The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

WT CF suşu Zebra balığı Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC protokol numarası 2012-11473) tarafından onaylanan protokollere göre kaldırdı ve muhafaza edildi. Tüm deneyler ilk araştırma amaçlı hayvanların kullanımı ile ilgili organları düzenleyen ilgili tüm devlet ve kurumsal etik tarafından onaylanmış olmalıdır. 1. hazırlıklar <ol><li> Diseksiyon ortamı 10 ml hazırlamak 200 ul 100x Penisilin-Streptomisin DMEM / F12 9.8 ml. </li><li> , Doku kültürü için 10 ml su ile L-sistein 120 mg ekleyin: L-sistein solüsyonu hazırlayın. 2 haftaya kadar 4 ° C &#39;de, L-sistein solüsyonu saklayın veya 1 yıla kadar -20 ° C&#39; de parçalar halinde. </li><li> DNase I çözelti hazırlayın: doku kültürü için 1 ml su için, DNase I deposu 2 aya kadar, 4 ° C &#39;de DNase I çözeltisi 10 mg ekleyin. </li><li> Papain çözelti hazırlayın: Papain solut hazırlamakiyonu, DMEM / F12 5 ml 100 ul papain (yaklaşık 140 adet), 100 ul DNase I (% 1) ve 200 ul L-sistein (12 mg / ml) ekleyin. Taze papain çözüme her zaman hazırlamak ve kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile sterilize edin. </li><li> Yıkama çözeltisi hazırlayın: yıkama çözeltisi 100 ml hazırlanması 93,85 mi DPBS 1x glikoz% 45, 500 uL, 1 M HEPES ve 5 ml FBS 650 ul ekleyin. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre içinden filtre yıkama çözeltisi sterilize edin. en fazla 2 ay için 4 ° C&#39;de yıkama solüsyonu saklayın. </li><li> insülin çözeltisi hazırlayın: insülin çözeltisinin 2 ml hazırlamak için, doku kültürü için 2 ml su içinde, 10 N NaOH ve 100 mg insülin 25 ul damla ekleyin. </li><li> EGF ve FGF çözümleri hazırlayın: 100 ug / ml konsantrasyonda DMEM / F12 iki mitojenler eritin. -20 ° C&#39;de 10 ul alikotları olarak saklanmalıdır. </li><li> B-27 ve K-2 ortamı hazırlayın: KAYIT B-27 ve K-2 takviyesi 500 ul -20 ° C ve 1 ml alikotlar, respectiv deely. </li><li> Z farklılaşma durumu orta hazırlayın: Z-farklılaşma durumu ortamı 100 ml hazırlayın 40 ul insülin (50 mg / ml), 500 ul B-27, 1 mL N-2, 650 ul glükoz 45 ve% 1 ml eklemek 100 x penisilin-streptomisin DMEM / F12 97,81 ml. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile Z-farklılaşma durum orta sterilize edin. 1 hafta kadar 4 ° C &#39;de Z-farklılaşma durumu orta saklayın. </li><li> Z durumu orta hazırlayın: Z-durumu ortamı 50 ml hazırlayın EGF 10 ul steril Z farklılaşma durumu ortamı (20 ng / ml), 50 ml FGF 10 ul ekleyin. 1 hafta kadar 4 ° C &#39;de Z-ortamla saklayın. </li><li> Farklılaşma kültürü için kaplama çözeltisi hazırlayın: 5 ml dışı kaplama çözümü için, hücre dışı matriks solüsyonu 100 ul ekleyin DMEM / F12 4.9 ml (örneğin, Matrigel.). buz üzerinde 4 ° C&#39;de çözülme hücre dışı matris çözeltisi. Bir kez çözüldü, U, 4 ° C &#39;de devam2 hafta s. </li></ol> Yetişkin Zebra balığı Beyin 2. Diseksiyon <ol><li> Jel buz paketleri ile 100 mm x 15 mm Petri kabı doldurarak yatağı bir diseksiyon hazırlayın. Daha sonra Petri kabı kapağı yerleştirmek ve jel donar kadar -20 ° C de inkübe edilir. Kapak yerin üstüne temiz filtre kağıdı kare filtre kağıdı ve plastik film ile petri hem sarın ve. </li><li> Temiz ve her kullanımdan önce% 70 etanol ya da ısı ile tüm mikrodiseksiyon aletleri sterilize. mikroskop yakınındaki bütün sterilize diseksiyon aletleri yerleştirin ve sağ ötenazi önce, fiber optik aydınlatma ile mikroskop altında diseksiyon yatak