HFF-1) daha önce dondurulmuş dondurma çözüm oluşan % 90'ı Fetal sığır Serum (FBS) ve % 10 Dimetil sülfoksit (1 mL DMSO) ve sıvı azot kadar kullanmak saklı.
<ol><li>37 ° C su banyosu şişede çeker tarafından HFF-1 (1 mL) kriyojenik bir şişe çözülme.</li>
	<li>Kriyojenik şişeyi çözdürülen içeriğini eklemek için Önceden ısıtılmış Dulbecco &#39; s modifiye kartal &#39; s orta (DMEM) % 10 ile desteklenmiş bir 1:10 yapmak FBS seyreltme.</li>
	<li>Bir T75 şişesi seyreltilmiş hücreleri (10 mL) tohum ve 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de kültür.</li>
	<li>Ertesi gün DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için orta değiştirin. Orta kaldırmak ve 10 mL % 10 ile desteklenmiş Önceden ısıtılmış DMEM ekleyin FBS.</li>
	<li>HFFs kültür ve kültür Konfluent sahne ulaşıncaya kadar her 48 h orta değiştirin. Bu yaklaşık 7-10 gün sürebilir.</li>
	<li>İnactivation çözüm hazırlamak, mitomycin C DMEM % 10 ile desteklenmiş sulandırmak için 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon, FBS. 37 ° C ve % 5 CO 2 3 h için inactivation çözüm hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>İnactivation çözümü kaldırmak ve 2 mL, Hanks dengeli tuz çözüm (mitomycin C kalıntıları ortadan kaldırmak için HBSS) üç kez hücrelerle durulayın.</li>
	<li>Inaktif hücreleri ayırmak için 1 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO 2 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Gözlemlemek müstakil olduklarından emin olmak için ters bir mikroskop altında hücreler (0.3 sayısal diyafram veya NA ile 10 x amaç). Eğer değillerse, onları birkaç dakika 37 ° C ve % 5 CO 2 için kuluçkaya. Yine ters mikroskop altında hücreleri denetleyin.</li>
	<li>Hücre kümeleri ayırmak için bir Pasteur pipet ile çözüm pipette.</li>
	<li>%10 FBS ve resuspend ile DMEM 4 mL ekleyerek enzimatik solüsyona nötralize.</li>
	<li>Bir aliquot hücre süspansiyon take ve HBSS içinde 1: 100 seyreltme. Hücre sayısını belirlemek için bir Neubauer seyreltme 10 µL yük &#39; s odası. Bir büyük kareler Odası (20 x amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında yer alan hücreleri saymak.
	<ol><li>Tekrar dört büyük kareler toplamda sayma. N (N) hücrelerinin sayısı toplam hesaplamak hücreleri ortalama sayısı = toplam hacim seyreltme x 10 4 x x sayılan.</li>
	</ol></li> <li>200 x g. atma, 5 min için örnek kalan süpernatant santrifüj kapasitesi ve çözüm mL başına 10 6 hücre bir konsantrasyon, dondurma ile Pelet resuspend.</li>
	<li>Aliquot 10 6 hücre (1 mL) ile kriyojenik şişeleri süspansiyon. Kriyojenik şişeleri bir dondurucu kapsayıcısına getirin ve-80 dondurma ° C.</li>
	<li>Ertesi gün, kriyojenik şişeleri sıvı azot depolamak.</li>
</ol> 2. Besleyici hücre kültür <ol><li>1-4 gün türetme işlemine başlamadan önce tezcan 1 x 10 6 içeren bir kriyojenik şişe su banyosu 37 hücrelerde HFF-1 inaktive olur ° C.</li>
	<li>1:6 seyreltme çözdürülen HFF-1'in önceden %10 FBS ve tutmak sıcaklığı 37 ile takıma DMEM sıcak yapmak ° C.</li>
	<li>Her şey bir 4-şey plaka 500 µL Önceden ısıtılmış % 0,2 jelatin domuz deri ile doldurmak ve 10 dakika süreyle 37 ° C'de plaka tutmak</li>
	<li>Jelatin 500 µL kuyulardan kaldırın ve HFFs seyreltme 500 µL ekleyin. Yavaşça HFFs kuyu dibinde bir tekdüze dağılım sağlamak için plaka rock. Dairesel hareketleri önlemek, aksi takdirde hücreleri iyi merkezinde odaklanacaktır.</li>
	<li>En az 24 saat her iyi Inaktif HFFs monolayer elde etmek için 37 ° C ve % 5 CO 2 s plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün (10 X amacı ile 0.3 NA) ters bir mikroskop altında hücreler gözlemlemek ve bağlı ve homojen dağıtılmış kontrol edin. Orta DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için değiştirin. Orta kaldırın ve Önceden ısıtılmış DMEM % 10 ile desteklenmiş 500 µL ekleyin FBS.</li>
</ol> 3. Embriyo toplama ve kültür <ol><li>dört gün öncesine embriyo koleksiyonu, yönetmek hamile kısrak 5 IU &#39; s serum gonadotropin 6-12 hafta yaşlı kadın farelere mayi enjeksiyonla. 
