The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

WT CF株のゼブラフィッシュは、イェール大学施設内動物管理使用委員会（IACUCプロトコル番号2012から11473）によって承認されたプロトコルに従って上昇し、維持しました。全ての実験は、最初の研究目的のための動物の使用に関する遺体を規制するすべての関連する政府や機関の倫理によって承認されなければなりません。 1.準備<ol><li>解剖培地10mlを準備し、DMEM / F12の9.8ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシンの200μlを添加します。 </li><li> L-システイン溶液を調製する：組織培養のための水10ミリリットルに、L-システイン120mgのを追加します。 2週間まで4℃でL-システインソリューションを保存し、または1年まで-20℃でアリコートインチ</li><li>組織培養のための水の1ミリリットルに、DNアーゼIのショップまで2ヶ月間4℃でのDNase I溶液10mgを追加：DNアーゼI溶液を準備します。 </li><li>パパイン溶液を調製する：パパインsolutを準備しますイオンは、DMEM / F12の5ミリリットルに100μlのパパイン（約140台）、100μlのDNアーゼI（1％）と200μlのL-システイン（12 mg / mlで）を追加します。新たにパパイン溶液を毎回調製し、使用前に0.22μmの孔サイズのフィルターを用いて滅菌します。 </li><li>洗浄溶液を調製：93.85 mlのDPBS 1Xに650μlのグルコースを45％、500μLのHEPES、1M、5mlのFBSを追加し、洗浄溶液100mLを調製しました。使用前に0.22μmの孔径のフィルターを有する洗浄溶液を滅菌します。最大2ヶ月間4℃で洗浄液を保管してください。 </li><li>インスリン溶液を調製する：組織培養用の水2mlに10 N NaOHおよび100mgのインスリンの25μlの液滴を追加し、インスリン溶液2mlを調製します。 </li><li> EGFとFGF溶液を調製する：100μg/ mlの濃度でDMEM / F12の両方でマイトジェンを溶かします。 -20℃で10μlのアリコートとして保管してください。 </li><li> 500μlの、1mlのアリコートとして-20℃で保存のB-27およびN-2は、サプリメント、respectiv：B-27、N-2メディアを準備しますエリー。 </li><li> Z-分化条件培地を準備します、Z-分化条件培地の100ミリリットルを準備40μlのインスリン（50 mg / mlで）、500μlのB-27、1ミリリットルN-2、650μlのグルコース45％および1ミリリットルのを追加しますDMEM / F12の97.81ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシン。使用前に、0.22μmの孔サイズのフィルタを有するZ-分化条件培地を滅菌します。 1週間まで4℃でZ-分化状態媒体を保管してください。 </li><li> Z-条件培地を準備します、Z-条件培地の50ミリリットルを準備滅菌Z-分化条件培地の50ミリリットル（20 ngの/ ml）の中にEGFを10μlとFGFの10μlを添加します。 1週間まで4℃でZ-条件媒体に保管してください。 </li><li> 5ミリリットル外塗布液に、DMEM / F12の4.9ミリリットルに細胞外マトリックス溶液（ 例えば 、マトリゲル。）の100μlを添加する：分化培養用の塗布液を準備します。氷の上で4℃で細胞外マトリックス溶液を解凍します。一度解凍し、uのために4℃で維持2週間のp。 </li></ol>大人のゼブラフィッシュの脳の2解剖<ol><li>ゲルアイスパック100ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿を充填することにより解剖ベッドを準備します。その後、シャーレに蓋を置き、ゲルがフリーズするまで、-20℃でインキュベートします。蓋の場所の上にきれいなろ紙の正方形とプラスチックフィルムで濾紙とシャーレの両方をラップします。 </li><li>清潔で、各使用前に70％エタノールまたは熱により、すべての顕微解剖器具を滅菌します。解剖顕微鏡の近くにすべて滅菌解剖器具を置き、右安楽死の前に、光ファイバ照明で顕微鏡下で解剖ベッドを配置します。 </li><li>全脳の神経球の調製のための2大人のゼブラフィッシュを収集。 3〜4ゼブラフィッシュは、解剖脳領域からのニューロスフェアを生成します。 </li><li>施設内動物管理使用委員会により承認されたプロトコルを使用して、大人のゼブラフィッシュ（8-12カ月齢）を安楽死させます。次に、7で魚を浸しますすぐに5％5-10秒間エタノールおよび外科刃を用いて鰓のレベルで断頭続い解剖ベッドに置きます。 <ol><li>動物を安楽死させるために、動物のハートビートが徐々に遅くなり、循環が停止するまでトリカインメタンスルホン酸の過剰摂取（300ミリグラム/ L）を投与し、その後、氷水に浸します。 </li></ol></li><li>ダウンヘッドの背側を回して、ハサミを使って口にカット側から長手方向のカットをします。鉗子を使用すると、頭蓋底を露出させ、隣接するすべての組織を除去します。蓋に向かって脊髄の先頭から頭蓋骨の横方向の壁をカットします。 </li><li>はさみを使用して、視神経を切断して除去した後、蓋のレベルで頭蓋骨の最も外側部の​​両側を削除します。頭部腹側を上に回します。鉗子を使用して、頭蓋骨の最も先端部の残りの部分をはがします。 </li><li>新しい皿のwiに頭蓋骨の残りの部分で脳に沿って転送します解剖培地（1.1）番目。すべてそのまま脳構造を維持し、マイクロナイフのプラスチック製のハンドルを使用して、解剖培地中の脳組織を清掃してください。 </li><li>この点から、全体のゼブラフィッシュの脳を使用してプロトコルを続けます。 <ol><li>あるいは、新鮮なメスで切開し、全体のゼブラフィッシュの脳から、または終脳、蓋/間脳や小脳からのニューロスフェアを生成するために、特定の脳領域に、このプロトコルを適応させます。 図3および参照11によれば、関心の脳領域を分析するために、神経特異的な蛍光ゼブラフィッシュの神経トランスジェニック系統を使用してください。 </li></ol></li></ol>成人の脳の3単一細胞解離<ol><li>生物学的安全キャビネット内の後続のすべての作業を実行します。解剖培地800μlのを含む1.5 mlチューブに脳組織を転送する（ステップ1.1で調製しました）。脳組織に触れることなく、ピペットで解剖媒体を削除します。 </li><li>パパイン溶液（ステップ1.4）の500μlを添加して、10分間37℃で脳組織を消化。それは、細胞生存率を減少させることができたとして、15分以上インキュベートしないでください。 </li><li>インキュベーション後、下から〜0.25インチ1,000μlのピペットチップカットを使用して、15ミリリットルコニカルチューブにパパイン溶液500μlで脳組織を移します。静かにゆっくりと同じチップで上下に10回ピペッティングすることにより脳組織を解離します。アップピペットと15倍以上ダウンし、それが細胞の生存率を変化させる可能性があるので、このステップの間に空気の泡を生成しませんしないでください。 </li><li>ノーカット千μlの定期的なチップを用いてダウン10-13回ピペッティングし、続いて37℃で10分間、再び脳組織をインキュベートします。アップピペットと15回以上ダウンし、細胞死を回避するためにしないでください。 </li><li>室温で5分間（RT）、800×gで洗浄液（ステップ1.5）、遠心2mlの細胞懸濁液を添加することにより酵素消化を停止します。慎重秒をデカントupernatant 1,000μlの定期的な先端でピペッティングすることによっておよびダウン激しく指で、次いでチューブをタップして、残りの溶液中にペレットを再懸濁。次に、洗浄液の2ミリリットルを追加します。 </li><li>この段階では、単一細胞懸濁液が得られたことを顕微​​鏡で確認してください。室温で5分間、800×gで再び細胞懸濁液を遠心します。上清を除去し、新鮮なZ-条件培地（ステップ1.10）の1ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。 </li><li>トリパンブルー12とを用いて、染色細胞は青色の死細胞を除くことにより、血球計数器を使用して生細胞を数えます。各ウェルに200μlの細胞懸濁液と新鮮なZ-条件培地300μlで24ウェルプレートを準備します。 〜500細胞/μlの密度でシード細胞。ゼブラフィッシュ脳由来のニューロスフェアは、37℃でよく成長しないので、5％CO 2で30℃のインキュベーターで培養した細胞を維持します。 </li></ol>一次ニューロスフェアの4世代&lt;/ P&gt; <ol><li> in vitroでの 1日（DIV1）した後、顕微鏡下で成人の全脳から得られた単一細胞懸濁液を観察し、破片がウェルの中心部に蓄積されたかどうかに注意してください。慎重に（可能な場合はそれ以下）の媒体のおよそ100μLをピペットで任意の破片を除去します。