This work was supported by the National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia grants (#568969 and 1004152).

New South Wales, Avustralya hukuku uyarınca ölüm sonrası beyin dokusu, çalışmayla ilgisi olmayan nedenlerden dolayı ötenazi yetişkin köpekler elde edildi. Kültür Ortamı 1. Hazırlık <ol><li> damıtılmış suyun 100 ml jelatin tozu 0.1 g ilave edilir ve çözünene değin 37 ° C&#39;de ajite ile% 0.1 jelatin çözeltisi hazırlayın. 15 dakika boyunca UV-ışını ile çözelti sterilize edin. Bu ortam daha sonra 1 ay kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> DMEM, 500 ml (4.5 g / L D-glikoz) F-12 167 ml ilave etmek suretiyle Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ve besleyici karışımı F12: 1 oranında 3 hazırlayın. (% 1 son konsantrasyon için) Penisilin / streptomisin solüsyonu 6.7 ml ilave edilir. Bu ortam, 1 aya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir. </li><li> DMEM (4.5 g / L D-glikoz), 440 ml birleştirerek serum ortamında 500 ml hazırlanması 5 mi L-alanil-L-glutamin dipeptit (200 mM), penisilin / streptomisin ve 5 ml ve fetal Bovin 50 mie serumu (FBS). Bu ortam, 1 aya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir. </li><li> Tam büyüme ortamı Kök Hücre, nötr (NSC) Bazal Orta ve çoğalma Sinir Ek A (NS-A),% 2 FBS, 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF). Bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar, bu ortam, taze beyin diseksiyon hemen önce ve sıcak sağlayın. </li></ol> 2. Beyin Ekstraksiyon <ol><li> Povidon-iyot kullanarak köpeğin kafasının dorsal yüzeyini sterilize 6 saat otopsisi içinde çıkarma başlayın. </li><li> Bir neşter kullanılarak, altta yatan masseter kasları ortaya çıkarmak için, kafatası tüm dorsal yüzeyi boyunca, sagital orta hat boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak. bu kesim uzunluğu köpek türleri ve yaşına göre değişir. </li><li> Kafatası rostral ve kaudal sınırlarda ek 5 yapmak - her iki tarafta 10 cm dik keser, pasSırasıyla gözlerin ve kulakların arkasında ing cilt tamamen yansıtılması için izin vermek. </li><li> Bir neşter kullanılarak, kafatasının sagital tepe onların ekten masseter kasları ayırmak ve kafatası kalan bağ dokusu kazıyın. </li><li> bir salınım kemiği kullanarak çevresel doğrultusunda kafatası kap kesti testere. Bir prob kullanılarak ya da dura ile kalan ekleri sever neşter ve sonra dikkatlice kafatası kapağı çıkarın beyin dorsal yüzeyini ortaya çıkarmak. Dikkat: Kemik kalınlığı kafatası farklı bölgelerde değişiklik gösterir, bu yüzden dikkatli çok derin nüfuz ve altta yatan beyin zarar vermeyecek olunmalıdır. </li><li> Üst servikal omurlar arasındaki bir neşter takarak omurilik Sever. </li><li> yavaşça beyin kaldırmak için tek elle dikkatlice kranial fossa beyin özgür ve ventral tarafta bulunan bağlantı sinirler ve kan damarları sever için bir neşter kullanabilirsiniz. Yavaşça b asansörKafatasının üzerinden ve DPBS bir kap içine yağmur. Dikkat: köpek beynin büyük koku ampuller ön fossa derinliklerine uzatabilir. beyin çıkartırken bu yapıları korumak amacıyla dikkatli olunmalıdır. </li></ol> 3. Hipokampal Diseksiyon <ol><li> 150 mm Petri kabı üzerine herhangi bir kan çıkarın ve aşağı doğru sırt tarafında yerleştirmek Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) içinde beyin durulayın. </li><li> Yavaş yavaş ıslak beyin bıçak ve bıçak tam uzunlukta kullanan bir tek dilim kullanarak mid-sagital düzlemde uzunlamasına beyin bisect. Ek aşağı yönlü baskı uygulayabilir veya bu dokuya zarar verebileceğinden, bir testere hareketi kullanmayın. </li><li> Her yarımkürede medial, yukarı yüzey bir neşter ve ince forseps kullanarak hipokampus teşrih ve 35 mm doku kültürü çanak aktarın yerleştirilmesi. </li></ol> Sinir Öncü Hücreler 4. İzolasyon <ol><li> t kıymayaklaşık 1 mm 3 adet içine neşter bıçak kullanarak sorunu örnekleri. </li><li> , 15 ml&#39;lik bir tüp içine doku transferi% 0.1 tripsin EDTA 2 ml ekleyin ve 37 ° C&#39;de bir su banyosunda 7 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> tüpe serum ortamında 4 ml ekleyerek enzim reaksiyonu durdurur. 7 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ile süspansiyon pelet ve supernatant çıkarın. </li><li> DPBS 300 ul Topak tekrar askıda bırakılmıştır ve mekanik hafifçe düz bir homojenat oluşana dek, 1000 ul pipet kullanarak aşağı ve yukarı pipetlenerek sonucu ayrılır. </li><li> tüp, serum medya 14 ml ekleyin ve 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçmektedir. 