yerleştirin. </li><li> Bir tüm beyin neurosphere hazırlanması için 2 yetişkin zebrafish toplamak; ve 3 ila 4 zebra balığı parçalara beyin bölgelerinde Neurospheres oluşturmak için. </li><li> Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol kullanılarak yetişkin zebrafish (8-12 aylık) euthanize. Sonraki 7, balık batırmak% 5, 5-10 saniye boyunca, etanol ve hızlı bir şekilde cerrahi bıçak kullanılarak solungaçları düzeyinde dekapitasyon diseksiyon yatakta yer. <ol><li> Hayvanın kalp atışı yavaş yavaş yavaşlatır ve dolaşımı durana kadar aşırı dozda tricaine metansülfonat (300 mg / L) yönetmek, hayvanlar euthanize, ardından buzlu suya batırın. </li></ol></li><li> aşağı kafa dorsal yüzü çevirin, ve makas kullanılarak ağzına kesim tarafında uzunlamasına kesim yapmak. Forseps kullanarak kafatasının taban açığa ve tüm komşu doku kaldırmak. tektum yönelik omurilik başından kafatası yanal duvarların kesin. </li><li> makas kullanılarak, kesme ve optik sinirler kaldırmak ve daha sonra tektum seviyesinde kafatası en dış kısımda, her iki tarafı da çıkarın. Baş ventral yüzü yukarı çevirin. Kafatasının en üst kısmı geri kalanını soyulabilir, forseps kullanma. </li><li> Yeni bir tabak wi içine kafatası kalan kısmı ile beyin birlikte aktarındiseksiyon orta (1.1) th. bozulmamış tüm beyin yapılarını tutarak, mikro bıçağın plastik tutacağı kullanarak diseksiyon orta beyin dokusunu temizleyin. </li><li> Bu açıdan bakıldığında, bütün zebrabalıkları beyni kullanarak protokolü devam ediyor. <ol><li> Alternatif bütün zebrabalıkları beyin ya da taze neşter ile disseke telencephalon, tektum / diensefalon veya beyincik gelen neurospheres oluşturmak için spesifik beyin bölgelerinde için bu protokolü adapte. Şekil 3 ve 11 referans faiz göre tanımlanan beyin bölgesini incelemek için bir nöral özel floresan Zebra balığı nöral transgenik satırını kullanın. </li></ol></li></ol> Yetişkin Beyin 3. Tek Hücre Ayrılma <ol><li> Bir biyolojik güvenlik kabini sonraki tüm işlemlerini gerçekleştiriyoruz. diseksiyon orta 800 ul içeren bir 1.5 ml tüp içine beyin doku transferi (adım 1.1 hazırlanmış). Beyin dokusu dokunmadan, pipetleme diseksiyon orta çıkarın. </li><li>papain çözeltisi (adım 1.4) 500 ul ilave edin ve 10 dakika için 37 ° C &#39;de beyin dokusu sindirimi. hücre canlılığı azaltabilir olarak daha uzun 15 dakika inkübe etmeyin. </li><li> inkübasyondan sonra, alttan ~ 0.25 inç 1000 ul pipetlemeyin ucu kesilmiş kullanarak 15 ml konik tüp içine papain çözüm 500 ul ile beyin dokusuna aktarın. Yavaşça yavaşça aynı ucu ile yukarı ve aşağı 10 kez pipetleme beyin doku ayırmak. pipetlemeyin yukarı ve 15&#39;den fazla kez aşağı ve hücre canlılığı değiştirebilir olarak, bu adımı sırasında hava kabarcıkları üretemeyen yok. </li><li> Bir kesilmemiş 1.000 ul düzenli ucunu kullanarak 10 yukarı pipetleme tarafından takip dakika ve aşağı 10-13 kez 37 ° C&#39;de tekrar beyin dokusu kuluçkaya yatmaktadır. pipetlemeyin yukarı etmeyin ve en fazla 15 kat aşağı, hücre ölümünü önlemek için. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) 800 xg yıkama çözeltisi (adım 1.5), ve santrifüj 2 ml hücre süspansiyonu eklenerek enzimatik sindirim durdurun. Dikkatle s decantupernatant ve 1000 ul düzenli ucu ile pipetleme ve aşağı şiddetle bir parmak ve sonra tüp dokunarak kalan çözelti içinde pelletini. Daha sonra, yıkama çözeltisi 2 ml ekleyin. </li><li> Bu aşamada, tek bir hücre süspansiyonu elde edilmiştir mikroskop altında bakın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g hızında tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatantı ve taze Z-ortamla (adım 1.10) 1 ml kullanarak pelet yeniden askıya. </li><li> Tripan mavisi 12 ve kullanarak leke hücreler mavi ölü hücreleri hariç tutarak hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak. Hücre süspansiyonunun 200 ul ve her bir kuyu taze Z ortamla 300 ul, 24 oyuklu bir plaka hazırlanması. ~ 500 hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri. Zebra balığı, beyin-türevi Neurospheres 37 ° C&#39;de iyi bir büyüme olmadığı,% 5 CO2 içinde 30 ° C&#39;de bir inkübatör içinde kültürlendi hücreleri korumak. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 4. Nesil &lt;/ P&gt; <ol><li> Nitro (div1) &#39;de 1 gün sonra, mikroskop altında yetişkin tüm beyin elde edilen tek bir hücre süspansiyonu gözlemlemek ve moloz de merkezinde biriken olup olmadığını not edin. Dikkatle orta yaklaşık 100 ul pipetleme herhangi bir enkaz kaldırmak (mümkünse daha az). Sonraki taze Z-ortamla 100 ul ekleyin. Tek hücre süspansiyonları, bu süre (Şekil 2A div1) de dikkat edilmelidir. </li><li> In vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmek. ucu kesilmiş 1.000 ul pipet kullanarak, toplamak ve iyi bir yeni her bir kuyudan hücre süspansiyonu 250 ul aktarın. Tüm kuyulara taze Z-ortamla 250 ul ekleyin. kültür hücreleri genişleyen önce, iyi boyunca yukarı pipetleme ve aşağı çok yavaşça süspansiyon homojenize. </li><li> Yineleyin in vitro aşağıdaki 4 gün (DiV4) için 4.1 ve 4.2 adımları tekrarlayın. neurospheres büyüklüğünde bir progresif artış vi olmalıdırDIV3 ve DiV4 (Şekil 2B ve C) merkezi ve iyi kenarlarında kişidir. Not: Primer Neurospheres geçit veya multipotency değerlendirmek farklılaşması için işlenebilir. Alternatif olarak, farklılaşma sürecinde belirli genlerin rolünü tanımlamak için nucleofection ya lipo transfeksiyon 11 işlenebilir. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 5. Pasajlanması <ol><li> Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın ve mekanik olarak 1 ml pipet DiV4 Neurospheres ayrıştırmaları. çok hızlı hava kabarcığı oluşumu hücre ölümünü artmış olabilir aşağı yukarı pipetlemeyin ve vermeyin. </li><li> Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve 24 oyuklu plakanın her oyuğuna primer kültür yüzey 250 ul 800 hücre / ul dağıtın. </li><li> her bir kuyunun Z-ortamla 250 ul ekleyin. </li><li> Aşama 4.2 belirtildiği gibi, in vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmekd 4.3. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 6. Farklılaşma <ol><li> 10 dakika süre ile,% 70 etanol içine daldırma ile kaplama gözlük sterilize, 12 oyuklu plakanın her oyuğuna yerleştirerek oda sıcaklığında daha sonra kuru örtücü camlar. </li><li> yaygın genişletmek ve tüm cam kapak kapsayabilir şekilde kapak camın merkezde hücre dışı kaplama çözeltisi (aşama 1.11) 300 ul ekle. Daha sonra, (nemlendirilmiş hücre kültür inkübatörü kullanılarak), 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücre dışı Kaplama çözeltisini çıkarın ve 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca cam kapak kurutun. </li><li> Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın. Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme tarafından (geniş uç ucu ile) 1 ml pipet ile kuyu başına tüm DiV4 birincil neurospheres ayırmak. </li><li> Tohum daha önce hazırlanmış hücre dışı matris ile kaplanmış coverglasses 4 x 10 3 hücre / ml&#39;lik bir hücre yoğunluğunda (6.1-6 adımında neurosphere hücre süspansiyonları ayrıştırılır.3) ve alt-tabakaya bağlı kadar% 5 CO2 içinde 30 ° C&#39;de, en az 30 dakika boyunca devam edin. Daha sonra, kültür ortamı çıkarın ve hızlı bir şekilde,% 5 CO2 içinde 30 ° C&#39;de 24 saat boyunca hücrelerin kültürlenmesi önce ön-ısıtılmış taze Z farklılaşma durumu ortamı (aşama 1.9) içinde 1 ml. </li><li> Her iki gün, hücre farklılaşmasının zamanında Z-farklılaşma koşulu orta yarısı değiştirin. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 7. Gen Manipülasyonu <ol><li> 4 ° C&#39;de 80 x g&#39;de 8 dakika boyunca santrifüjlenerek DiV3-4 primer Neurospheres (adım 4.3) toplayın. Ticari oligonucleoatides lipozom transfeksiyon için hazırlanırken previouly 11 veya DNA plazmid vektörlerinin Nucleo-transfeksiyon nitelendirdi. </li><li> Reaksiyon karışımı, 100 ul (82 ul nucleofactor çözeltisi ve ek 18 ul), 4 x 10 3 hücre / ul hücre yoğunluğunda yeniden süspanse neurosphere pelet. </li><li> neurosphere asıltı Mix(1 ug / ml olarak plazmid stoklarının) seçim DNA plazmid vektörü 5 ul üzerinde. nucleotransfection bir Nucleofector küvet içine neurosphere / DNA karışımı, transferi ve Nucleofector kiti ile, imalatçının talimatlarına uygun olarak bir program Nucleofector seçin. </li><li> Hemen nucleofection sonra hücrelere önceden ısıtılmış Z durumu ortam (1.10), 500 ml bir hacim kazandırmak ve yukarıda tarif edildiği gibi, hücre yenileme ve / veya farklılaşma özelliklerini incelemek için, transfekte Neurospheres plaka. </li></ol>

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Bu protokolün amacı nöral kök / progenitör hücrelerin hücresel ve moleküler özellikleri incelemek için izole etmek ve kültür yetişkin zebrafish beyin kaynaklı Neurospheres etmektir. Burada, yetişkin zebrafish beyin, multipotent nöral hücreleri seçmek ve üç sinir hücre tipleri, yani astrositler, nöronlar ve oligodendrositleri oluşturmak için nasıl rapor. tekrarlanabilir neurosphere oluşturan deneyi şimdiye kadar zebrabalıkları kurulmuş olmasaydı bu yana protokol son derece önemlidir. Protokolde birkaç kritik adımlar saygı gerekir ve sorun giderme önerileri (Tablo 1) recapitutaled edilmiştir. İlk olarak, hücre ölümü yetişkin zebrafish beyin diseksiyonu ve tek bir hücre süspansiyonu prosedürü hem sırasında oluşur. hücre ölümü uzatmak sınırlamak için temiz ve keskin araçları kullanmak yanı sıra kesinlikle mevcut pro önerilen zamanlama ve inkübasyon sıcaklığı saygı esastırtokol. İkincisi, neurosphere kültür taze hazırlanmış medya ile ve dikkatli bir pipetleme tekniği ile yapılmalıdır. Üçüncü olarak, hücre yoğunluğu önerileri güvenilir yenileme veya neurosphere hücrelerinin farklılaşmasını elde etmek için takip edilmelidir. Bunu akılda tutarak, hücre kültürü teknikleri yetenekli kimse protokolünü kullanmak ve yetişkin zebrafish beyin kaynaklı neurospheres izolasyonu, kültürü ve gen manipülasyonu yürütmek gerekir. Zebra balığı küre oluşturan deneyleri önceden memeli türlerinde 4 açıklanan aynı sınırlamalar muzdarip: kendi doğal beyin niş kendi izolasyonu takip değişmiş nöral kök / progenitör hücrelerin 1) davranışı; 2) Neurospheres kök hücrelerin bir homogenus popülasyonu değildir, ancak kök hücreleri, projenitör hücreler ve post-mitotik farklılaşmış hücreleri içerir. Bizim protokol aclonal neurosphere kültürleri oluşturur