Yazarlar yararlı tartışmalar için Dr. F. Kateb ve Dr G. Bertho yanı sıra, ekipman seçimi ve montaj yardım için Dr JJ van der Klink teşekkür ederim. AC İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (PPOOP2_157547 hibe) tarafından desteklenmiştir. Biz Paris Sorbonne Cité (NMR Com, DIM Analytics, Ville de Paris, Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708) ve Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK finansman kabul. Ekibimiz Equipex programlarının Paris-en-rezonans parçasıdır ve CACSICE.

Not: Bütün veriler analiz ticari yazılımı kullanılarak yapıldı. 1. Polarize Çözüm hazırlayın <ol><li> Bir 1.12 M, 13C-etiketli sodyum piruvat 2 mi hazırlama (Na + [CH3-CO- 13 COO-] -, alt-tabaka) çözeltisi kökü TEMPOL 33 mM katkılı (4-hidroksi-2,2,6,6- tetrametilpiperidin-1-oksil, polarize madde) 4, 2: 1 D 2 O / D 13 C gözlemler için 6 -etanol. DİKKAT: Kullanım önlemleri nedeniyle d6 -etanol yanıcı doğası alınmalıdır. </li><li> Radikal konsantrasyon elde kutuplaşma açısından en uygun olduğundan emin olun. <ol><li> (30 mM veya 35 mM için, örneğin) biraz noktasında 1.1 çözeltinin radikal konsantrasyonunu değiştirin. </li><li> iteratif solid-state geliştirme belirleme (Adım 3) ve maksimum arttırılmasına neden radikal konsantrasyonunu bulmak. </li></ol></li></ol> 2. Polarizatiyon <ol><li> bekleme süresi usulü ile DNP kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;Cooldown&#39; butonuna tıklayın. </li><li> doldurma usulü ile DNP kriyostat sıvı helyum toplayın. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;Dolum&#39; butonuna tıklayın. </li><li> DNP polarize ile sağlanan örnek kapta Adım 1.1 optimize kutuplaştırıcı çözeltisi 300 ul yerleştirin. yumuşak bir sıvı azot banyosu içine daldırılmasıyla içindeki numune ile numune muhafazası dondurun. </li><li> su azot banyosunda örnek kabın açılan ve ters çevirerek dondurma prosedürü (adım 2.3) sonra örnek kap içinde mevcut olabilir, sıvı azot ortadan kaldırır. NOT: Bu adım, örnek tam bir çözünme elde etmek için çok önemli olan (adım 5). </li><li> kriyostat içine örnek yerleştirin. NOT: Bu StEP aşağıdaki alt adımı oluşan (yani, en az 10-20 sn) erime numunenin önlemek için hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. <ol><li> numune tutucu örnek kabı yerleştirin. Ana Kriyostat insert örnek tutucu yerleştirin. numune tutucuya mikrodalga dalga kılavuzu yerleştirin. </li></ol></li><li> 1 K soğutma işlemini başlatarak kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;1K Soğutma&#39; düğmesini tıklayın. </li><li> mikrodalga kaynağını açın ve örnek ışın tedavisi. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;MW-ON &quot;butonuna tıklayın. </li></ol> 3. Solid-state NMR Ölçümleri <ol><li> 90 ° Konnektörü saat yönünün tersine döner ve çekerek spektrometre bobininden NMR konsol algılama kanalı koaksiyel kablosunu çıkarın. kriyostat koaksiyel bağlantı algılama kanalının koaksiyel kablo takınNMR bobin. oryantasyon pin dikkat, kriyostat NMR bobin dişi konnektör NMR konsol kablosunun erkek konnektörü takın; sıkıca bastırın ve 90 ° konektör saat yönünde çevirin. </li><li> T = 5 dakika aralıklarla tekrarlanan un kalibre düşük çevirme açısı darbeleri ile basit bir darbe Edinme sekansı kullanılarak kriyostat yerinde katı halde NMR ısı sinyali ölçer. ölçüm kurduktan sonra, yazılım &#39;ig&#39; komut satırında yazmak ve &#39;Enter&#39; klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. </li><li> DNP geliştirilmiş NMR sinyali ölçün. Bölüm 2&#39;de açıklandığı gibi DNP süreci başlatıldıktan sonra adım 3.2 tekrarlayın işlemleri. </li><li> 90 ° Konnektörü saat yönünün tersine döner ve çekerek kriyostat NMR bobininden NMR konsol algılama kanalı koaksiyel kablosunu çıkarın. deterjanları koaksiyel kablo takınspektrometre bobin koaksiyel konnektörüne ction kanalı. oryantasyon pin dikkat, spektrometre bobin dişi konnektör NMR konsol kablosunun erkek konnektörü takın; sıkıca bastırın ve 90 ° konektör saat yönünde çevirin. </li></ol> 4. Ana Mıknatıs Field ( &#39;terazi ayarına&#39;) &#39;in Homojenliğinde optimize <ol><li> Spektrometresi önceki deneyler (örneğin, Aşama 6.2) sonra üretilen karışımın 500 ul ihtiva eden bir tüp yerleştirin. </li><li> maksimum arama layneri degrade bobinler akım değiştirerek NMR spektrometre shimming gerçekleştirmek döteryum sinyali &#39;kilit&#39;. NMR konsolunda gelen düğmeye basarak ilgili layneri bobini seçin. <ol><li> Kilit sinyalini artırır dönüş yönünü belirlemek için NMR konsolda düğmeyi çevirin. Sinyal maksimum ulaşana kadar dönmeye devam eder. Başka layneri bobini seçin ve maksimizasyonu un tekrartüm shimming bobinler için yerel maksimum til bulunur. Daha fazla bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. Sonunda, kilitleme için kullanılan numuneyi çıkar. </li></ol></li></ol> 5. Fesih <ol><li> Çözünme insert kazandaki D 2 O 5 ml ekleyin. Basınç ile T ≈ 180-200 ° C ulaşana kadar dirençli tel ile D 2 O ısıtın. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;Isıtıcı hazırlayın&#39; butonuna tıklayın. </li><li> Örnek polarizasyon işlemin tamamlanmasından sonra, (örneğin, 3 T DNP sonra), oda basıncının biraz üzerinde Kriyostat basınç. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında &#39;SS operasyonların&#39; düğmesini tıklayın. çözünme insert mikrodalga kılavuzunu çıkarın. </li><li> Numune tutucu içine çözünme insert (Şekil 3B) kaydırın (Şekil 3A-c). Erime uç numune tutucusunun alt ulaşmak zorundadır ve kriyostat D 2 O sızmaması için, numune kabı ile sızdırmaz bir bağlantı kurmak için sıkı bir şekilde itilmesi gerekir. </li><li> Çözünme sekansı, pnömatik valflar işlemleri, önceden belirlenmiş bir zaman ayarlı dizisini başlatmak için donanım tetik (Şekil 3C-H) basın. </li></ol> 6. Enjeksiyon <ol><li> 500 ul örneği içeren çözülme yeri 5 mm NMR tüpü, (örneğin, D 2 O için önce <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> 11.74 T NMR spektrometresi İzomerkez Aşama 9 enzimatik aktivite ölçümleri için Adım 8&#39;den Adım 7 veya LDH çözelti), ölçüm (Adım 4) bakın. </li><li> Sadece çözündürme (aşama 5), ​​Adım 6.1 NMR spektrometresi yer numune ile hiperpolarize çözeltisi 500 ul karıştırın. <ol><li> Manuel Enjeksiyon: hiperpolarize toplamakNMR spektrometresi mıknatısa yakın yerleştirilmiş bir cam beher içinde, bir 2.5 m uzunluğunda bir transfer borusunun sonunda, çözelti. El ile özel yapılmış kılcal sistem içinden NMR tüpte hiperpolarize çözeltisi 500 ul enjekte edilir. </li><li> Otomatik enjeksiyon: çözünme işleminden önce, transfer için kullanılan helyum gazı hyperpolarized çözüm ayıran otomatik ölçüye enjeksiyon cihazına transfer tüpü bağlayın. cihaz otomatik deney tüpüne hiperpolarize çözeltisi 500 ul sağlar. </li></ol></li></ol> 7. Sıvı halde NMR Ölçümü <ol><li> dağılmasından sonra, alt-tabaka (A) manyetizasyon ilerlemesini ve (b) ürünü takip 1.5 sn aralanmış 10 ° dönüş açısı darbe Edinme dizileri bir dizi spektrometresinde numuneden NMR hiperpolarize sinyali ölçer. ölçüm kurduktan sonra, yazılım &#39;ig&#39; komut satırında yazma ve &amp; # tuşuna39; klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. </li><li> Mıknatıslanma, T = 3 T 1 ≈ 3 dakika aralıklı 90 ° dönüş açısı darbe elde dizileri bir dizi (T = 10 T 1, yani sonra), NMR ısı sinyali ölçüm tamamen rahat sonra. ölçüm kurduktan sonra, yazılım &#39;ig&#39; komut satırında yazmak ve &#39;Enter&#39; klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. </li></ol> (Piruvat-to-laktat Dönüşümü için spesifik) enzim içeren Örneklerinde 8. hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki reçete ile reaksiyon tamponu hazırlayın: 50 mM, 0.1 M fosfat tamponu içinde nikotinamid adenin dinükleotit (NADH), 1 mM etilen-diamintetraasetik asit (EDTA), 0.1 mM ditiotreitol (DTT), düşük pH =7.0. </li><li> bir tavşan kas LDH çözeltisi 20 ug / ml bovin serum albümini, BSA ile reaksiyon tamponu içinde taze hazırlanmış 1 U / ml hazırlayın. </li><li> 478 ul reaksiyon tamponu (8.1 Adım) karıştırın, 20 ul D 2 O spektrometre alan stabilizasyon ( &#39;kilit&#39;) ve 2 ul LDH solüsyonu (7.2 Adım) için izin vermek. </li><li> 5 mm NMR tüpü içine Adım 8.3 hazırlanan 500 ul çözüm hacmini yerleştirin ve 500 MHz NMR spektrometresi içine tüp yerleştirin. </li></ol> 9. Komple Enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümü Prosedürü <ol><li> polarizasyon örnek (Adım 1) hazırlayın ve onu (Adım 2) polarize. </li><li> spektrometre (Adım 4) üzerine shimming gerçekleştirin ve enzimatik örneği (Adım 8) hazırlar. </li><li> çözündürme (aşama 5) ve enjeksiyon (Aşama 6) uygulayın. </li><li> 1,5 sn (Adım 7) aralıklı 10 ° çevirme açısı bakliyat satın almalar ile hyperpolarized numuneden gelen sinyallerin bir dizi ölçün. Bu adım hiperpolarize ölçüm veriyorSinyal çürüme ve metabolitleri sinyal birikmesi. </li></ol> 10. Montaj <ol><li> Aşama 9.4&#39;te elde edilen her bir spektrum için, sırasıyla, (A) ve (b) ürünü, substrat ve entegre karşı gelen bir zirve tespit (tepe alanı belirlemek). Zirveleri integraller (denklem 2 bkz M (A, B) (t)) mıknatıslanma zamanı ders sinyallerini veriyor. </li><li> Denkleminin çözümünü (2) kullanarak, K = (RA + K eff değerini belirlemek ) Adım 10.1 entegre substrat sinyalinin basit üstel uyum gelen. </li><li> Değeri F = (R A + k eff kullanma ) Aşama 10.2 belirlenen, denklem entegre ederek elde edilen fonksiyonu ile ürün sinyal M B (t) bir uyum K eff ve Rb belirlenmesi (2). (Temsilcisi sonuçları bölümüne Enzymat bakınReaksiyon modelleme, montaj ve rf düzeltme ile ilgili ayrıntılar için ic faaliyet ve metabolik ölçümler). </li></ol>