7 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ile süspansiyon topak süpernatantı kaldırmak ve tam büyüme ortamında tekrar süspansiyon. </li></ol> 5. Neurosphere Kültür <ol><li> izolasyon elde edilen hücre süspansiyonu, Tripan mavisi ve hemo kullanarak yaşayan hücrelerin sayısınısitometre. </li><li> 6 yuvalı plaka kaplanmamış kuyulara 1 x 10 5 hücre / cm2&#39;de tam büyüme ortamında tohum hücre süspansiyonu ile seyreltilir. </li><li> 37 ° C&#39;de 14,% 5 CO2 ve&gt;% 95 nem inkübe - 28 gün, her 7 günde bir büyüme ortamı% 50&#39;sini. Düzenli neurospheres çapını ölçün. çapı 100 mikron ötesinde büyümeye izin verseydi, hücre ölümü ve spontan farklılaşma neurospheres içinde oluşabilir. </li></ol> 6. Neurosphere Passage <ol><li> Neurospheres yaklaşık 100 mikron çapında ulaşmak kayan kültür olarak geçit, tek bir tüp içine tüm neurosphere içeren medyayı birleştirir. 7 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ile pelet ve süpernatant kaldırmak. </li><li> % 0.1 tripsin EDTA 1 ml pelet yeniden süspanse edin ve 37 ° C&#39;de bir su banyosunda 7 dakika boyunca inkübe edin. Yavaşça yukarı pipet ve 100 kat aşağı, 200 ul pipet kullanarak, dissociati sağlamakneurospheres üzerinde. </li><li> 7 dakika boyunca 100 x g&#39;de tüp ve santrifüj serum ortamında 5 ml ilave enzim reaksiyonu durdurur. </li><li> Süpernatantı 1 ml hücre pelletini tam büyüme ortamı tekrar süspansiyon ve Tripan mavi boya dışlanma ve hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını. </li><li> 6 yuvalı plaka kaplanmamış kuyulara 1 x 10 5 hücre / cm2&#39;de tam büyüme ortamında tohum hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Her 7 gün büyüme ortamı% 50 yerine, 28 gün - 37 ° C, 14% 5 CO2 ve&gt;% 95 nemde inkübe edin. </li></ol> 7. Yapışık Kültür Sinir Öncü Hücreler <ol><li> önceden yapışkan kültür Neurospheres işlem 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde doku kültürü çanağı ve tedavi yüzeyini kapsayacak şekilde% 0.1 jelatin solüsyonu yeterli bir hacim. </li><li> Yüzen neurosphere kültürü, tek bir tüp içine tüm medya birleştirir. neur pelet100 x g&#39;de santrifüj ile ospheres 7 dakika ve süpernatan. </li><li> % 0.1 tripsin EDTA 1 ml pelet yeniden süspanse edin ve 37 ° C&#39;de bir su banyosunda 7 dakika boyunca inkübe edin. Yavaşça yukarı pipet ve 100 kat aşağı, 200 ul pipet kullanarak. </li><li> 7 dakika boyunca 100 x g&#39;de Enzim reaksiyonu ve santrifüj durdurmak için serum ortamında 5 ml. Süpernatantı atın ve tam büyüme ortamı 1 ml hücre pelletini ve Tripan mavi boya dışlanma ve hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını. </li><li> Tam büyüme ortamında hücre süspansiyonu seyreltilir doku kültürü şişelerinden jelatin çıkarın ve / cm2, 1 x 10 4 hücre hücreleri tohum. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 ve&gt;% 95 nemde inkübe hücreleri. Kültür yaklaşık% 80 izdiham (yaklaşık 7 gün sonra) ulaşıncaya kadar her üç günde bir, taze, ısındı, tam büyüme ortamı ile değiştirin. </li></ol> 8. Neural Koloni Oluşturan Deneyi <ol><li> Sinir Koloni oluşturan hücre (NCFC) Analiz ortamı bileşenleri Birleştir: NCFC serum barındırmayan ortam, çoğalma NS-A, ve kolajen çözeltisi (3 mg / ml). / Ml heparin 2 ug, 20 ng / ml EGF ve 10 ng / ml bFGF, bu ortam ilavesi. </li><li> Deney ortamı oluşturan nöral koloni hücreler hipokamp dokusunda ayrışma tekrar süspansiyon haline sonra, bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış. 35 mm kültür tabağı içine 1.1 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir klonal yoğunlukta hücreler tohumu. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 ve&gt;% 95 nem oranında, bu yan-katı kollajen matris hücreleri inkübe edin. 28 gün süre ile kültür, her 7 günde bir büyüme ortamı% 50 değiştirilmesi. </li></ol> Sinir Öncü Hücreler 9. Farklılaşma <ol><li> Differentia hücreleri işlemeden önce 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde doku kültürü çanağı ve tedavi yüzeyini kapsayacak şekilde 5 ug / cm 2 laminin solüsyonu yeterli bir hacmi eklemeyon. Not: laminin çözüm çıkarın ve tohumlama hemen önce DPBS iki kez kaplanmış yüzey durulama. </li><li> Pasaj olduğunda, DMEM-F12, 1 x 10 4 hücre / cm2&#39;de hücre süspansiyonu tohum (3: 1) üzerinde 20 ng / ml EGF ve 40 ng / ml bFGF ile takviye edilmiş ortam (önceden ısıtılmış 37 ° C) laminin kültür çanak kaplı. </li><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve&gt;% 95 nem hücreleri inkübe ve hücreler 3 gün süreyle çoğalmaya izin verir. </li><li> (3: 1) Medya 37 ° C önceden ısıtılmış, 10 ng nörotrofik faktör (BDNF) türetilmiş / ml beyin ile desteklenmiş 3 gün DMEM-F12 içeren farklılaşma medya ile medya yerine sonra, yapışık nöral prekürsör hücreleri ayırt etmek. </li><li> farklılaşma sırasında her 3 günde bir ortamın% 50&#39;sini. 28 gün - Farklılaşma yaklaşık 21 boyunca yavaş yavaş ortaya çıkar. Dikkat: hücrelerin ayırt başladığı zaman, sadece bir ti ortam% 50&#39;sinihavaya maruz kalma gibi me hücrelerinin sağlığı üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kheirbek, M. A., Hen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+vs+ventral+hippocampal+neurogenesis:+implications+for+cognition+and+mood.">Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood.</a> Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).</li><li>Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+environmental+regulation+of+neurogenesis+along+the+septo-temporal+axis+of+the+hippocampus.">Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus.</a> Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nat Med. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Bull, N. D., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+hippocampal+progenitor+is+neurogenic+but+not+a+stem+cell.">The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell.</a> J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).</li><li>Kempermann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+physical+activity+promotes+experience-induced+brain+plasticity.">Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity.</a> Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).</li><li>Golmohammadi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).</li><li>Lowe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+and+precursor+cell+differences+in+the+dorsal+and+ventral+adult+canine+hippocampus.">Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus.</a> Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).</li><li>Sasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+identification+of+dorsal+hippocampus+homologue+in+human+brain.">MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain.</a> Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).</li><li>Powell, E. W., Hines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Hippocampus. , 41-59 (1975).</li><li>Jung, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+hippocampal+formation+composited+into+three-dimensional+structure+using+MPRAGE.">Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE.</a> J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+precursor+cells+and+neuroblasts+from+embryonic+and+adult+central+nervous+system.">Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system.</a> Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).</li><li>Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mammalian+brain:+isolation+protocols+and+maintenance+conditions.">Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions.</a> INTECH Open Access Publisher. , (2012).</li><li>Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+culture:+neurosphere+generation,+microscopical+analysis+and+cryopreservation.">Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation.</a> Nat Protoc. , (2006).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (45), e2393 (2010).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+two+cultures:+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice.">One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> J Vis Exp. (84), e51225 (2014).</li><li>Lim, J. -. H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+adult+canine+brains.">Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains.</a> Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).</li><li>Herranz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneously+Arising+Canine+Glioma+as+a+Potential+Model+for+Human+Glioma.">Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma.</a> J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).</li><li>Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+neural+precursor+cell+regions+in+the+rostral+subventricular+zone,+hippocampal+subgranular+zone+and+cerebellum+of+the+dog+(Canis+lupus+familiaris).">Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris).</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).</li><li>Walton, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+in+neural+progenitor+cells+in+a+dog+model+of+lysosomal+storage+disease.">Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).</li><li>Milward, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+multipotential+populations+of+epidermal+growth+factor-responsive,+neural+progenitor+cells+from+the+canine+brain.">Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain.</a> J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).</li><li>Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+differentiation,+and+long-term+culture+of+primary+hippocampal+neurons.">Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).