	Not: diğer fare suşları kadın-ebilmek var olmak kullanılmış olsa biz 129S2 veya B6CFAF1 suşları, kadın kullandık. Yine de, ne zaman sigara keyfi suşları (örneğin CBA), kadın ile orta çalışma takıma 2i ile adım 4.2 belirtildiği gibi.</li>
	<li>Sonra 48 h, insan Korionik gonadotropin 5 IU mayi enjeksiyonu ile yönetmek ve kadın erkek, en az 8 haftalık bir 1:1 oranında, dostum. Dişiler erkeklerin ertesi gün ayırın.</li>
	<li>Embriyo koleksiyonu, önceki gün 35-mm hücre kültürü Petri kabına KSOMaag orta sığır Serum Albumin (BSA) 4 mg/mL ile desteklenmiş çeşitli 40 µL damlaları ile hazırlamak ve plaka tamamen damla kapsayacak şekilde mineral yağ ile doldurun. Orta equilibrate için 37 ° C ve % 5 CO 2 çanak kuluçkaya.</li>
	<li>Embriyo manipülasyon Pipetler, hazırlamak için ısı uzun uçlu cam Pasteur pipet Bunsen burner kullanarak ince parçası. Yumuşak bir kez alev geri çekilin ve iki ucu ayır. İstenilen uzunlukta kesin. İç çapı uç-meli var olmak 100-150 µm.</li>
	<li>Servikal çıkığı 45-48 h mesaj coitum tarafından (PC) kadın fareler ötenazi.</li>
	<li>Eğri pürüzsüz keskin makas ile cilt ve karın zarını düz keskin makas ile kesme ile karın boşluğu ortaya çıkarmak için fareler incelemek. Bir rahim Forseps ile kapmak, düz keskin makas kullanarak ovidukt keser ve CZB Hepes tampon orta (HCZB) 13 37 yerleştirir ° C. diğer ovidukt kaldırmak için yineleme işleminin.</li>
	<li>Oviducts 1 mL şırınga ile yüklenen HCZB ile flush 2 hücreli embriyo toplamak için saatçi forseps tarafından yerinde düzenlenen. 
	Not: 30 G Hipodermik İğne reçeteye göre sarf iğne almak hazırlamak için sonunda kesti ve zemin bir Zımpara taşı künt bir ipucu için.</li>
	<li>Embriyo çekme ağzını pipet aparatı kullanıyorsanız, içinde HCZB yıkama onları ve onları önceden hazırlanmış embriyo kültür tabağına 37 ° C ve % 5 CO 2 blastosist aşaması kadar kültür. En fazla 50 embriyolar her 40 µL düşüş kültürlü olabilir. İzlemek embriyo gelişimi her 24 saat bir stereomicroscope altında. 