次に、新鮮なZ-条件培地100μlを追加します。単一細胞懸濁液は、この時点（ 図2A DIV1）で観察されるはずです。 </li><li> in vitroでの 2日間（DIV2）の後、培養細胞を展開します。先端カット1,000μlのピペットを使用して、収集し、よく新しいに各ウェルからの細胞懸濁液の250μlのを転送します。すべてのウェルに新鮮なZ-条件培地250μlのを追加します。培養細胞を拡大する前に、よく全体に上下にピペッティングすることにより、非常に穏やかな懸濁液を均質化します。 </li><li>繰り返しは、 インビトロで 、次の4日間（DIV4）のための4.1と4.2を繰り返します。ニューロスフェアの大きさの漸進的増加は、viのでなければなりませんDIV3及びDIV4（ 図2BおよびC）を中心とウェルの縁部でsible。 注：一次ニューロスフェアは、通路または多分化を評価するための分化のために処理することができます。あるいは、それらは、分化プロセス中の特定の遺伝子の役割を特徴付けるためにヌクレオまたはリポフェクション11のために処理することができます。 </li></ol>一次ニューロスフェアの5継代<ol><li>各ウェルからの組織培養の250μlのを削除し、機械的に1ミリリットルピペットでDIV4のニューロスフェアを解離します。気泡形成が細胞死を増加させ得るような、あまりにも急速に上下にピペットとしないでください。 </li><li>血球計数器で細胞をカウントし、24ウェルプレートの各ウェルに初代培養上清250μlの中に800細胞/μLを配布します。 </li><li>各ウェルにZ-条件培地250μlのを追加します。 </li><li>ステップ4.2で報告されているように、in vitroで 2日（DIV2）の後、培養細胞を拡大D 4.3。 </li></ol>一次ニューロスフェアの6分化<ol><li> 12ウェルプレートの各ウェルにそれらを配置することにより、室温で乾燥したカバーガラスその後、10分間、70％エタノールに浸してカバーガラスを滅菌します。 </li><li>それは広く拡大し、全体のカバーガラスを覆うことができるようにカバーガラスの中央に細胞外コーティング液（ステップ1.11）の300μLを加えます。そして、（加湿細胞培養インキュベーターを使用して）1時間37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、細胞外のコーティング溶液を除去し、37℃で2時間、カバーガラスを乾燥させます。 </li><li>各ウェルからの組織培養の250μlのを削除します。機械的に上下にピペッティングにより（より広いエンドチップ付き）1ミリリットルピペットでウェル当たりすべてDIV4の一次ニューロスフェアを解離。 </li><li>種子は、（先に調製した細胞外マトリックスでコーティングしたカバーガラス上に4×10 3細胞/ mlの細胞密度でステップ6.1から6のニューロスフィア細胞懸濁液を解離しました。3）基板に付着するまで、5％CO 2中、30℃で、少なくとも30分間保ちます。その後、培地を除去し、迅速に5％CO 2中で30℃で24時間、細胞を培養する前に、予め温めておいた新鮮Z分化条 ​​件培地（ステップ1.9）を1ml加えます。 </li><li> 2日毎に、細胞differentationの時間の間にZ-分化条件培地の半分を交換してください。 </li></ol>一次ニューロスフェアの7遺伝子操作<ol><li> 4℃で80×gで8分間遠心分離することによりDiV3-4一次ニューロスフェア（ステップ4.3）を収集します。 previouly DNAプラスミドベクターの11または核-トランスフェクションに記載されているように商業oligonucleoatidesのリポソームトランスフェクションのために準備します。 </li><li>反応混合物を100μl（82μlのnucleofactor液とサプリメントの18μl）を4×10 3細胞/μlでの細胞密度で再懸濁し、ニューロスフェアのペレット。 </li><li>神経球をミックスsuspensi（1μgの/μlのでプラスミド株）選択肢のDNAプラスミドベクターの5μlを持つ上。 nucleotransfectionのためのNucleofectorキュベットに神経球/ DNA混合物を移し、ヌクレオキットが提供するメーカーの指示に従ってプログラムをヌクレオ選択します。 </li><li>すぐヌクレオ後、細胞を予め温めZ条件培地（1.10）を500mlの容量を追加し、上記のように、それらの細胞の再生および/または分化の特性を研究するためのトランスフェクトされた神経球をプレート。 </li></ol>