</li><li>Palmer, T., Ray, J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-2-responsive+neuronal+progenitors+reside+in+proliferative+and+quiescent+regions+of+the+adult+rodent+brain.">FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain.</a> Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).</li><li>Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+progenitor+cell+responsiveness+to+cytokines.">Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines.</a> J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).</li><li>Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -. H., Magnuson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen+and+substrate+differentially+affect+the+lineage+restriction+of+adult+rat+subventricular+zone+neural+precursor+cell+populations.">Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations.</a> Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).</li><li>Kennedy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+survival+characteristics+of+rat+glial+cells+in+culture.">Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).</li><li>Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+and+time+interval+for+culture+of+postmortem+neurons+from+adult+rat+cortex.">Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex.</a> J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).</li><li>Huat, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+enhances+cell+proliferation+and+survival+during+early+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+to+neural+progenitor-like+cells.">IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells.</a> BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).</li><li>Supeno, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+acts+as+controlling+switch+for+long-term+proliferation+and+maintenance+of+EGF/FGF-responsive+striatal+neural+stem+cells.">IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells.</a> Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).</li><li>Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+enhances+the+differentiation+but+not+the+survival+of+CNS+stem+cell-derived+neuronal+precursors.">BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors.</a> J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).</li><li>Wohl, C. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+enhances+neuronal+proliferation+and+astroglial+differentiation+in+cultures+of+CNS+stem+cell-derived+precursors.">Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors.</a> J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).</li><li>Araujo, D. M., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+effects+of+interleukin-4,-7+and-8+on+hippocampal+neuronal+cultures:+potential+involvement+of+glial-derived+factors.">Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors.</a> Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Conti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-independent+symmetrical+self-renewal+of+a+mammalian+tissue+stem+cell.">Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell.</a> PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).</li><li>Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherent+neural+stem+(NS)+cells+from+fetal+and+adult+forebrain.">Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain.</a> Cereb Cortex. 16, 112-120 (2006).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-extracellular+matrix+interactions+regulate+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).</li><li>Goffredo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+the+conditions+for+efficient,+robust+and+reproducible+generation+of+functionally+active+neurons+from+adult+subventricular+zone-derived+neural+stem+cells.">Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells.</a> Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada anlatılan protokoller hücre canlılığını maksimize etmek için elverişli kültür koşullarını korumak için optimize edilmiştir. ekstraksiyon, izolasyonu ve genişleme sırasında alınan hız ve bakım kritik önem taşımaktadır. yapışık tek tabaka genişleme kurulması için kritik bir adım birincil neurospheres etkin ayrışma olduğunu. geçit ardından, yeterince Neurospheres ikincil yüzen neurospheres oluşturabilir ayrışmış. Medya değişikliği sırasında bu Neurospheres kaldırılır ayrışmış ve yapışık tek tabaka geçişi için reseeded olabilir. sonrası ayrılma hücre yaşayabilirliği% 80 in altında ise, tersine, bu ayrılma sırasında aşırı pipetleme göstergesi olabilir. Sinir ön-madde hücreleri, ve özellikle farklılaşmış meslektaşları, fizyolojik aralık dışındaki pH değişiklikleri ve havaya maruz duyarlıdır. Ani yaygın hücre ölümü gözlem bu faktörlere bağlı olabilir. Medya chan sırasında Sonuç olarak, kritik