belirterek dahası değer. kültürlerin hücre yoğunluğuKüre oluşturucu deneylerinde önemli bir parametre kültürü, klonal yarı klonal ya aclonal olup örneğin, klonalite, belirlediği. Klon koşulları doğru karakterize ve kültürde mevcut kök ve progenitör hücrelerin farklı havuzları ölçmek için izin verir. Şimdiye kadar hücre klonalite deneyleri gerçekleştirmek mümkün olmamıştır ve biz diğer progenitör hücre havuzlarından sinir kök hücreleri ayırt edebilen önce kültür koşulları daha da optimizasyon gerekiyor. Balığı neurosphere kültürleri deneyler büyük bir aralığı için de kullanılabilir. Nöral hücre kaderine (Şekil 4 ve 11) doku spesifik belirlenmesinde miR-107 fonksiyonunu değerlendirmek çalışmada gösterildiği üzere, nöron içinde gen ekspresyon analizinin yanı sıra gen ekspresyonunun değiştirilmesine izin verir. Ek uygulamalar neuroge nöral kök / progenitör genlerin rolü test etmek amacıyla, bu tür CRISPR / Cas9 sistemi olarak genom düzenleme stratejileri içerirNesis ve beyin onarımı 13. Son olarak, bizim protokol zebrabalıkları neurospheres nöronlar ve glia hücrelerinin bölgeye özgü özellikleri incelemek ve zebra balığı beynin 14 farklı ventriküler etki nöral hücre heterojenite hücresel ve moleküler temelini keşfetmek imkanı açılması, beynin farklı bölgelerinde elde edilebileceğini göstermektedir .

Memeli nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) Neurospheres 1 olarak adlandırılan hücrelerin bölünmesi kümeleri gibi serbest bir kültürlerinde gelişme yetenekleri ile, in vitro olarak karakterize edilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) varlığında, NSC&#39;lerde kendini yenileyen NSCs oluşturmak için ya da simetrik olarak bölmek veya asimetrik, iki farklı yavru hücrelere oluşturmak için, yani. Bir ayırıcı projenitör hücre ve yeni bir MGK. Neurosphere kültürler, bu nedenle nöral kök / progenitör hücrelerin ve daha fazla farklı sinir hücrelerinden 2-4 bir karışımı olan NSC&#39;lerde Ancak iki spesifik özellikleri ile, diğer neurosphere hücre tiplerinden ayırt edilebilir. Bunlar serbest uzun süreli kendini yenileme görüntüler kültürleri yüzen ve hücre dışı matriks substratlara büyüme faktörlerinin geri çekilmesi ve yapışma takiben tüm nöral hücre soyları (yani, nöronlar, astrositler ve oligodendrosit) içine ayırt edebilirsiniz. memeli konakçının içindeALS, neurosphere kültür sistemi, yetişkin beyinde NSC&#39;lerde varlığını göstermek için kullanılan ilk tüp sistemi ve proliferasyonu, kendi kendini yenileme ve nöral kök ve projenitör hücrelerinin multipotency analiz etmek için en sık kullanılan araç. Bu nedenle, küre oluşturan deneyleri bazı dezavantajları ve sınırlamalar 4 muzdarip olsa da, bu kültür sistemi kendi in vivo niş 4 çıkarılır ve kilit düzenleyiciler belirlenmesinde etkili olmuştur zaman kök hücresi gibi davranmaya bir hücrenin potansiyelini değerlendirmek için değerlidir MGK kendini yenileme ve hücre kader tayini 5-7. yetişkin nörogenezi sınırlı memelilere aksine, Zebra balığı yapısal hayatları boyunca tüm beyin ekseni boyunca yeni nöronlar üretirler. Zebra balığı yetişkin beyin t anlamak için Zebra balığı güçlü bir model organizma yapma nöral kök / progenitör hücreler barındıran birden nörojenik nişler görüntülerHücrenin beyinde aktivitesi hem de merkezi sinir sistemi rejenerasyonu için gerekli olan moleküler programları kaynaklanıyor. Geçtiğimiz 17 yıl içinde, çeşitli araştırma grupları izole ve Zebra balığı sinir