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

このプロトコルの主な目的は、神経幹/前駆細胞の細胞および分子の機能を研究するためにゼブラフィッシュの脳由来の神経球を分離し、培養大人のすることです。ここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から、多能性神経細胞を選択し、3神経細胞型、 すなわち 、アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを生成する方法を報告しています。再現性のニューロスフェア形成アッセイは、これまでにゼブラフィッシュで確立されていなかったので、プロトコルは非常に重要です。 プロトコルのいくつかの重要なステップは尊重される必要があり、トラブルシューティングに関するアドバイス（ 表1）にrecapitutaledされています。まず、細胞死は、成体ゼブラフィッシュ脳、単一細胞懸濁液手順の切開の両方で起こります。細胞死の拡張を制限するために、クリーンでシャープなツールを使用するだけでなく、厳密に存在プロにお勧めのインキュベーションのタイミングと温度を尊重することが不可欠ですトコール。第二に、ニューロスフェア培養物を新たに調製したメディアとし、慎重なピペット操作技術を用いて行われるべきです。第三に、細胞密度の推奨は、信頼性の高い更新または神経球細胞の分化を得るために従うべきです。これを念頭において、細胞培養技術の業者は、プロトコルを使用し、成人のゼブラフィッシュの脳由来の神経球の単離、培養および遺伝子操作を行うことができるはずです。 ゼブラフィッシュにおける球形成アッセイは、以前の哺乳動物種4で説明したのと同じ制限に苦しんでいる：1）神経幹/前駆細胞の挙動は、彼らの自然な脳のニッチからのそれらの単離を以下に変更されます。 2）ニューロスフェアは、幹細胞の均一な集団ではなく、幹細胞、前駆細胞ならびに有糸分裂後の分化した細胞が含まれます。それは私たちのプロトコルがaclonalニューロスフェア培養を生成することは注目にさらに価値があります。培養物の細胞密度が球形成アッセイにおける重要なパラメータは、それは文化が、クローン半クローンまたはaclonalであるかどうか、 すなわちクローン性を、決定するので。クローン条件を正確に特徴付け、培養物中に存在する幹細胞および前駆細胞の異なるプールを定量化することができます。我々はこれまでに、細胞クローンアッセイを行うことができていないと我々は他の前駆細胞プールから神経幹細胞を識別することができる前に、当社の培養条件は、より一層の最適化を必要としています。 ゼブラフィッシュニューロスフェア培養物は、実験の広い範囲のために使用することができます。神経細胞の運命（ 図4及び11）の組織特異的決意でのmiR-107の機能を評価する我々の研究によって示されているように彼らは、神経発生時の遺伝子発現解析だけでなく、遺伝子発現の操作を可能にします。追加のアプリケーションはneurogeの神経幹/前駆細胞の遺伝子の役割を試験するために、そのようなCRISPR / Cas9システムとしてゲノム編集戦略を含みますネシスと脳の修復13。最後に、我々のプロトコルは、ゼブラフィッシュの神経球は、ニューロンとグリア細胞の地域固有の機能を研究するためにゼブラフィッシュの脳14の異なる心室領域で神経細胞の異質性の細胞および分子基盤を探求する可能性を開いて、異なる脳領域から誘導することができることを示しています。