bir adımdırges medya taze her zaman yapılacak ve hacminin sadece% 50&#39;sini değiştirilecek içindir. Mitojenik faktör EGF ve bFGF in vitro 22,23 serum içermeyen koşullar altında yaşamda kalma ve hipokampal nöral öncülerinin proliferasyonunu desteklemesidir Son olarak, bu mitojenlere hücresel yanıt, hücre gelişim yaş ve mitojenik konsantrasyonu 24,25 son derece bağlıdır. Bu nedenle, bu bileşenler çok az deney varyasyon temin tutarlı ve tekrarlanabilir hücre kültürlerinin üretilmesi için çok önemlidir. Maksimum canlılık, hücreler 6 saat sonra ölüm içinde kültüre ekildi edilmelidir. Bununla birlikte, ekstre beyin geçici 4 ° C&#39;de PBS içinde depolanabilir. Bu değişiklik, hücre verimi 26,27 minimal azalma ile 24 saate kadar gecikmeli olarak yalıtım izin verebilir. Kültür ortamı büyüme faktörü takviyesi de proliferasyonu arttırmak veya Ayırıcı teşvik etmek için modifiye edilebilirBelirli bir nöral hücre tiplerinin ntiation. Farklılaşma şartlar altında ön-nöronal faktör BDNF 30 faktörler ile bağlantılı olarak kullanılabilir iken insülin-benzeri büyüme faktörü 1 (100 ng / ml) in vitro 28,29 kemirgen nöral kök hücreleri üzerinde destekleyici bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir İnterlökin 7 ya da retinoik asit (500 ng / ml&#39;de) (0.1 uM), nöronal alt ya da glial farklılaşma 31,32 doğru bir önyargı uyarılması için. yüzen neurospheres olarak veya bir yapışık tek tabaka olarak nöral prekürsör hücreleri genişletmek için konusunda karar büyük ölçüde istenilen çıkış uygulamalar ve kültür özelliklerine bağlıdır. neurosphere kültür sistemi basit ve yüksek oranda çoğaltılabilir olmakla birlikte, bu hücrelerin homojen popülasyonları üretmek için yeteneği sınırlıdır. Her alanı içinde karmaşık mikroçevresinin, temsilcisi ise apoptoz ve spontan farklılaşma, heterojen bir nüfusa 33 teşvik teşvik edebilirNöral prekürsör hücre popülasyonlarının 34 kantifikasyonunu bulandırabilir neurospheres orted füzyon. Ayrıca, neurosphere geçişi için gerekli tekrarlanan mekanik ayrıştırma da zararlı stres, yaşlanma ya da hücre ölümüne yol açabilir. Alternatif ayrışma enzim kullanımı, örneğin papain gibi, elde edilen hücre canlılığı 16 etkileyebilir. Bunun aksine, yapışkan tek tabakalı kültürü sistemi, çevre mitojenlere daha muntazam maruz hücre tipi ve daha simetrik bölümü daha büyük bir homojenlik teşvik eder. Bu sistem, temel kök hücre belirteçleri 35,36 sentezlenmesi göre bir hücre niş bağımsız bir popülasyonu üretmek için gösterilmiştir. Bu sistem, hücre yapışmasını geliştirmek için önceden kaplanmış kültür teknelerinin kullanılmasını gerektirir. Bu kültüre nöral öncüleri 25,37 farklılaşması profilinde önemli etkilere sahip olabilir Kültür alt-tabaka seçimi, dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır. Here biz taze post mortem doku yetişkin köpek hipokampal nöral öncü hücrelerin izolasyonu, genişlemesi ve farklılaşması için etkili protokolleri sunuyoruz. Yetişkin köpek nöral öncüleri literatürde 18 altında temsil edilmektedir; izolasyon ve genişleme için tam protokoller, daha az yani 17 ile. Bizim protokoller daha sonra bu değerli hayvan modelinde bilincini artırmak ve çalışmaların bu mütevazı sayıda önemli ek temsil etmek hizmet edebilir. önemi, eşsiz yöntemi kullanarak, yetişkin köpek hipokampal nöral öncüleri başarıyla 10&#39;dan fazla nüfus çiftlenmeler genişletilebilir. Çapı 150 mikron, beşinci nesil 17 ötesinde çoğalmasını durdurdu - yetişkin köpek hipokampal nöral öncüsü kullanılarak benzer bir çalışma 100&#39;de pasajlandı büyük Neurospheres, bildirdi. Bizim protokolde belirtildiği gibi, aşırı neurosphere büyüme l olabilir seri geçit üzerinde olan spontan farklılaşma ve apoptoz teşvik edebilirBuna Ed çoğalma yeteneklerini azalttığını göstermektedir. Ayrıca, klasik neurosphere şişirme sisteminin 17-21 alternatif olarak, bu hücre popülasyonu yapışık tek tabaka genişletme için bir protokol sağlar. Bu alternatif sistem, hücresel çevre üzerinde kullanıcı daha fazla kontrol tanıyor ve anlamlı fenotipik homojenizasyon ve yönetmenliğini nöronal farklılaşma 35,38 potansiyeline sahip, bu hücreler için aşağı uygulama yelpazesini genişletmektedir. Kültürlü yetişkin köpek hipokampal nöral prekürsör hücreleri hücresel ve nörobiyolojik araştırma alanları geniş bir yelpazesinde uygulamalar var. köpek beyin mevcut kemirgen modellerinde daha insan beynine yakın bir homoloji sahiptir. Bu nedenle, yetişkin köpek nöral öncü hücreleri önemli bir, henüz understudied, kaynak temsil etmektedir. Bu hücreler insanlarda yetişkin nöron arkasında mekanizmalarına daha fazla fikir edinmek için kullanılabilir ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için olabileceğini targarkadaşları bu süreç.