hücreleri 8,9 kültürleme için yöntemler geliştirmiştir. Bu çalışmalar embriyonik nöronal ve in vitro glial hücreler üretmeyi amaçladığını, ancak NSCs korumak ve onların özelliklerini incelemeyi bulundu. Neurospheres yetişkin Apteronotus leptorhynchus (Brown hayalet Knifefish) 10 içinde olmasına rağmen, zebrabalıkları bir neurosphere oluşturucu deney kurulacak kalmıştır. Burada zebrabalıkları nöron 11 sırasında miR-107 rolünü göstermek için bir neurosphere oluşturan deneyi açıklar. protokol sağlar: 1) Zebra balığı bütün beyin ya da telencephalon, tektum ve beyincik gibi çeşitli disseke beyin bölgelerinden ya yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin toplanması; fl 2) nesiloating ve yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerden kendini sürekli yenileyen Neurospheres; 3) aşağı ve yukarı yönde regülasyonu kodlayan genlerin ya da küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar neurospheres 11, ekspresyon için nöral kök / progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması rollerini araştırmak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Neurosphere Kültür Genel Şeması Burada yetişkin zebrabalıkları beyninden yapılan bir neurosphere oluşturucu deneyinin protokolünün tüm adımları açıklamaktadır. İlk olarak, yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin zebra balığı tüm beyin veya bu telencephalon, tektum ve serebellum (Şekil 1A-C) gibi çeşitli parçalara beyin bölgelerinde, ya toplanmıştır. Yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin tek bir hücre süspansiyonu daha sonra yüzen ve kendini yenileyen Neurospheres (Şekil 1D, E) oluşturmak için kullanılmıştır. Son olarak, Neurospheres çoğalması ve Zebra balığı nöral kök / progenitör hücrelerin farklılaşması rollerini araştırmak amacıyla aşağı okuyan ve up-regülasyonu kodlayan genlerin ya da küçük olmayan kodlama RNA&#39;ların 11 ifadesinin etkili olmuştur. Zebra balığı birincil neurospheres birkaç pasajlar şu kendini yenileyebilir. Geçit 1 ve 2&#39;de Neurospheres oluşturmak için, 5.1-5.4 6-8 günlük bir toplam, iki kez tekrarlandı adımlar. DiV2-4 kaynaktan, neurospheres büyüklüğü çapı yaklaşık 50 um çıkmıştır. İkincil ve üçüncül Neurospheres de geçit 1 ve 2&#39;de, sırasıyla, (Şekil 2D) sonra elde edildi. Passage 3 at, zebra balığı neurospheres 50 mikron çapında kritik boyutta büyümeye ancak koyamadık ve bizim kültür koşulu yerine nöral kök hücreler 4 saf bir popülasyona göre kök / progenitör hücrelerin bir havuz seçer düşündüren, kendini yenilemeyi başaramadı . neurosphere Farklılaşma Her iki whol türetilen primer, sekonder ya da tertier NeurospheresYetişkin zebrabalıkları e, beyin ya da telencephalic arasında, serebellar ve tectal alanı farklılaşma potansiyelleri için test edildi. Farklılaşma durumları (DiVd1-DiVd3) in vitro 1 ila 3 gün arasında, yapışkan hücrelerin tek bir tabakası (Şekil 3A, B) gözlenmiştir. Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi, DiVd4 de, çıkıntılar ve glia hücreleri gibi aksonal immünohistolojik veya gen ekspresyonu ile görünür ve ayırt edildi nöral kök / progenitör hücrelerin ayırt ettiğini değerlendirmek, 11 analiz eder. Benzer şekilde, nöronlar ve glial hücreler farklı beyin bölgeleri (Şekil 3B, E) izole edilen nöral kök / progenitör hücrelerin ayırt. Balığı Neurospheres Gen İfade Manipülasyon Biz bütün zebrafish beyin-de nöronal ve glial farklılaşma üzerine miR-107 rolünü test ettik<html> yarıp