	Not: Alternatif olarak, embriyoların blastosist aşamada vitro embriyo kültürü kısaltmak için toplanabilir. Bu durumda, dişiler gün 3.5-4.5 p.c. ötenazi, rahim incelemek. ve HCZB ile flush.</li>
</ol> 4. Kök hücre elde edilmesini <ol><li>hazırlık türetme plakaların <ol><li>embriyo tohum, gün hazırlamak türetme orta DMEM orta 100 µM 2-β mercaptoethanol, 1 ile ilave tarafından x sigara-esansiyel Amino asitler , serum değiştirme ve 10 %20 3 U/mL LIF.</li>
		<li>İsterseniz, ayrıca MEK inhibitörü PD0325901 1 µM ve 3 öneki GSK3 inhibitörü CHIR99021 2i orta elde etmek için µM.</li>
		<li>4-şey plaka Inaktif HFFs (Adım 2.6) monolayer ile al kuluçka makinesi. Orta kaldırın ve her şey için Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL ekleyin. Plaka da kuluçka için iade.</li>
	</ol></li> <li>Zona pelusida kaldırma ve tohum embriyo <ol><li>bir 35 mm hücre kültürü Petri kabına asit Tyrode üç 30 µL damla ile hazırlamak &#39; s çözüm 14 ve türetme orta üç 30 µL damla. Damla mineral yağ ile kapak ve 37, çanak tutmak ° C.</li>
		<li>Embriyo kültürü bulaşık kuluçka makinesi alın. Birer birer, bir asit Tyrode kültür damla blastokistlerin transfer &#39; s çözüm açılan bir embriyo manipülasyon pipet kullanarak. Mümkünse, yalnızca genişletilmiş blastokistlerin türetme işlemini başlatmak için seçin.</li>
		<li>Monitör zona pelusida sindirim stereomicroscope altında. En kısa zamanda zona pelusida kaybolur, blastosist asit Tyrode yıkamak için bir türetme orta damla transfer &#39; s çözüm.</li>
		<li>Kuluçka ve tohum bir zona ücretsiz blastosist Besleyici üzerinde 4-şey türetme plaka hücreleri her kuyuya atın.</li>
		<li>Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür 37 ° C ve % 5 CO 2 4-şey türetme plaka dönmek.</li>
	</ol></li> <li>İzleme kök hücre büyüme ve orta değiştirmek <ol><li>kültürler her 24 h (20 X amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında izlemek. Kök hücre farklılaşması, akıbet çevreleyen veya bile besleyici hücreler bir kenara iterek şişmiş refraktif hücreleri gibi belirtileri olup olmadığını unutmamak gerekir.</li>
		<li>Her gün, kültür ortamı değiştirin. 4-şey plaka kuluçka, orta her kuyudan çıkarmak alıp LIF ve 2i, Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL kullandıysanız ekleyin. Outgrowths (6-8 gün) gözlenir kadar kültürü korumak.</li>
	</ol></li></ol> 5. Kök hücre kültür ve bakım <ol><li>hazırla Kolle benzeri kolları ve kök hücre manipülasyon Pipetler. Takip adım kök hücre manipülasyon Pipetler ucundaki 250-300 µm. bir iç çapı ile hazırlamak için 3,4 Kolle benzeri tanıtıcı hazırlamak için çekti Pasteur pipet diğer parçası kullanın. Isı ve bir kanca almak kadar şekil.</li>
	<li>4-şey kültür plaka kuluçka makinesi dışarı almak ve bir stereomicroscope altında çıkıntı bulun. Farklılaşmış hücreler ve akıbet çevreleyen besleyiciler uzaklaştırmak için tutamacını kullanın. 