<ol>
	<li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+Nuclei+in+Metals.">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li><li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation.">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395 (1978).</li><li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization.">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li><li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+35%+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals.">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li><li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+&gt;+10,000+times+in+liquid-state+NMR.">Increase in signal-to-noise ratio of &gt; 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li><li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy.">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li><li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarized+[2-13C]-Fructose:+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging.">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li><li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels&#8722;Alder+Reaction.">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels&#8722;Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li><li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR.">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li><li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy.">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li><li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism.">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li><li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+[1-13C]Pyruvate.">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108 (2013).</li><li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei:+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research.">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li><li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function.">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li><li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+T-1+limit:+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields.">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003 (2004).</li><li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field.">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505 (2005).</li><li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization.">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li><li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance.">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li><li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution.">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li><li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution.">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li><li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N(2)O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer.">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li><li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells.">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li><li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner.">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li><li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei. 5966, 1-140 (2013).</li><li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization.">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li><li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy.">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li><li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy.">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li><li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems.">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li><li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states.">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li><li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization.">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarları rakip olduğunu beyan

erime DNP NMR deneyinde kritik noktalar şunlardır: deneyler için gerekli olan en düşük ürün konsantrasyonu olarak gerçekleştirilir ve (ii) yaşam süreleri sinyalinin satın alma sayısını belirler: (i) alt-tabaka için elde polarizasyon seviyesi, manyetizasyon, kutuplaşma ve algılama siteleri arasında ve yüzey dönüşüm oranına transfer süresine göre. Burada tarif edilen çözünme DNP kurulum enjeksiyon sistemi kadar az 3-4 olarak sn numune transferi için izin verir. Transferi S. Bowen ve C. Hilty tarafından önerilen yöntemde gibi hızlı olmasa da, piruvat 26 polarizasyon kayıpları düşük alanda orta uzunlamasına rahatlama ile sınırlı kalmıştır. [1- 13C] piruvat, uzun karboksilik nükleer T 1, 10 -3 U / ml kadar düşük konsantrasyonlarda LDH boyunca akışı ölçüm sağlar. <html> yüksek sinyal-gürültü oranı DNP biri bile düşük [1- 13 C] pirüvat konsantrasyonları ve daha düşük enzimatik dönüşüm oranları duyarlı olabileceğini düşündürmektedir çözünme kullanılarak elde edilmiştir. Elde edilen polarizasyon seviyesi önemli bir sinyal-gürültü oranı ile 200&#39;den fazla deney düşük çevirme açısı α = 10 ° kullanarak sıvı-devlet NMR spektrometresi elde edilecek tanıyor. Bu optimizasyon için hem tekrarlama süreleri ve flip açıları bakımından odayı terk eder. Bazı moleküller bazı polarize ajanlar (TEMPO, OXO63) 4 ve diğerleri ile iyi polarize solid-state kutuplaşmanın birikmesi için henüz tam olarak anlaşılamamıştır nedenlerle, yok. Deneysel çalışmalar polarizasyon adım başarılı olup olmadığını belirlemek için tek yol vardır. Polarizasyon düzeyini artırmak için, biri farklı radikal türler 4 ve &#39;çapraz polarizasyon&#39; güvenerek farklı tekniklerin uygulanması kullanımını keşfedebilirsiniz. 25 ontent &quot;&gt; kökü ve alt tabaka konsantrasyonları yanı sıra DNP örnek solvent kompozisyonunun daha fazla optimizasyon polarizasyon geliştirmek için denenebilir. tekniği molekülleri ile sınırlı olan bir çekirdeği ve çözünme olabilir sonra polarizasyon sürdürmek mümkün çekirdeklerin bir grup belirledi. Polarizasyon ya yüksek manyetik alanlarda veya LLS formu iki veya daha fazla birleştiğinde çekirdekler üzerinde delokalize mono-nükleer özdurumların arasındaki dengesizlik olarak devam edilebilir. ilk seçenek için, sonda çekirdeği yüksek olan diğer çekirdeklerin uzak olmak zorunda protonlar dönermıknatıslık oranları. Böyle bir pozisyonu doğal olarak bulunan ise, döteronların aktif çekirdek çevresinde proton molekül veya değiştirilmesi izole bölgelerde NMR aktif çekirdeklerin zenginleştirme, manyetik dipol gücünü düşürmek için gerekli olan . LLS, Supp için en uygun çare bulmak için dışarı 27,28 yapılabilir çekirdeklerin grupları içinde manyetik kaplinler bir teorik analiz elde etmek içinort polarizasyon. 29 amino asit ve ilgi metabolik süreçlerde yer alan diğer moleküllere uygulanabilir örneğin Bu strateji, küçük moleküller başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Daha iyi deney sırasında mıknatıslanma korumak için, LLS uyarılması ile çözünme DNP kombinasyonu, diğer enzimatik reaksiyonlar için ölçüm zaman aralığı genişletmek için vaat ediyor. 20 Burada anlatılan DNP-NMR deneyi kanser hücrelerinde piruvat metabolizma ölçümü için uyarlanmıştır. Çözünme DNP gelişmiş NMR ile enzimatik aktivite gerçek zamanlı ölçüm DNP-enhanced MRG ile kanser teşhisinde mevcut çabalara katkıda bulunabilir 6, zaten kullanılan klinik. 12 DNP-enhanced NMR moleküler özgünlüğü moleküler hedeflerin ve bunların dönüşümleri ürünleri arasında ayrım için tercih edilen bir yöntem haline. Metabolik 30 dönüşümler için gelecek gelişmeler, diğer moleküler izleyiciler değerlendirilmesi üzerinde durulacak </sup&gt; duyarlı MR teşhisi hakkında yanı sıra genişletilmiş gözlem süresi pencereleri elde olmak.