哺乳動物の神経幹細胞（NSCは）分裂細胞のクラスターは、神経球1と呼ばれるように自由に浮遊培養物中で成長する能力により、in vitroで特徴づけられています。上皮成長因子（EGF）及び線維芽細胞増殖因子（FGF）の存在下では、NSCは、すなわち 、二つの異なる娘細胞を生成するために、非対称自己再生のNSCを生成するためにいずれかの対称的に分裂し、または、分化前駆細胞および新規NSCを。ニューロスフェア培養物は、したがって、神経幹/前駆細胞とより分化した神経細胞2-4の混合物であるNSCは、しかし、2つの特定の特性によって、他の神経球の細胞型と区別することができます。彼らは自由に長期の自己再生を表示します文化を浮遊し、それらは、細胞外マトリクス基板への成長因子の撤退と、接着以下のすべての神経細胞系統（ すなわち 、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト）に分化することができます。 mammでALS、神経球培養系は成体脳におけるNSCの存在を示すために使用されるインビトロ系において最初であり、神経幹細胞および前駆細胞の増殖、自己再生能と多分化を分析するための最も一般的に使用されるツールのままです。したがって、球形成アッセイは、いくつかの欠点や限界4苦しむもかかわらず、この培養系は、そのインビボニッチ4から除去され、重要な調節因子を同定することに尽力してきたときに、幹細胞として振る舞うために、細胞の可能性を評価するための価値がありますNSC自己複製と細胞の運命決意5-7の。 成体の神経発生が制限されている哺乳動物とは対照的に、ゼブラフィッシュは、構成的に、その生涯を通じて脳全体軸に沿って、新しいニューロンを産生します。ゼブラフィッシュ成体の脳は、ゼブラフィッシュにトンを理解するための強力なモデル生物を作る神経幹/前駆細胞を保有する複数の神経因性ニッチを表示します彼は、細胞、脳内の活動だけでなく、中枢神経系の再生に必要な分子プログラムを食い止めます。過去17年間で、いくつかの研究グループは、単離およびゼブラフィッシュ神経細胞8,9を培養するための方法論を開発しました。これらの研究は、 インビトロではなく、NSCのを維持し、その特性を調査で胚性神経細胞およびグリア細胞を産生することを目的としました。ニューロスフェアは、大人Apteronotusのleptorhynchus（ブラウンゴーストKnifefish）10で生成されているが、ゼブラフィッシュにおけるニューロスフェア形成アッセイが確立されて残りました。 ここでは、ゼブラフィッシュの神経新生11中のmiR-107の役割を実証するためのニューロスフェア形成アッセイを説明します。プロトコルが可能になります。1）ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋、および小脳な​​どのいくつかの解剖脳領域からいずれかの成体神経幹細胞/前駆細胞のコレクションです。 FLの2）の生成浮動および成体神経幹/前駆細胞からの自己再生の神経球。 3）ダウンとアップレギュレーションをコードする遺伝子または小さな非コードRNAニューロスフェア中の11の発現のためには、神経幹/前駆細胞の増殖および分化における役割を調査します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュ神経球文化の一般的スキームここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から行っニューロスフェア形成アッセイのプロトコルのすべての手順を説明します。まず、成体神経幹細胞/前駆細胞は、ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋および小脳（ 図1A-C）などのいくつかの解剖脳領域のいずれかから収集されました。成体神経幹/前駆細胞の単一細胞懸濁液をフローティングと自己再生ニューロスフェア（ 図1D、E）を生成するために使用されています。最後に、ニューロスフェアは、ダウンを研究する上で、アップレギュレーションゼブラフィッシュ神経幹/前駆細胞の増殖および分化における役割を調べるためにコードする遺伝子または小さな非コードRNA 11の発現の尽力してきています。 ゼブラフィッシュの一次ニューロスフェアは、いくつかの通路を、以下の自己再生することができます。継代1および2でのニューロスフェアを生成するには、5.1から5.4までは6-8日間の合計で、二回繰り返しました。 DiV2-4からは、ニューロスフェアの大きさは直径50μm程度にまで増加しました。第二および第三神経球はまた、継代1及び2であった（ 図2D）の後に得られました。パッセージ3では、ゼブラフィッシュの神経球は直径50μmの重要なサイズで育つができなかったと自己複製に失敗した、私たちの培養条件ではなく、神経幹細胞4の純粋な集団よりも、幹細胞/前駆細胞のプールを選択することを示唆しています。 