	Not: nihai sonucu farklılaşma önlemek için akıbet kenarından farklılaştırılmış hücrelerin tümünü kaldırmak öenmlidir.</li>
	<li>Yapılan bir kök hücre manipülasyon pipet ile Aspire edin ve yeni bir tabak içinde 50 µL tripsin-EDTA damla yerleştirebilirsiniz.</li>
	<li>Mekanik ve enzimatik disaggregate için çeşitli yerlerinde yapılan kesmek için bir neşter kullanın.</li>
	<li>Hemen, akıbet parçaları türetme orta tripsin eylem nötralize etmek için taze bir damla transfer.</li>
	<li>Çıkıntı parçaları besleyiciler monolayer ile yeni bir 4-şey plaka aktarın. İyi başına en çok 10 parça aktarmak ve onları türetme orta 37 ° C ve % 5 CO 2 ile kültür.</li>
	<li>Kurulan mESC satırı düşünmeden önce en az altı hafta için kök hücre benzeri kültürleri korumak. Her gün ve alt kültür orta değiştirmek onları haftada bir kez.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells:+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro.">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides.">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li><li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer.">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies.">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+support+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li><li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+and+techniques+for+mouse+embryonic+stem+cell+derivation+and+culture.">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li><li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells.">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li><li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+(ES)+cell+lines.">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li><li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency.">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

MESC satır türetme rutin olarak birçok laboratuvarlarda kullanılan iyi bilinen bir işlem olmakla birlikte, verimlilik her zaman pluripotency bakım rahatsız edemez Multipl faktörler nedeniyle beklendiği gibi yüksek değil. Mevcut makalede biz, adım adım, basit ve güvenilir bir iletişim kuralı kullanılarak yüksek verimliliği ile mESC satırları oluşturmak nasıl gösterir. Bu verimliliği literatürde bildirilen benzer.
Maksimum verimliliği sağlamak için hücreleri her gün kontrol etmek önemli ya da her geçen gün, zamanından beri belirtilen sadece açıklayıcı noktalarıdır. Bu hücre ölümü ve farklılaşma teşvik beri koloniler, büyüme önlemek için önemlidir. Bu da hücre canlılığı azaltabilir çünkü Ayrıca kendi alt kültür sırasında koloniler maruz tripsin-EDTA mümkün olduğu kadar azaltmak önemlidir.
Diğer önemli faktör besleyici hücreler kaynağıdır ve kültürlerini olmasıdır. Çeşitli çalışmalarda HFF, fare embriyonik fibroblastlar (MEF) ve fare STO fibroblastlar ESC türetme ve kültür15desteklemek aynı derecede mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, HFF vardır kültür16, MEF ve Tanrı'nın askerleri daha iki kat daha fazla dayanıklı kadar büyümeye mESC için daha fazla zaman tanıyacaktır. Böylece, ilave mESC altkültürler HFF kullanımını önler.
Elde edilen türetme verimliliği bildirdi Sonuçlar düşüktür, dikkatle tüm bileşenler türetme orta, özellikle serum yedek kontrol etmek önemlidir. Serum değiştirme farklı toplu işlemleri türetme verimliliği17,18önemli farklılıklar neden olabilir. Bu nedenle, her yeni toplu iş iş onun kullanılmadan önce test edilmelidir.
MESC türetme için bir kaynak türetme verimliliği de önemli ölçüde etkileyebilir gibi kullanılan embriyoların genetik arka işaret etmek önemlidir. Gerçekten de, fare suşları keyfi suşları (örneğin, 129S2 ve C57BL6) ve mESC çizgiler'in altında standart koşullar9,19verim yeteneğini göre (örneğin, CBA, NOD ve FVB) sigara keyfi suşları içine sınıflandırılmış. Kokteyl 2i türetme ortamda sigara keyfi suşları gelen embriyo ile çalışırken dahil olduğu sürece burada rapor iletişim kuralı başarıyla embriyolar için her iki farklı suşları arasında uygulanabilir. 2i orta pluripotency, bağımsız olarak genetik arka plan6sürdürmek için mESC satırlarının sinyal desen modüle yapabiliyor. Ana sınırlama, kültür20sırasında mESC hatları farklılaşma için dayanıklı hale 2i içinde kültürlü elde güçlü sinyal desen kaynaklanmaktadır. Bu sınırlamayı aşmak için mESC çizgiler olmadan önce alınan sinyal zayıflamaya farklılaşma indüksiyon en az bir geçiş için 2i kültürlü.
Genel olarak, bu iş sadece mümkün ve ana zorluklar ve nasıl bunların üstesinden işaret olarak olarak adımları göstererek mESC türetme pratiği dindirebilirim.

Embriyonik kök hücreleri (ESC) yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar1altında ayırt etmek için korumak Preimplantasyon embriyo elde pluripotent hücreler vardır. Bu özelliklere dayalı, ESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları2için yararlı bir araç olmuştur.