Dinamik nükleer polarizasyon (DNP), 1,2 yani nükleer spin polarizasyon, &#39;yukarı&#39; ve &#39;aşağı&#39; Spin popülasyonları (p = arasındaki dengesizliği geliştirmek için tasarlanmış bir tekniktir [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), ilk 1950 yılında tanıtıldı. Örneğin 13 ° C olarak nükleer spin tipik haliyle 1 K civarında bir ısıda ve biyolojik uygulamalarda bir atılım geldi 3.357 bir manyetik alan T. 3,4, uygun koşullarda, P = 10 -1 kadar polarize edilebilir bir faktör. düşük sıcaklıkta elde edilen yüksek nükleer polarizasyon seviyesini korurken süper ısıtılmış su içinde dondurulmuş polarize örnekleri çözündürülmesinden ibarettir erime DNP gelişimi 2000 erken 5 sıvı hal NMR sinyal geliştirilmiştir 10 3 -10 4 ile karşılaştırıldığında ortakRT NMR koşulları termal olarak polarize. Fesih DNP bu nedenle 1 sn veya daha az bir zamansal çözünürlüğe sahip NMR ile izleme dinamikleri izin gerçek zamanlı olarak yerinde non-invaziv önlem biyokimyasal reaksiyon oranları için bir yol sağlar 6 -. 10 O da çok düşük konsantrasyonlarda analitlerin tespit etmek mümkün olmuştur 11. non-invaziv moleküler görüntüleme yöntemlerinin arasında, hiperpolarize NMR aynı anda bir substrat ve gerçek zamanlı metabolik ürünlerini ölçmek sağlar tek tekniktir. Dağılma DNP metabolizması yerinde izlenmesi ile ilgili klinik MRG 12 ve en umut verici uygulamalara in vitro NMR arasında değişen çeşitli bilimsel alanlarda coşku ile karşılandı. 13,14 çözünme DNP ana sınırlama olduğunu, bu konuda bir süre sonra beş kez uzunlamasına gevşeme zamanı sabiti T 1 sırası, kutup gelişmişleştirilmesi kaybolur. Nispeten uzun bir T 1 sergileyen, nükleer spin taşıyan moleküller kullanımı gereklidir. Polarizasyon geliştirme zamana yayılma uzatmak için, uzun ömürlü devletler (LLS) olarak bilinen nükleer spin durumları, yavaş yavaş-rahatlatıcı, kullanılabilir 15 -. 17 LLS onların böylece, içi çift dipol-dipol etkileşimi duyarsız T LLS karakteristik gevşeme süresidir sabit. T 1 çok daha uzun dakika onlarca bir mıknatıslanma süresi 18 olabilir ve 1 saat kadar, bu nedenle elde edilebilir, 19,20 ve LLS manyetik rezonans spektroskopi hem de önerilmiştir (MRS) ve MR. 21 dikkatle hiperpolarize NMR ile enzimatik reaksiyon oranlarını incelemek için optimize edilmesi gereken başlıca noktalar şunlardır: (i) katı hal polarizasyon maksimize etmek ve (ii) den hyperpolarized çözümün transferi sırasında polarizasyon kaybını en aza indirmekNMR spektrometresi ile polarize. Bu makale enzimatik reaksiyonları incelemek için ısmarlama bir çözünme DNP cihaz ve enjeksiyon sisteminin adaptasyonu anlatır. Özellikleri ve kurulum performansı iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan hyperpolarized substrat [1- 13 C] pirüvat ile gösterilecektir. İkinci, birkaç dakika boyunca izleme reaksiyonları izin verir, ve onun merkezi rolü, bu seçim için başlıca nedenleri, ilk olarak, doğal olarak uzun 13C boyuna relaksasyon zamanı vardır (yüksek manyetik alanlar ve 293 K üzerindeki sıcaklıklarda T 1&gt; 50 sn) çözünme DNP NMR ve geliştirilmiş özel bir enjeksiyon sistemi, laktat dehidrogenaz (LDH) tarafından katalize piruvat oksidasyonunu kullanarak kanser metabolizması. 13,14 etiketsiz laktat 9,22 bir başlangıç ​​havuzu ya da eklenen herhangi bir etiketsiz laktat ile varlığında izlenebilir burada görüldüğü gibi. [1- 13C] laktat sinyal vi ölçülen gösterilmiştirhiperpolarize [1- 13C] piruvat enjeksiyonunun ardından (hücreler de dahil olmak üzere), VO bağlı pirüvat ve laktat arasındaki yerine laktat üretimine hızlı etiket değişimi esas olarak. 6 Biz burada LDH içeren bir NMR tüpü ama başlangıçta hiçbir laktat enjekte hiperpolarize [1- 13 C] piruvat gelen [1- 13 C] laktat gerçek zamanlı üretim sunuyoruz. Sistem açıklaması DNP polarize ve NMR spektrometresi: Bir çözünme DNP kurulumunda iki ana bölümden (Şekil 1) vardır. DNP polarize ana unsuru bir pompalanan helyum banyosunda yaklaşık 1 K numunenin soğutma Kriyostaz olduğunu. Kriyostat bir 3.35 T süper iletken mıknatıs yerleştirilmiş ve mıknatıs (Şekil 1) İzomerkez de polarize örnek olması için garanti bir geometriye sahiptir. kriyostat içinde, örnek, (a) bir polarizasyon B ölçmek için bir NMR bobini (B) ile çevrilidiruildup bir overmoded bir mikrodalga kavite (C) &#39;de ihtiva etmiştir. Bütün numune pompalanır helyum banyosuna (d) &#39;de, düşük sıcaklıkta tutulur ve dalga kılavuzu boyunca mikrodalgalar ile ışınlanır. Tüm sistem ısmarlama yazılımlar (Şekil 2B) tarafından yönetilmektedir. Donanım ve DNP gerçekleştirmek için gerekli kriyojenik ekipman ve sonraki çözünme hala teknolojik meydan okumadır. Yeni bir DNP kriyostat 23,24 geliştirilen ve kriyojenik performanslarını belirlemek için test ve ardından operasyon sırasında hızlı soğuma, helyum tutma zamanı ve genel asgari helyum tüketimi için optimize edilmiştir. kriyostat iki bölümden oluşmaktadır. Kriyostat ilk bölümü kuyruğu ya da örnek alanı (B) ve dış vakum odası (ovc), yüksek vakum ve yuva altında tutuldu: (a) yaklaşık olarak üst kısmında ayrılabilir yalıtım Dewar (Şekil 2A) olduğu radyasyon ekranlar (c). kriyostat ikinci bölümünde ana olduğunuSert (Şekil 2B), tüm içten akma düzenlemeleri yönetilir yalıtım dewar içine yerleştirilir. Transfer hattı (a) &#39;dan harici depolama Dewar gelen sıvı helyum, (b) ayırıcı içinde kondense birinci aşamasında, bir ara bölme kriyostat soğuk üst kısmı tutmak için ve buharlaştırılmıştır helyum çıkarmak için de kullanılmıştır nakil sırasında kullanılabilirler. Ayırıcı basıncı kriyostat üst kısmı etrafında sarılmış bir kılcal (c) ile pompalayarak indirilir; Bu kılcal soğuk helyum akış yalıtım Dewar (OVC) bölmeleri (d) ve radyasyon ekranları soğumasını kullanılır. Numune