Regional variations in the rate of neurogenesis have been observed along the dorsoventral axis of the rodent hippocampus1,2. Furthermore, the rates of hippocampal neurogenesis also show distinct inter-species variation, with precursor cell turnover in the subgranular zone shown to be significantly lower in adult humans than in rodents3-5. Inter-species differences in hippocampal structural anatomy may be relevant here, as it has been postulated that neural stem cell distribution along the murine ventricular neuraxis may be influenced by cephalic flexures during embryological development6. To date, the rodent brain remains the most popular system in which to study adult neurogenesis. However, the brain of the domestic dog (Canis familiaris), with a size and structural organization intermediate between that of humans and rodents7, represents a valuable yet highly underused animal model. The canine hippocampus in particular embodies this structurally intermediate nature8-10 and can provide a unique perspective on intrinsic variations in neural precursor cell populations. With many closer parallels to the human brain, the canine model may also offer insight into the biology of adult human neurogenesis.
In vitro culture assays have become a key tool for the study of neural precursors and the cellular and biomolecular processes of adult neurogenesis. The neurosphere assay and adherent monolayer culture represent the two predominant systems for expanding neural precursor cells in vitro11-13. Protocols for brain extraction, hippocampal microdissection or neural precursor culture assays have been well documented for the rodent model14-16. However, for the adult canine brain they remain comparatively few17,18, focused instead on fetal or neonatal tissue19-21.
In our published study7 we investigated regional variations in neurogenesis and neural precursor cell populations across the dorsoventral axis of the adult canine hippocampus. Although highly dependent on breed, adulthood in canines is reached between 1 and 3 years of age. Here, we present detailed methods for the extraction, isolation and culture of neural precursor cells from the canine hippocampus. We provide systematic protocols for the expansion of neural precursor cells as both floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, and for their subsequent differentiation into mature neural cell types.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1699">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">1000 &#956;L filtered pipette tip</td>
			<td style="width:196px;">Axygen</td>
			<td style="width:252px;">TF1000</td>
			<td style="width:915px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm petri dish</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:252px;">351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:196px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:252px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#956;L filtered pipette tip</td>
			<td style="width:196px;">Axygen</td>
			<td style="width:252px;">TF200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:196px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:252px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:252px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:252px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 well culture plate</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:252px;">351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">B-27 Supplement (50X) serum free</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:252px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td style="width:196px;">Millipore</td>
			<td style="width:252px;">GF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>04902</td>
			<td>Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (4.5g/L, D-glucose) 500mL</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:252px;">11960044&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">DPBS</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:252px;">354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F-12 nutrient mixture (Ham) (1X) Liquid</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin from Porcine Skin Type A</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:252px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin sodium salt from (porcine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:252px;">H314950KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin (mouse)</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCFC serum free medium (NeuroCult)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5720</td>
			<td>Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proliferation NS-A (NeuroCult)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:252px;">05773</td>