ESC den türemiş olan ilk kez fare ESC (mESC) hatları düşük başarı3,4ile kaynaklanan Preimplantasyon fare embriyo. Yıllardır, türetme verimliliği pluripotency içinde vitromuhafaza zorluğu nedeniyle düşük kaldı. Ayrıca türetme verimliliği artırmak, besleyici hücreler5' varlığı koloni eki tanıtmak ve karyotip istikrar6, birçok değişikliği bir iyileşme pluripotency bakım iletişim kuralı müşteri adayının geliştirmek. MESC kültür orta7,8, embriyo 129S2 keyfi arka plan9 kullanımı için en önemli yanı sıra, lösemi inhibitör faktörü (LIF) vardı ve mESC ile takıma orta ile Kültür tanımlanan serum, potansiyel farklılaşma ücretsiz10faktörler. Daha yakın zamanlarda, kanıt zorlayıcı bir kokteyl mESC kültür (2i da bilinir) orta sinyal yollar iki küçük molekül modülatörler ilavesi pluripotency korumak en iyi olduğunu göstermiştir. MEK inhibitörü farklılaşma sinyalleri mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) yolu engelleyerek azaltır, PD0325901 ve GSK3β inhibitörü hücre sağkalım, düşük yoğunluklu geliştirir CHIR99021 2i kokteyl oluşur Wnt yolu11etkinleştirerek.
Bugünkü yazıda, verimli bir şekilde mESC satırları fare blastokistlerin türetmek için basit bir protokol açıklar. Standart prosedürler, keyfi suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan türetme orta LIF ve serum yerine12ile gelen embriyo kültürü takip ediyoruz. Bu iletişim kuralı, mESC çizgileri takip verimliliği 2i ortamda elde edilen eşdeğer ile elde edilebilir. Buna rağmen 2i sigara keyfi suşları ile çalışırken pluripotency bakım veya olası sorunlardan kaçınmak için eklenebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1125">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">1 mL sryringe</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:141px;">309628</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">2-&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:263px;">Acidic Tyrode&#39;s solution&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&#186;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&#186;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:263px;">Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-21200</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &#945;SMA and AFP mouse antibodies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">CHIR990212</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1386</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CryoTube</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">3754518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">41640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>L0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&#186;C. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Flushing needle</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td>304000</td>
			<td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td>48724</td>
			<td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-11037</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">HBSS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">L0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Hepes-buffered CZB&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>See composition in Chatot et al, 1989</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Divasa-Farmavic</td>
			<td style="width:141px;">Veterin-Corion 3000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human foreskin fibroblasts</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:141px;">ATCCSCRC-1041</td>
			<td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td>&#160;10828-028</td>
			<td style="width:524px;">Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&#186;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">KSOMaag Evolve</td>
			<td style="width:199px;">Zenith Biotech</td>
			<td style="width:141px;">ZEKS-050</td>
			<td style="width:524px;">Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&#186;C and 5% CO2 a day prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:199px;">Merk Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:263px;">Mice&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Charles River/Harlan</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo tested. Photosensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:199px;">Serva</td>
			<td>2980501</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&#186;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse anti-tubulin &#946; III (Tuj1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:141px;">MMS-435P</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A5228</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-AFP</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">MAB1368</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti Oct3/4&#160;</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td style="width:141px;">Sc-5279</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">PD0325901</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1408</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (35mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (60mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Pregnant mare&#39;s serum gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Foligon</td>
			<td>Foligon-1000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Rabbit policlonal anti-Sox2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB5603</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">T75 falcon</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:141px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypsin-EDTA 10x</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">X0930</td>
			<td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

Fare embriyonik kök hücre (mESC) türetme tarafından hangi pluripotent Preimplantasyon embriyoların hücre hatları kurulur işlemidir. Bu satırları yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar altında ayırt etmek için korur. Bu özellikleri nedeniyle, mESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları yararlı bir araç vardır. Bu makalede mESC hatları yüksek türetme verimliliği (% 60-80) ile elde etmek için basit bir protokol blastokistlerin keyfi fare suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan tanımlanmış orta lösemi inhibitör faktörü ile takıma gelen Kültür tarafından açıklanır. Protokol Ayrıca verimli bir şekilde mESC satırları keyfi fare suşları türetmek için iki küçük molekül inhibitörleri türetme orta (2i orta) bir kokteyl basit eklenmesiyle uygulanabilir. Hazırlık ve besleyici hücreler, toplama ve fare embriyolar ve türetme kültür ve kültür mESC satırlarının kültür üzerinde ayrıntılı yordamlar sağlanmaktadır. Bu iletişim kuralı özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir laboratuvar temel memeli hücre kültür uzmanlığı ile yapılabilir.