örnek uzayında yerleştirilir ve polarize edilir. Örnek alanı temel kriyostat ucun kuyruk sarılı bir kılcal (e) &#39;ayırıcı, bağlanır. Bu kılcal elle dışarıdan çalıştırılan bir iğne valf aracılığıyla açılabilir veya kapatılabilir. DNP pr sırasında kullanılan düşük sıcaklık elde etmek içinkapsayabilecektir, sıvı helyum kriyostat örnek uzayında toplanan gerekmektedir ve basınç mbar aralığında indirdi. Kriyostat çalışması için gerekli işlemler pompa, izlenmesi ve elektronik ve elektro-mekanik araçların (Şekil 2C) ile farklı noktalarda işletilen üç setleri ile oldukça karmaşık bir pompalama sistemi ile yapılmaktadır. Kriyostat ovc birinci pompalama sistemi ile yüksek vakum pompalanması gerekmektedir. Bu sistem, bir döner pompa (a) ile desteklenen bir turbo-moleküler pompa oluşmaktadır. sıvı helyum Kriyostat ayırıcı kriyostat transfer hattı girişi boyunca depolama Dewar (b) aktarılır. Ayırıcı ikinci pompalama grubu bağlı bir çıkış bulunur. Bu set, bir 35 m3 / saat membran pompası (c) oluşmaktadır. Bu hat Dewar gelen ve ayırıcı soğutma sırasında transferi sırasında haşlanmış helyum gazı çıkarmadan sağlar. ayırıcı toplanan sıvı helyum daha sonra kap ile örnek uzay aktarılabilirIllary borular, yukarıda tarif edilen. 65 m 3 / saat döner pompa (d) tarafından desteklenen pompa aralığı, 250 m 3 / saat Roots oluşan üçüncü bir pompalama sistemi mbar örnek alan ve daha sonra alt örneklem uzayı basıncına ayırıcıdan gelen sıvı helyum aktarmak için manuel kelebek vana (e) &#39;kriyostat bağlanır. Tüm vakum sistemi operasyonları kontrol ve bir elektro ısmarlama bir cihazın (f) tarafından düzenlenir. Bu cihaz, kriyostat ayırıcı (g) ve örnek alanı (h) çıkışları, ikinci / üçüncü pompa sistemleri (c, d), sıkıştırılmış bir helyum tankları (I) &#39;e ve dış arasındaki vakum hattı bağlantıları kontrol eder. (F) ve dış arasındaki iletişim, tek yönlü bir valf (j) geçer. elektro-pnömatik cihaz (f) yanı sıra tüm sistem parametreleri ve çözünme donanım ortak PC ile ısmarlama elektronik cihaz arayüz USB ile kontrol edilmekte ve işletilmektedir. Elektronik aracılığıyla nihayet bütün sistemi,Cihaz, ilgili işlemleri yazılım düğmelerini kullanarak bir arayüz üzerinden başlatılan ısmarlama bağımsız yazılım (Şekil 2B) tarafından yönetilmektedir. Örnek yönetmek ve ekler bir dizi kullanılır katı hal (Şekil 3A) NMR sinyali birikmesini ölçmek için. polarizasyon Kriyostat hazırlamak için kriyostat içine ana numune insert (a) yerleştirin. Ana Örnek insert bir overmoded altın kaplamalı mikrodalga boşluğunun içine yerleştirilmiş bir NMR bobini (B) temin edilmektedir. Ön dondurma çözeltisi içeren substrat uygun bir örnek kapta sıvı azot sıcaklığında (polarize çözüm) polarize ve fiberglas numune tutucu (c) uç alt kısmına yerleştirin edilecek. mıknatıs İzomerkez ulaşmak için ana numune içine doğru numune tutucu kaydırın. Numune tutucu altın kaplama dalga kılavuzu (d) takın. dalga kılavuzu harici mikrodalga kaynağından üretilen mikrodalga asgari kayıpları t yolculuk yapmasına olanak veriyorörnek o. Kriyostat yönetimi için ısmarlama yazılım, farklı işlemler bekleme süresi gibi, (kriyostat sıcaklığı sıvı helyum sıcaklığına yakın indirilir) kriyostat önceden belirlenmiş bir düzeye sıvı helyum ile doldurulur (dolum tekabül eden arayüz butonuna tıklayarak üzerine, otomatik olarak kolları ), (sıvı helyum banyosu mümkün olan en düşük sıcaklık elde etmek için pompalanır) T ≈ 1 K basınçlandırma soğutma ek bir adım (kriyostat 10-30 mbar riskleri olmaksızın kriyostat açılmasına izin verecek = P oda basıncının biraz üzerinde basınç uygulanır hava ile kriyostat kontaminasyon) ve çözünme (DNP örnek çözülür ve ölçüm sitesi, yani NMR spektrometre) elde edilen hyperpolarized çözüm aktarmak için otomatik prosedür. Polarizasyon polarize alan B 0 (94 GHz mikrodalga ile örnek ışınlanması yapılır </sub&gt; = 3.35 T). Bir örnek tamamen T DNP polarizasyon birikimi zamanıdır. T DNP belirli bir alanda ve sıcaklığında katı halde hedef çekirdeklerin boyuna relaksasyon zamanı aynı büyüklük düzenin 3 T DNP, sonra polarize sayılır. Tüm deneylerde numune fazla 5 T DNP için polarize edilmiştir. polarizasyon süresi sonunda, örnek enzimatik aktivite ölçümü için kullanılmak üzere bir RT çözeltisi içinde çözülmüş olması gerekir. Çözünme işlemi sırasında, çözünme insert (Şekil 3B) kazandan kızgın D 2 O 5 ml DNP geliştirilmiş örnek ulaşmak ve bunu eritmek için sıkıştırılmış helyum gazı (p = 6-8 bar) tarafından itilir. Elde edilen hyperpolarized çözüm çözünme eklemek çıkış ağzından, sıkıştırılmış helyum gazı ile çözünme ekleme dışarı itilir (Şekil 3C-b </strong&gt;), 2 mm iç çapı teflon transferi tüp. Çözünme süreci için gereken zaman. NMR spektrometre sitesine DNP polarize örnek transferi için gereken zaman 23 300 msn yaklaşık 3 sn. Çözünme süreci erime elemanını (Şekil 3B) kullanılarak gerçekleştirilir. çözünme insert bir elektronik-pnömatik montaj oluşur: (a), numune ile sızdırmaz bağlantıyı sağlayan pnömatik montaj kazan ve numune kabı soyunma (c) arasındaki bağlantı tüpleri içeren bir karbon fiber çubuk (b) konteyner ve geri prize dışarı. Elektro-pnömatik düzeneği (Şekil 3C) üretimi ve örnek kabına karbon fiber çubuk boyunca ısıtılmış D 2 O sürücü ve kriyostat gelen hiperpolarize çözeltinin özümlenmesi için kullanılır. elektro-pnömatik montaj co arasındaki bağlantıları kontrol pnömatik valfler (a) oluşmaktadırmpressed helyum (p = 6-8 bar) hattı (B), karbon fiber çubuk yoluyla D 2 O vana (d) &#39;enjekte edilir ısıtıcısı (c) ve çıkış (e) (f)&#39;. Sistem bir basınç G, bir termometre ve ısıtıcısı (c) &#39;de bir ısıtma direnç teli, bir tetikleyici (h) ve bir bağlantı kutusu (I)&#39; in elektronik yönetim cihazı ile, sistem arayüzü için kullanılan ile tamamlanmaktadır. DNP kriyostat ve NMR spektrometresi, bir transfer hattı, yani erime tetiklenir hiperpolarize çözelti, baskı altına alınan helyum ile itilir içindeki 2 mm, iç çapı (p = 6-8 bar) bir PTFE tüp ile bağlanmıştır. Çözünme sekansı aşağıdaki işlemlerden oluşmaktadır: ilk 300 msn&#39;de, süper ısıtılmış D 2 O hiperpolarize dondurulmuş çözelti eritilmesi ve eritmek için numune kabına doğru itilir. Daha sonra, hyperpolarized çözüm pres ortalamasından ile kriyostat elde edilirsurized (p = 6-8 bar) enjeksiyonu Aşama anlatılan prosedürlerin biri ile yapılır ölçüm sitesine helyum gazı ve 2 mm iç çap PTFE borusu içinden itilir (Şekil 3C-E) 6.2.1 veya 6.2 Adım 0,2. çözünme DNP NMR kurulum ikinci bileşeni NMR spektrometre olduğunu. Burada tarif edilen kurulumunda, NMR spektrometresi alan B 0 = 11.7 Tesla çalışır. 