神経球分化どちらかwhol由来、第一、第二または第三ニューロスフェア電子脳または終脳、小脳と大人のゼブラフィッシュのtectal領域からは、それらの分化の潜在能力について試験しました。分化条 ​​件（DiVd1-DiVd3）のin vitroでの 1と3日の間、付着細胞の単層（ 図3A、B）が観察されました。 図3Cに示すように、DiVd4で、凸部だけでなく、グリア細胞のような軸索 ​​は、免疫組織または遺伝子発現によって可視光と区別可能であった神経幹/前駆細胞が分化したことを評価し、11を解析します 。同様に、ニューロンおよびグリア細胞は、脳の異なる地域（ 図3D、E）から単離された神経幹/前駆細胞から分化しました。 ゼブラフィッシュ神経球における遺伝子発現操作私たちは、全体のゼブラフィッシュの脳ドのニューロンとグリア分化に対するのmiR-107の役割をテストしています<html> rived神経幹/前駆細胞（ 図4）。私たちは、軸索突起の異常成長（ 図4A、B）で示すように、抗のmiR-107によるのmiR-107のダウンレギュレーションは、ニューロスフェア形成するが、変更された神経分化に影響を与えなかったことを示しました。 RT-PCR遺伝子発現は、miR-107の阻害は、グリアに影響を与えることなく、神経芽細胞マーカーニューロゲニン-1（NGN-1）と、このようなMAP-2及びαチューブリンのような軸索特異的分子の両方の発現増加をもたらすことが確認分析します細胞マーカーの発現（S-100、GFAP、OLIG2）（ 図4C）。したがって、によってのmiR-107の発現のゲインのmiR-107-模倣は、ゼブラフィッシュの神経発生時の神経分化の調節因子として、in vitroで 、のmiR-107の行為、ということを評価し、neuroblast-と軸索特異的なマーカー発現（ 図4D）の減少を誘導し11。 /53617/53617fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：プロトコル手順の概略図で手続きと関連するタイミングは、脳全体または終脳、tectalと大人のゼブラフィッシュの脳（A、B）の小脳領域のいずれかの解剖、単一細胞懸濁液（Cの獲得を含みます）、浮遊ニューロスフェア（D）、および神経球の分化（E）を生成します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53617/53617fig2.jpg" /> 図2：ゼブラフィッシュ脳由来神経球を形成します 。 （A - C）全脳由来の初代浮遊ニューロスフェアの代表的な位相コントラスト画像は、3日目、1日目（DIV1、A）で観察された（DIV3、B）と4日（DIV4、C）。 NEの相対的な数を表す（D）チャートパサージュ2後パッセージ0で神経球数に比べて通路1と2でurospheresは、ニューロスフェアの形成が大幅に減少しました。スケールバー：25μmで。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53617/53617fig3.jpg" /> 。図3：ゼブラフィッシュ脳由来神経球の分化 （A - C、E）1中のZ-分化培地で培養し、全脳由来のニューロスフェアの位相差画像（A、DiVd1）、3（B、DiVd3）と4 （C及びD、DiVd4）日。ゼブラフィッシュ：12ヶ月齢のTg（DsRedのGFAP）の全脳の（E）背ビュー。終脳（電話番号）、蓋（テック）と小脳（CER）が解剖し、示されるように収集しました。 （D）パッセージ0（P0）で蓋、終脳と小脳由来DiVd4のニューロスフェア、1（P1の画像）及び2（P2）。スケールバー：25μmで。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53617/53617fig4.jpg" /> 図4：示されたオリゴヌクレオチドでDIV4で処理Div4d神経球を示すMiR107操作後に形成神経球の分析 （A）位相コントラスト画像。トップパネルにあるブラックボックスは、下のパネルで拡大領域を示します。 （B）トップチャートは、またはmiR107、なしで形成された神経球の数の定量化を表します。ニューロスフェアは、そのサイズ（20〜30ミクロン、31から50ミクロン、直径が&gt; 51ミクロン）によりサブグループされています。ボトムチャートは、処理され、サブは、上記のようにグループ化されたニューロスフェアからの軸索投射の定量化を示しています。以前DIV4で示されたオリゴヌクレオチドで処理されたDiv4d神経球によって示された遺伝子の（C、D）定量RT-PCR発現解析。データが表します平均±SEM、* P &lt;0.05、N = 3のScr：スクランブル。スケールバー：25μmで。