Bu iletişim kuralı üzerinde kültür (şekil 1A) ilk hafta sonra sonucu oluşumu % 95'i elde edilmelidir. Altı pasajlar sonra mESC satırlarının kurulması arasında deneysel çoğaltır, % 60-80 ortalama bir başarı ile değişkendir. 2i eklenmesi önemli ölçüde sonuçları 129S2 arka plan olanlar gibi keyfi fare suşları ile çalışırken yükseltmek değil ama sigara keyfi suşları ile çalışırken gereklidir.
Fare ESC kolonileri normal morfoloji düz bir şekliyle mevcut olmalıdır ve ne zaman (şekil 1B-C) tedavi olmadan kültürlü kenarları tanımlanan veya 2i ile kültürlü (şekil 1 d). Koloniler sunan çevresel farklılaşma işaret olmalıdır (şekil 1E-F) atılır. Elde edilen türetme verimliliği beklenen değerler düşüktür, mESC kolonileri ve alt kültür hücre ölümüne neden olabilir ve farklılaşma (şekil 1G-H) tanıtmak bu kez aşırı büyüme, önlemek için onları kontrol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56171/56171fig1.jpg"> 
Resim 1 : Kültür mESC koloninin temsilcisi görüntüler. (A)yapılan ilk haftası kültür sonra (B, C) birkaç mESC colonies adlı geçit 10 sunan tanımlı kenarları ve düz bir şekil bir blastosist türetilmiş. (D) koloniler mESC hatlardan 2i ile tedavi. (E, F) Periferik farklılaşma işaretleri (Kesikli elips ile işaretli) sunan yarı farklılaşmış mESC kolonileri örnekleri. (G, H) Kötü morfoloji ve farklılaşma işaretleri sunulması büyümüş mESC kolonileri örnekleri. Ölçek çubukları 100 µm. = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56171/56171fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Kültür altı hafta sonra elde edilen sözde mESC satırları stemness doğrulamak için Nanog ve ayırt etme belirteçleri varlığı tespit edilebilir. MESC satırları pluripotency işaretleri Oct4 ve Sox2 gibi pozitif olmalıdır (Şekil 2 A-B). Ayrıca, sonra indüksiyon hücrelerin % 10 ile desteklenmiş DMEM hücrelerde besleyici olmadan 10 gün boyunca kültür tarafından kendiliğinden farklılaşma FBS, mESC hatları ektoderm marker β-tübülin Sınıf III (Tuj1) için pozitif olması bekleniyor (şekil 2C), mesoderm marker α-düz kas aktin (αSMA) (şekil 2B) ve endoderm işaret Alpha-Fetoprotein (AFP) (şekil 2E). Yalnızca satırları değerlendirildi beş işaretçileri için olumlu gerçek mESC satırları olarak kabul ve böylece türetme verimlilik hesaplanması için kullanılan. Genellikle, bu mevcut iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan hemen hemen tüm mESC satırlarına karşılık gelir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56171/56171fig2.jpg"> 
Resim 2 : Pluripotent ve ayırt etme belirteçleri karşı temsilcisi ayirt. mESC koloniler (B)(a)Oct4 (yeşil) ifade ve Sox2 (kırmızı). (C) Tuj1 (yeşil), (D) αSMA (yeşil) ve (E) AFP (yeşil) ifade mESC kolonileri farklı. Tüm görüntüleri nükleer malzeme Hoeschst (mavi) ile counterstained. Ölçek çubukları 100 µm. = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56171/56171fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Görüntüleme.  Universitat Autònoma de Barcelona. Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Video: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Gelişim Biyolojisi

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...