5 mm&#39;lik NMR prob çözünmesinden sonra hiperpolarize sinyalini ölçmek için kullanılır. NMR spektrometre solid-state ve sıvı-devlet hem de NMR ölçümleri için kullanılan, NMR konsolu aracılığıyla işletilen ve firma tarafından sağlanan yazılım XWINNMR edilmektedir. Tipik bir ölçüm düşük çevirme açısı sert darbe oluşan sinyal satın almalar takip (ya liquidstate veya un kalibre solid-state ölçümleri için, için, kalibre). katı hal termal polarizasyon sinyali ve DNP türevi si ölçümlerignal birikmesi NMR spektrometresi bağlanmış DNP polarize (Şekil 3Ab) yerinde ölçüye 13C bobini kullanılarak gerçekleştirilir. Bu özel durumda NMR spektrometre sinyal kilitleme yapmaz. Solid-state ölçümleri yapılırken, polarizasyon önemli tedirginlikler önlemek için, satın almalar arasındaki zaman gecikmesi kabaca uzun 0.5 T DNP daha uzun yeterli olmalıdır. solid-state geliştirme olarak tanımlanmaktadır <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation4.jpg" width="100" /> nerede <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> hyperpolarized sinyali (Aşama 3.3&#39;de elde edilmiş) ve <img alt="Equation6" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation6.jpg" width="23" /> (Kademe 3.2 pompalanan sıvı helyum sıcaklıkta, dengede elde edilmiş), katı durum sinyali (Şekil 4A) &#39;dir. Bu parametre dhyperpolarized çözümün transferi sırasında kaçınılmaz kayıplar öncesinde NMR deneyleri için kullanılabilir maksimum kutuplaşmayı, efines. Ölçüm un kalibre düşük çevirme açısı darbe kullanarak basit bir darbe acquire dizisi ile yapılır. Darbe kalibrasyonu yaygın katı hal ölçümler için atlanır. Benzer bir usul, sıvı halde hiperpolarize sinyal artışı belirlemek için kullanılabilir. Bu durumda, enjeksiyondan önce spektrometresi tüpüne yerleştirilmiştir örneği (Aşama 6.2), D 2 O 500 ul oluşmaktadır çözünme ve enjeksiyondan sonra izlemek için iki önemli parametre vardır. İlk, NMR spektrometresi yerinde hyperpolarized geliştirmesidir <img alt="Equation7" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation7.jpg" width="95" /> (Şekil 4B), <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> Sinyal sadece hiper enjeksiyonundan sonra ise<html> (Adım 7.1 elde edilen) polarize çözüm ve <img alt="Equation9" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation9.jpg" width="20" /> Termal polarizasyon sinyali (Adım 7.2 elde edilen) &#39;dir. İkinci alt-tabaka ve (Kademe 7.1 &#39;de elde edilen üstel bağlantı sinyalleri ile elde edilir), her metabolik bir ürünü ile bağlantılı boyuna gevşeme süresi, T 1 (Şekil 4B, ek) vardır. Bu iki parametre, yeterli bir sinyal-gürültü oranı (SNR), ve metabolik dönüşümler ölçülmesi için uygun bir zaman penceresini elde etmek için gerekli en az alt-tabaka konsantrasyonu tanımlamaktadır. solid-state kutuplaşma arasındaki oran <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> ve liquidstate kutuplaşma <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> hyperpolarized çözüm transferi sırasında nedeniyle gevşeme polarizasyon zararların tahminini verir. Bir değeration12 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt; gevşeme kayıpları yokluğunda dikkat edilmelidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNP polarizer</td>
			<td style="width:287px;">Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)</td>
			<td style="width:119px;">///</td>
			<td style="width:167px;">Cryostat and electronic equipment for sample polarization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum system components</td>
			<td style="width:287px;">Edwards vacuum (France)</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>
			- turbomolecular pumping setup
			- membrane pumping setup
			- high capacity roots pumping system
			- vacuum fittings and components
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNP 3.35T Magnet</td>
			<td style="width:287px;">Bruker (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">500MHz NMR Spectrometer</td>
			<td style="width:287px;">Bruker (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Origin 8.0</td>
			<td style="width:287px;">OriginLab (US)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">490709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">186414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;4-Hydroxy-TEMPO 97%</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">176141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">phosphate buffer, pH&#160;=&#160;7.0</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LDH enzyme in&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;">L-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin, BSA</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissolution dynamic nuclear polarization instrumentation for real-time enzymatic reaction rate measurements by nmr