			<td>Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771&#160; from Stem Cell Technologies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSC basal medium (Rat; NeuroCult)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:252px;">5770</td>
			<td>Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Povidone-iodine</td>
			<td style="width:196px;">Munipharma</td>
			<td style="width:252px;">Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:252px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Class II biological safety cabinet</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:252px;">Safe 2020 1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain knife (disposable)</td>
			<td style="width:196px;">Macroknife</td>
			<td style="width:252px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:252px;">HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:196px;">Hettich</td>
			<td style="width:252px;">Universal 320R</td>
			<td style="width:915px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont</td>
			<td style="width:252px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Easypet Electric pipette</td>
			<td style="width:196px;">Eppindorf&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:196px;">Boeco</td>
			<td style="width:252px;">Bright-Line Improved Neubauer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Manual pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Eppindorf research</td>
			<td style="width:252px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oscillating bone saw&#160;</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blades (No.21)</td>
			<td style="width:196px;">Paramount</td>
			<td style="width:252px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Delta</td>
			<td style="width:252px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td style="width:196px;">Grant</td>
			<td style="width:252px;">JB Aqua 18 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of adult canine hippocampal neural precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

In vitro sinir habercisi deneyleri, nöron ve sinir öncü hücre popülasyonlarının kullanımı sayesinde karakterize ve yetişkin köpek hipokampusun dorsoventral ekseni üzerinde karşılaştırıldı. İzole hipokampal doku türetilen sinir ön-madde hücreleri, kültür, 100 um 28 ile günlük bir çapa ulaşmaktadır izolasyon 14 gün içinde Neurospheres kayan Oluşan. dorsal ve ventral izolatlardan türetilmiş Neurospheres ortalama boyutta bir fark gösterdi ve tek tek hücreler içine enzimatik ayrılma sonrasında neurosphere kültürleri değişken olarak geçişli olabilir. Her iki hipokampal bölgelerden ikincil yüzen Neurospheres geçit itibaren 5 gün içinde oluşturmak başardık. % 0.1 jelatin kaplı kültür şişeleri üzerine 1 x 10 4 hücre / cm 2 numaralı seribaşı zaman nöral öncü hücreler olarak da yapışık mono tabakaları (Şekil 1A) çoğalırlar başardık. Resim morfolojik farklılıklar betwee gözlenmiştirn dorsal ve ventral hipokampal nöral prekürsör hücreleri ve her ikisi de yapışık kültürler herhangi geçit-time (Şekil 1B) yavaşlama gözlenen olmadan 10 yaş üstü nüfus çiftlenmeler geçmesi başardık. Yapışık kültüründe Nestin ve Sox2 nöral kök hücre gen ifadesi (Şekil 2) hipokampal dorsoventral eksen boyunca önemli ölçüde farklı değildi. Bu hücrelerin sinir habercisi kimliğini doğrulayan gen ve protein ifade Daha kapsamlı karakterizasyonu, bizim yayınladığı verilere 7 bildirilmiştir. Uyarlanmış Sinir Koloni Oluşturan tahlil 4,6 kullanarak biz dorsal karşısında sinir öncü hücre popülasyonlarının ve köpek hipokampus ventral alt bölgelerinde potansiyel farklılıkları ölçmek amacıyla nöral prekürsör hücre frekansı değerlendirildi. Hücreler, Şekil 3A (hücre füzyonu önleyen bir yan-katı kollajen matris içinde klonal yoğunlukta ekildi ve 28 gün boyunca kültüre edilmiştir </strong&gt;). Konusu karşılaştırma içinde ventral hipokampal türetilen kültürleri (3.6 ± 1.7 ile karşılaştırıldığında dorsal (7.3 ± 2.0), birim alan başına daha büyük bir küre, bir önemli derecede daha sık ortaya n = 5; tekrar edilen ANOVA ölçümleri F = 96.8; p = 0.001; Şekil 3B ). farklılaşma koşullar altında, yapışık köpek nöral öncü hücreler daha uzun ve daha ayrıntılı işlemler geliştirilmesi, brüt morfolojisi ilerleyici değişiklikler gösterdi. Nöronal (βIII-tübülin) ve glial (Glial fibriler asidik protein; GFAP) için protein ifade belirteçleri de farklılaşma (Şekil 4) Aşağıdaki arttı. Anlamlı fark dorsal ve ventral izolatlar arasında pozitif etiketli hücrelerin sayısı görülmektedir. Bizim daha önce yayınlanmış veriler up-regülasyonu ilişkili genlerin nöral aşağı-regülasyonu ile birlikte gösteren, bu protein ifade değişiklikleri doğrular<html> 28 gün farklılaşma dönemi 7 üzerinde habercisi genler. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54953/54953fig1.jpg" /> Şekil 1:. Dorsal ve ventral hipokampal bölgelerinden izole yetişkin köpek Hipokampal Sinir Öncü Hücreler in vitro artışı hem yetişkin köpek hipokampal nöral ön-madde hücreleri, (A) değişken neurospheres veya yapışkan bir tek tabaka (B) olarak genişletilir (C) gibi. yapışık tek tabaka bu nöral öncü hücreler hızını iki katına önemli bir düşüş olmadan 10 defadan fazla geçişini geçirebileceği. n = 5; ölçek = 50 mikron. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54953/54953fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /ftp_upload/54953/54953fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2:. Üreyen yetişkin köpek Hipokampal Sinir Öncü hücrelerinde gen ekspresyonu sinir kök hücre genlerin ifadesi (A) Nestin (B) Sox2 yapışık proliferatif kültür koşulları altında yetişkin köpek hipokampal nöral öncü hücrelerin doğrulanmıştır. Bu genlerin sentezlenmesi dorsal ve ventral hipokampüs türetilmiş hücreler, hem de eşit düzeydedir. Yetişkin köpek fibroblastlar göreceli gen ifadesi farklılıkları karşılaştırmak için bir kontrol çizgisi olarak kullanılmıştır. n = 5; Hata çubukları, = SEM. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54953/54953fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54953/54953fig3.jpg" /> Şekil 3:. Sinir Koloni Oluşturan Deneyi (A)Bir yan-katı kollajen matrisi içine klonal yoğunlukta ekildi yetişkin köpek nöral ön-madde hücreleri, kültür 28 gün içinde bir şekilde Neurospheres. (B), dorsal hipokamp türetilen sinir ön-madde hücreleri, türetilenler göre birim alan başına neurospheres önemli ölçüde daha büyük sayılar üretmek ventral hippocampus. n = 5; Hata çubukları = SEM; ölçek = 50 mikron. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54953/54953fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54953/54953fig4.jpg" /> Şekil 4:. Farklılaştırılmış Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncü Hücreler İmmünositokimya 28 gün BDNF kültüre, dorsal ve ventral hipokampus hem yetişkin köpek nöral öncüleri olgun nöronal (βIII-tübülin po içine ayırtsas) ve glial (GFAP pozitif) hücre türleri. n = 5; ölçek = 50 mikron. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54953/54953fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors at JoVE.com

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

köpek beyin yetişkin nörogenezi incelemek için değerli bir modeldir. izole ve primer beyin dokusundan yetişkin köpek hipokampal nöral prekürsör hücrelerin genişletilmesi için protokoller burada sundu.

İzolasyon ve Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncüleri genişletilmesi

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

isolation-and-expansion-of-adult-canine-hippocampal-neural-precursors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.0K Görüntüleme.  University of Sydney.  köpek beyin yetişkin nörogenezi incelemek için değerli bir modeldir. izole ve primer beyin dokusundan yetişkin köpek hipokampal nöral prekürsör hücrelerin genişletilmesi için protokoller burada sundu. 

Video: Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Gelişim Biyolojisi

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

Türetme ve köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a method whereby live-cell flow cytometry is extended upon to analyze the multiple functions of P2X7 receptor activation in real-time. Using a time module installed on a flow cytometer, live-cell functionality can be assessed and plotted over a given time period to explore the kinetics of calcium influx, transmembrane pore formation, and phagocytosis. This simple method is advantageous as all three canonical functions of the P2X7 receptor can be assessed using one machine, and the gathered data plotted over time provides information on the entire live-cell population rather than single-cell recordings often obtained using technically challenging patch-clamp methods. Calcium influx experiments use a calcium indicator dye, while P2X7 pore formation assays rely on ethidium bromide being allowed to pass through the transmembrane pore formed upon high agonist concentrations. Yellow-green (YG) latex beads are utilized to measure phagocytosis. Specific agonists and antagonists are applied to investigate the effects of P2X7 receptor activity. Individually, these methods can be modified to provide quantitative data on any number of calcium channels and purinergic and scavenger receptors. Taken together, they highlight how the use of real-time live-cell flow cytometry is a rapid, cost-effective, reproducible, and quantifiable method to investigate P2X7 receptor function.

Providing single-cell sensitivity, real-time flow cytometry is uniquely suited to quantify multimodal receptor functions of live cultures. Using adult neural progenitor cells, the P2X7 receptor function was assessed via calcium influx detected by calcium indicator dye, transmembrane pore formation by ethidium bromide uptake, and phagocytosis using fluorescent latex beads.

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...