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>問題</td><td>考えられる理由</td><td>溶液</td></tr><tr><td rowspan="2">あまりにも多くの死細胞の回復</td><td>酵素処理の前に脳を調製するのに時間遅延</td><td>解剖が設定を確認し、メディアが魚を犠牲にする前に準備ができている（また、無菌性を確認し、温度） </td></tr><tr><td>厳格パパイン処理</td><td>機械的解離は、ライブ単一細胞懸濁液を生成するのに十分な、繊細な、しかし組織のあまりに多くの塊を残す回避するのに十分強力である必要があります。インキュベーション/遠心分離期間のための推奨時間および温度を尊重</td></tr><tr><td rowspan="3">ニューロスフェアが表示されたり不十分成長しません</td><td>不適切な温度</td><td> Cを提供している30℃に設定し、そのインキュベーターをチェックorrect温度。 </td></tr><tr><td>破片で除去成長す​​る球</td><td>各ウェルについて、破片の吸引は、媒体の上に十分に行う必要があります。あなたのピペットで培地に入力しないでください</td></tr><tr><td>いくつかの試薬（B27サプリメント、EGF、FGF）の整合性が弱くなり、 </td><td>この完全性は、細胞増殖の制限因子となります。バッチ番号、およびサンプルが保存されていた方法を確認してください。 /融解を避け培養に用いられる任意のサンプリングされた試薬のサイクルを再凍結</td></tr><tr><td>単一細胞の存在</td><td>ニューロスフェアの転送/拡大モードはあまりにも過酷です</td><td>あまりにも多くの球が十分に形成されているため、このステップは、拡張/希釈ステップです。単一細胞に神経球解離を防止するために、転送中に過酷な球体のコレクションを避けます</td></tr><tr><td rowspan="4">マトリゲル上の細胞の不在</td><td>マトリゲルは、適切に希釈/解凍されませんでした</td><td> -20°Cからマトリゲルは、解凍し、4℃で少なくとも30分を必要とし、慎重に粘性ピペットのまま</td></tr><tr><td rowspan="2">マトリゲルには接着しません</td><td>細胞懸濁液の体積は、マトリゲルコートの細胞付着を可能にするのに十分に小さくなければなりません</td></tr><tr><td>細胞堆積のためのより多くの時間を許可する（2時間までの大容量が使用されている場合） </td></tr><tr><td>新鮮な分化培地寒すぎます</td><td>細胞付着培地を交換するときは、分化培地は、堆積細胞の熱衝撃を防ぐために30℃まで温めする必要があります</td></tr><tr><td rowspan="2">悪いヌクレオ</td><td>死細胞</td><td>ヌクレオを実行中に気泡を発生させないことを確認します。マキシ準備を用いて高品質のDNAベクターを使用してください。ヌクレオ後2時間、新鮮Z分化条件培地またはZ条件培地のいずれかを使用して培地を交換する - 少なくとも1。 </TD&gt; </tr><tr><td>いくつかの肯定的なニューロスフェア</td><td>様々なサイズのニューロスフェアは、貧しいヌクレオにつながることができます。 DIV2とDIV3で、神経球を使用すると、ヌクレオに最適です。細胞の密度は、4×10 3の神経球のml -1の100ミリリットルの反応でを超えてはなりません。 </td></tr></tbody></table> 表1： トラブルシューティングのアドバイスは、 それらを克服するために 議定書、 可能性のある問題と解決方法 の各ステップのために、リスト 。

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K ビュー.  Yale University. ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

発生生物学

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

単離と大人の犬の海馬神経前駆体の拡大

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

ナノ粒子を介した siRNA 遺伝子サイレンシング アダルト ゼブラフィッシュ心臓で

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

骨組織の再生にプレドニゾロンの効果を研究する大人のゼブラフィッシュ傷害モデル

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...