NMR tabanlı araştırmaların ana sınırlama düşük hassasiyettir. Bu nedenle metabolik dönüşümlerin gerçek zamanlı NMR ölçümleri önlenmesi, uzun satın alma süreleri için ister. çözünme DNP aracılığıyla hiperpolarizasyon duyarlılığı parçası elektron-to-çekirdeğe dönüş polarizasyon transferi kaynaklanan büyük out-of-denge nükleer manyetizasyon sayesinde sorunları circumvents. elde edilen yüksek NMR sinyali, gerçek zamanlı olarak kimyasal reaksiyonların izlenmesi için de kullanılabilir. Hiperpolarize NMR olumsuz ilişkili gevşeme zamanı sabiti sipariş üzerine olumlu durumlarda, nükleer spin uzunlamasına gevşeme zamanı sabiti, T 1, ya da sipariş üzerine genellikle sinyal alımı için mevcut olan sınırlı zaman penceresi içinde bulunduğu birleştiğinde çekirdeklerin tekli-devlet, T LLS. endojen moleküller ve metabolik oranları hücresel alımı tümör gelişiminde ve ilaç cevabına gerekli bilgi sağlayabilir. Nuyanında bir çok önceki hiperpolarize NMR çalışmaları, in vivo enzimatik aktivitesini izlemek için bir metabolik alt-tabaka olarak piruvat alaka göstermiştir. Bu çalışma, özellikle hyperpolarized NMR laktat dehidrogenaz (LDH) varlığında piruvat-to-laktat dönüşüm oranı, enzimatik reaksiyonların çalışması için gerekli olan deney düzeneği ve yöntemleri ayrıntılı bir açıklama sağlar.