genç nöral kök / progenitör hücreleri (Şekil 4). Biz aksonal süreçler (Şekil 4A, B) anormal büyümesi ile gösterildiği gibi, anti-miR-107 tarafından miR-107 downregülasyonu, neurosphere oluşumunu ama değişmiş nöronal farklılaşma etkilemediğini göstermiştir. RT-PCR, gen ekspresyonu miR-107 inhibisyonu glial etkilemeden neuroblast işaretleyici Neurogenin-1 (NGN-1) ve MAP-2 ve α-tubulin akson özel moleküllerin her ikisi de bir artış ekspresyonuna neden olduğu doğrulamıştır hücre işaretleyici ifade (S-100, GFAP, olig2) (Şekil 4C). Bu duruma göre, MIR-107 ifade kazancı miR-107-mimik değerlendirmek, neuroblast- ve akson-spesifik bir işaretleyici ekspresyonu (Şekil 4D) bir azalmaya neden, in vitro olarak, miR-107 hareket eder, nöronal bir farklılaşma düzenleyici olarak zebra balığı nöron içinde 11. /53617/53617fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. Protokol safhaları şematik temsili prosedürler ve ilgili zamanlama (a, b), tek bir hücre süspansiyonu eldesi (C, tüm beyin veya telencephalic, tectal ve yetişkin zebra balığı beyin beyincik bölgelerinin ya diseksiyon içerir ), kayan neurospheres (D) neurospheres farklılaşması (E) üretimi. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53617/53617fig2.jpg" /> Şekil 2: balığı beyin türevli Neurospheres oluşturulması. (A - C) tüm beyin türevli primer dalgalı neurospheres Örnek Faz kontrast görüntüleri 3. gün, günde 1 (div1, A) gözlendi (DIV3, B) ve 4 gün (DiV4, C). NE nispi sayısını temsil (D) GrafikPasajlar 1 ve 2&#39;de urospheres geçit 2 sonra geçit 0. neurosphere sayısı ile karşılaştırıldığında, büyük ölçüde oluşumu olduğu Neurospheres azalmıştır. Ölçek çubuğu: 25 mikron. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53617/53617fig3.jpg" /> . Şekil 3: balığı beyin türevli Neurospheres Farklılaşma (A - C, E) 1 içinde Z farklılaşma ortamında kültürlenmiştir tüm beyin türevli neurospheres Faz kontrast görüntüleri (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) ve 4 (C ve D, DiVd4) gün. Zebra balığı: 12 aylık Tg (DsRed GFAP) tüm beyin (E) Dorsal görünümü. telencephalon (Tel), tectum (Tec) ve beyincik (Cer) disseke ve gösterildiği gibi toplanmıştır. (D) Geçiş 0 (P0) de tectum, telencephalon ve beyincik türetilen DiVd4 neurospheres, 1 (P1 görüntüleri) Ve 2 (P2). Ölçek çubuğu: 25 mikron. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53617/53617fig4.jpg" /> Şekil 4:. Belirtilen oligonükleotidler ile Div4 tedavi Div4d Neurospheres gösteren MiR107 manipülasyon Oluşan Neurospheres analizi (A) Faz kontrast görüntüleri. Üst panellerde siyah kutular alt panellerde büyütülmüş alanı gösterir. (B) Üst grafik veya miR107 olmadan oluşturulan neurospheres sayısının ölçümü temsil eder. Neurospheres büyüklükleri (20-30 mikron, 31-50 mikron çapında&gt; 51 mikron) tarafından alt gruplara edilir. Alt grafik neurospheres tedavi ve alt yukarıdaki gibi gruplandırılmış gelen aksonal projeksiyonlar miktarının gösterir. Daha önce Div4 gösterilen oligonükleotitler ile tedavi edilen Div4d neurospheres ile gösterilen genlerin (C, D) QRT-PCR ifade analizi. veriler temsil± SEM, * p &lt;0.05, n = 3 Scr demek: karıştırmak. Ölçek çubuğu: 25 mikron. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> olası neden </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="2"> çok ölü hücrelerden Kurtarma </td><td> enzimatik tedavi öncesi beyin hazırlanmasında Zaman gecikmesi </td><td> Diseksiyon kurmak emin olun ve medya balık ödün önce hazır (ayrıca sterilite kontrol, sıcaklık) </td></tr><tr><td> Sıkı papain tedavisi </td><td> Mekanik ayrıştırma doku çok kümeleri geride bırakarak önlemek için canlı bir tek bir hücre süspansiyonu üretmek için yeterince hassas, ama yeterince güçlü olması gerekir. inkübasyon / santrifüj dönemleri için önerilen süreleri ve sıcaklıkları saygı </td></tr><tr><td rowspan="3"> Neurospheres görünür ya da kötü büyümek değil </td><td> yanlış sıcaklık </td><td> c sağlayan 30 ° C&#39;ye ayarlanmış olduğu inkübatör kontrolorrect sıcaklığı. </td></tr><tr><td> enkaz ile kaldırıldı Büyüyen küreler </td><td> her bir kuyu için, enkaz aspirasyon ortamı en iyi performans için yer alır. senin pipetle ortama girmemek </td></tr><tr><td> Bazı reaktif bütünlüğü (B27 takviyesi, EGF, FGF) zayıflar </td><td> Bu bütünlük hücre büyümesi sınırlayıcı faktörlerin oluşturmaktadır. seri numarası kontrol edin ve yolu örnekleri korundu. / Çözülme önlemek kültürde günümüzde kullanılan örnek reaktif döngüleri dondurulabilir </td></tr><tr><td> Tek tek hücrelerin varlığı </td><td> transfer modu / neurospheres genişleme çok sert </td><td> çok küreler kuyuda oluşan çünkü bu adım bir genişleme / seyreltme adımdır. tek hücre içine neurosphere ayrışmasını önlemek için transfer sırasında sert küre toplamaktan kaçının </td></tr><tr><td rowspan="4"> matrigel üzerindeki hücrelerin yokluğu </td><td> Matrigel düzgün / çözülmüş seyreltildi değildi </td><td> -20 ° C ila Matrigel çözülme, 4 ° C&#39;de en az 30 dakika gerektirir ve dikkatli bir şekilde zor akışlı Pipet kalır </td></tr><tr><td rowspan="2"> matrigel yok yapışma </td><td> Hücre süspansiyonu hacmi Matrigel kat hücre kaplamasına olanak sağlayacak kadar küçük olması gerekir </td></tr><tr><td> Hücre birikimi için daha fazla zaman tanımak (yukarı büyük hacimler kullanılması durumunda 2 saat kadar) </td></tr><tr><td> Taze farklılaşma ortamı çok soğuk </td><td> Hücre bağlantı ortamı değiştirilirken, farklılaştırma ortamı biriken hücreler termal şokunu önlemek için, 30 ° C de ısıtıldı gereken </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kötü nucleofection </td><td> Ölü hücreler </td><td> nucleofection yaparken size hava kabarcıkları üretemeyen emin olun. Maxi-hazırlıklarını kullanarak yüksek kalitede DNA vektörleri kullanın. En az 1 - nucleofection sonra 2 saat, taze Z-farklılaşma durum orta ya da Z-durum orta kullanarak kültür ortamı değiştirin. </td&gt; </tr><tr><td> Birkaç pozitif neurospheres </td><td> Farklı boyutlarda Neurospheres düşük nucleofection yol açabilir. DIV2 ve DIV3 de kullanılması Neurospheres nucleofection için idealdir. Hücre yoğunluğu 4 x 10 3 Neurospheres ml -1 100 ml&#39;lik bir reaksiyon aşmamalıdır. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Sorun Giderme Önerileri bunların üstesinden Protokol, Olası Sorunlar ve Çözümleri Her Step, listeleniyor.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar.

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

isolation-and-culture-of-adult-zebrafish-brain-derived-neurospheres

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Görüntüleme.  Yale University.  Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar. 

Video: Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

İzolasyon ve Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncüleri genişletilmesi

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...