çözünme DNP kullanarak NMR sinyali kazançlar DNP etkisi numunenin mikrodalga ışıması altında, genellikle istikrarlı radikal moleküller, NMR aktif çekirdeklere eşleşmemiş elektron spin yüksek kutuplaşma transferi oluşur. En sık kullanılan serbest radikallerin TAM (OXO63) ve TEMPOL vardır. 4 Polarizasyon prosedürleri TEMPOL kullanarak &#39;çapraz polarizasyon&#39; ile optimize edilebilir. 25 katı halde yüksek nükleer polarizasyon elde edilmesi için kararlı bir radikal konsantrasyonunun en iyi duruma getirme tekniğinin başarısı için çok önemlidir. Optimal TEMPOL konsantrasyonu bu çalışma deneysel koşullarda 33 mm olduğu tespit edilmiştir. Seçilen alt-tabakanın bu kutuplaşma, gerçek zamanlı olarak enzimatik dönüşümü takip yeterlidir. Polari manyetik alanızer Paris Descartes kurulu B 0 = 3.35 T ve bu sistemin bileşenleri (Şekil 1-3) Yukarıdaki tarif edildi. Kriyostat tasarımı son örnek pozisyon mıknatıs İzomerkez denk gelmesi garanti eder. polarize manyetik alanı rampalı ve yerinde Kriyostat ile, sadece süperiletken şim bobinleri kullanılarak shimmed. 1 x 0.5 x 0.5 cm su numunesinin son proton çizgisi genişliği 23 KHz oldu. Biz değerlendirildi <img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> ve <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> [1 13C] piruvat için. Bunu yapmak için, 13C DNP gelişmiş sinyal belirlemek için ilk gereklidir <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> Çözünme (Şekil 4A) önce, polarize yerinde katı halde. dağılmasından sonra, biz [1- ölçülen13 C] pirüvat hyperpolarized sinyal <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> ve spektrometre yerinde bozunum. Sıvı haldeki sinyali NMR spektrometresi içinde örnek olarak D 2 O 500 ul kullanarak bir test çözünme ölçülmüştür. Bu bize solid-state DNP geliştirme (Şekil 4B, içerlek), sıvı-devlet NMR polarizasyon seviyesi (Şekil 4B) ve aktarım sırasında polarizasyon kayıplarını belirlemek için izin verdi. sinyaller arasındaki oran, Adım 3.3 ölçülen ve 3.2 katı-hal geliştirme tanımlamak Adım <img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> . Adım 7.1 olarak ölçülen ilk sinyal ve Adım 7.2 gelen sinyal arasındaki oran, sıvı-devlet hyperpolarized geliştirme tanımlar <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> . Aşama 3 veriler, sŞekil 4A ve Şekil 4A (ilave) olarak ummarized, teknik [1- 13 C] pirüvat kadar 13 C polarize izin verdiğini gösteriyor <img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> Bir 13C polarizasyon tekabül eden ± 5 = 22, <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> = 1.5 ± 0.3%. Bu kutuplaşma düzeyi ortak MRS koşulları (örn 11.74 T ve 300 K) birden fazla bin kat karbon termal kutuplaşma olduğunu. Şekil 4B ve Şekil 4B (ek) özetlenmiştir Adım 7 veriler, [1- 13 C] piruvat sıvı devlet 13 C hiperpolarizasyona belirlenmesi izin <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> = 1 ± 0.2%. piruvat katı halde elde geliştirdiğiniyüksek geliştirmeleri farklı radikalleri kullanılarak gösterilmiştir olsa, deney amacıyla yeterli. 5 ders veri Adım 7.1 den uygun zaman gevşeme zamanı sabiti bir ölçü verir. Karışımda piruvat boyuna gevşeme süresi 500 ul DNP geliştirilmiş çözeltisi ve 500 ul D 2 O oluşan T 1 olduğu = 75 ± 5 saniye sonra RF düzeltmesi (denklem bakınız (3)). Enzim aktivitesi ve metabolik ölçümler 13C işaretli substrat (A) Erime DNP NMR algılama ürünün (B), gerçek zamanlı enzimatik dönüşüm dinamikleri takip gözlemlemek için kullanılabilir: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation1.jpg" /> Hemen hiperpolarize alt-tabaka (A) enjeksiyonundan sonra,Ürün (B) sinyal null. Daha sonra, enzimatik dönüşümü (1) (b) üretmeye başlar. 13C çekirdeklerin mıknatıslanma farklı kimyasal kaymalar ve moleküllerin kimyasal değişim etkilenmez. Bununla birlikte, yeni bir ortam ürün sinyali zaman süreci niteliksel üç adımda ayrılabilir B. 13 ° C için farklı boylamsal gevşeme oranlarına yol açabilir: Başlangıçta, B içine A B sinyalinde bir artış üreten transforme enzimatik dönüşümü; Belirli bir süre sonra, deneysel koşullara bağlı nedeniyle gevşeme mıknatıslanma kayıpları, bu artış ve B sinyali dengelemek maksimum ulaşır; Nihayet, uzun zamanlarda, B sinyal uzunlamasına gevşeme nedeniyle azalır. Enzim doyma hipotezi, dönüşüm geri ihmal ve hesap manyetik gevşeme alınarak, enzimatik dönüşümü sırasında iki molekül türleri (A ve B) mıknatıslanma cou ile tanımlanabilirPLED diferansiyel denklem sistemi: 22 <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation2.jpg" /> M (A, B) (±) moleküler tür, A ve B mıknatıslanmasından olduğu sırasıyla k eff sinyali enzimatik reaksiyon ile aktarımı ve R için etkili bir dönüşüm oranı sabiti (A, B) belirgin uzunlamasına gevşeme oranı sabitleri sırasıyla moleküler türler A ve B, gözlemlenen çekirdeklerin R saf boyuna mıknatıslanma rahatlama ve rf palslama etkisi hem (A, B) hesabına.: <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation3.jpg" /> t, 1 (A, B), uzunlamasına gevşeme buradaZaman sırasıyla moleküler türler A ve B yerel moleküler ortamda çekirdeğin, sürekli. θ ve τ sırasıyla rf çevirme açısı ve iki sinyal satın almalar arasındaki gecikme vardır. Bu çalışmada, alt-tabaka A ve ürün B ve [1- 13C] piruvat ve [1 13 C] laktat, sırasıyla, amaç izotopik olarak burada herhangi bir (koşullar altında LDH laktat üretimi [1- 13 ° C] ölçmektir etiketlenmemiş) laktat deneyin başlangıcında çözeltisi mevcuttu. Ölçüm, T = 21 ° C de, basit bir pulseacquire dizisi ile kaydedilen 13C spektrumları bir dizi içerir. Bir kalibre edilmiş 10 ° dönüş açısı darbe sıralı zorlamalara (Aşama 9) için kullanılmıştır. Birbirini takip eden iki darbe arasındaki bir gecikme τ = 1.5 saniyeydi. NMR edinme dizisi hyperpolarized SOLUT önce saniye birkaç on başladıiyon enjeksiyon. enjeksiyondan sonra tüpte piruvat substrat konsantrasyonu 25-35 mm&#39;dir. Aşama 10 10 -3 U / ml&#39;lik bir LDH konsantrasyonunda piruvat dönüşüm hızı laktat ölçülmüştür. Laktat ve pirüvat kaydedilen sinyal = 0.9 ± 0.1 x 10 -3 sn-1 (Şekil 5) de (2) (Şekil 5 de noktalı çizgi) Denklem uygun ve k eff verir. Bu değer oranı [Lac] / [Pir] zaman 0 sn (Şekil 5, içerlek) tarafından belirlenen ilk tepki oranı ile kabul eder. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig1.jpg" /> Deney düzeneğinin 1. Şemalar Şekil. polarize (sol) içine yerleştirilmiş bir kriyostat (d) içinde yer alan, bir mikrodalga kavite (C) oluşur 3.35 t süper-iletken mıknatıs geniş çaplı. t çevreleyen bir ölçüye NMR bobin (b)o (a) in situ nükleer spin polarizasyon izlenmesi için kullanılır örnek. Örnek Mikrodalga frekansı ν MW = 94 GHz ışımaya helyum banyo sıcaklığı 1.12 ± 0.03 K muhafaza edilmektedir. NMR ölçümü polarizasyon esnasında katı hal numune üzerinde gerçekleştirilmesi için sistem sağlar. Polarize örnek kızgın su içinde çözülmüş ve daha önce bitişik NMR spektrometresi (sağda) içine yerleştirilen numune tüpüne transfer hattı aracılığıyla sıkıştırılmış helyum gazı ile itilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig2.jpg" /> Şekil 2. Kriyostat ve vakum sistemi şemaları. (A) kriyostat yalıtım termos; (B) ağlamak<html> Ana insert ostat; (C) vakum sistemi bağlantıları; (D) Adım 2 ve protokol bölümünün 5. adımda açıklanan belirli işlemleri gerçekleştirmek için kullanılan düğmeleri ile yönetim yazılımı arayüzü ekran görüntüsü. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53548/53548fig3.jpg" /> Şekil 3. Örnek kullanım ve çözünme. (A) numune alma ekler; (B) çözünme eki; (C) çözünme ekin elektro-pnömatik bağlantı detay. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &quot;&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53548/53548fig4.jpg" /> Şekil 4. Katı hal polarizasyon birikimi ve hyperpolarized sinyal çürüme. Çözünme DNP sinyaller. (A) DNP kutuplaşma sırasında 1.12 M sodyum [1- 13 C] pirüvat çözeltisinin katı hal NMR polarizasyon birikmesi sinyali (haç, bir üstel fonksiyon S (t) ile donatılmış / T x exp (-t = b) + zaman sabiti T b = 270 sn) ve gevşeme (çevreler, S (t) B) · exp (t / T b) + B, T ss 1 = 840 sn =; (A, ek) katı halde DNPenhanced ve termal polarize (büyütülüyor 10 kez) mıknatıslanma sinyalleri arasındaki karşılaştırma (ε ss = katı hal polarizasyon P SS = 1.5 ± 0.3% tekabül 22 ± 5); (B) dağılmasından ve Avera sonra kaydedilen ilk spektrumu arasındaki karşılaştırmatermal polarize 13 ° C elde edilen ged spektrumu (100 kez büyütülüyor) 1.024 ansılların kullanılarak oda sıcaklığında spin (ε = 1,000 ± 200). çözünme süreci% 40 tahmini sinyal kaybı ile 3.3 sn ve otomatik enjeksiyon yaklaşık 2 saniye sürdü. Deneyler manuel enjeksiyon yoluyla numune transferi gerçekleştirilen için uzaması nedeniyle enjeksiyon gecikme ek kayıplar% 30 olarak tahmin edilmiştir; (B, ek) LDH yokluğunda (T 1 = 75 ± 5 sn) içinde çözüldükten sonra piruvat hyperpolarized sinyal çürümesi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53548/53548fig5.jpg" /> Nedeniyle enzyma için [1 13 C] laktat sinyalin Şekil 5. LDH aktivitesi ve kanser hücrelerinin metabolizma sonuçları. Build-up10 -3 U / bir LDH konsantrasyonunda tik dönüşüm nedeniyle 13 C manyetizasyon uzunlamasına rahatlama sinyal çürüme tarafından takip ML. kırmızı çizgi gevşeme ve enzimatik dönüşümü etkilerini içeren denklem (2) &#39;de tarif edilen bir model ile uygun gösterir. [1 13 C] laktat ve süresi t = 0 (kırmızı çizgi) reaksiyon hızı bir ekstrapolasyonu [1 -13 C] pirüvat konsantrasyonu arasında (Ankastre) oranı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR at JoVE.com

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Chemical Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

10.6K Görüntüleme.  Université Paris Descartes. The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Video: Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

Channels for the transportation of water molecules in enzymes influence active site solvation and catalysis. Herein we present a protocol for the engineering of these additional catalytic motifs based on in silico computer modeling and experiments. This will enhance our understanding of the influence of solvent dynamics on enzyme catalysis.

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Kimya

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

Puan Bağımlı Elipsometri Ölçümleri Soğutma İnce Camsı Filmlerin dinamikleri belirleme

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Kapiler Elektroforez Real Time Kitosan Films üzerine Peptit Aşılama Monitör

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

Dinamik ışık saçılımı Mikroskopi Bulanık Çözümleri Tane Büyüklüğü Dağılımının Ölçümü

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

İkincil Nanoelectrospray iyonlaşma kullanarak gerçek zamanlı nefes analiz için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

U2O5 Film Preparation via UO2 Deposition by Direct Current Sputtering and Successive Oxidation and Reduction with Atomic Oxygen and Atomic Hydrogen

We describe a method to produce U2O5 films in situ using the Labstation, a modular machine developed at JRC Karlsruhe. The Labstation, an essential part of the Properties of Actinides under Extreme Conditions laboratory (PAMEC), allows the preparation of films and studies of sample surfaces using surface analytical techniques such as X-ray and ultra-violet photoemission spectroscopy (XPS and UPS, respectively). All studies are made in situ, and the films, transferred under ultra-high vacuum from their preparation to an analyses chamber, are never in contact with the atmosphere. Initially, a film of UO2 is prepared by direct current (DC) sputter deposition on a gold (Au) foil then oxidized by atomic oxygen to produce a UO3 film. This latter is then reduced with atomic hydrogen to U2O5. Analyses are performed after each step involving oxidation and reduction, using high-resolution photoelectron spectroscopy to examine the oxidation state of uranium. Indeed, the oxidation and reduction times and corresponding temperature of the substrate during this process have severe effects on the resulting oxidation state of the uranium. Stopping the reduction of UO3 to U2O5 with single U(V) is quite challenging; first, uranium-oxygen systems exist in numerous intermediate phases. Second, differentiation of the oxidation states of uranium is mainly based on satellite peaks, whose intensity peaks are weak. Also, experimenters should be aware that X-ray spectroscopy (XPS) is a technique with an atomic sensitivity of 1% to 5%. Thus, it is important to obtain a complete picture of the uranium oxidation state with the entire spectra obtained on U4f, O1s, and the valence band (VB). Programs used in the Labstation include a linear transfer program developed by an outside company (see Table of Materials) as well as data acquisition and sputter source programs, both developed in-house.

U2O5 Film Preparation via UO2 Deposition by Direct Current Sputtering and Successive Oxidation and Reduction with Atomic Oxygen and Atomic Hydrogen

This protocol presents the preparation of U2O5 thin films obtained in situ under ultra-high vacuum. The process involves oxidation and reduction of UO2 films with atomic oxygen and atomic hydrogen, respectively.

U2O5 Film Hazırlık UO2 ifade doğru akım fışkırtması ve art arda gelen oksidasyon ve Redüksiyon atomik oksijen ve Atomik hidrojen ile üzerinden

We describe a method to produce U2O5 films in situ using the Labstation, a modular machine developed at JRC Karlsruhe. The Labstation, an essential part ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Otomatik sentez ve gerçek zamanlı kinetik değerlendirmesinin teknik yönü [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition parameters such as gas flow rate that results in changes on composition and thus in the film required properties. In this report, reactive sputtering is used to deposit niobium oxide films. A niobium target is used as metal source and different oxygen flow rates to deposit niobium oxide films. The oxygen flow rate was changed from 3 to 10 sccm. The films deposited under low oxygen flow rates show higher electrical conductivity and provide better perovskite solar cells when used as electron transport layer.

Here, we present a protocol for niobium oxide films deposition by reactive sputtering with different oxygen flow rates for use as an electron transport layer in perovskite solar cells.

Reaktif Püskürtme Ile Yatırılan Niyöyum Oksit Filmler: Oksijen Akış Hızının Etkisi

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...