著者は、有益な議論のための機器の選択と組み立てアシストするために博士のJJのファン・デル・クリンク、ならびに博士F.カテブ博士G. Berthoに感謝します。 ACは、スイス国立科学財団（PPOOP2_157547を付与する）によってサポートされていました。私たちは、パリソルボンヌシテ（NMR @コム、DIM解析、ヴィル・ド・パリ、財団デラRECHERCHEMédicale（FRM ING20130526708）、およびParteneriatヒューバートCurienブランクーシ32662QKから融資を認めている。私たちのチームはEquipexプログラムパリ・アン・共振の一部でありますそして、CACSICE。

注：すべてのデータ分析は、市販のソフトウェアを用いて行きました。 1.偏光液を調製<ol><li> 1.12 M 13 C標識ピルビン酸ナトリウム（のNa + [CH 3 -CO- 13 COO] - 、基板）の2ミリリットル準備ラジカルTEMPOLの33 mMの（でドープされた解決策4 -ヒドロキシ- 2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、偏エージェント）4 2：1、D 2 O / D 13 C観測のための6 -エタノール。注意：使用上の注意点によるD 6 -エタノールの引火性の性質のために注意する必要があります。 </li><li>ラジカル濃度が達成分極の面で最適であることを確認します。 <ol><li> （30 mm以上35 mmで、 例えば ）少しポイント1.1での溶液のラジカル濃度を変更します。 </li><li>反復固体増強を決定する（ステップ3を参照）、最大向上につながるラジカル濃度を見つけます。 </li></ol></li></ol> 2. Polarizatイオン<ol><li>クールダウンの手順で、DNPのクライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「クールダウン」ボタンをクリックします。 </li><li>充填手順を通じてDNPのクライオスタット内の液体ヘリウムを収集します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「充填」ボタンをクリックします。 </li><li> DNPの偏光板が設けられた試料容器中のステップ1.1から最適化された偏光の溶液300μLを置きます。穏やかに液体窒素浴中に浸漬することによって内部に試料と試料容器を凍結。 </li><li>液体窒素浴から試料容器を抽出し、逆さまに回転させることによって凍結手順（ステップ2.3）後の試料容器中に存在し得る液体窒素を排除します。 注：この手順は（ステップ5を参照）、サンプルの完全な溶解を得ることが重要です。 </li><li>クライオスタット内に試料を挿入します。 注：このセントEPは、以下のサブステップから成る、（ すなわち 、未満10から20秒で）融解からサ ​​ンプルを防ぐために迅速に実行する必要があります。 <ol><li>サンプルホルダーに試料容器を挿入します。主クライオスタットインサートに試料ホルダーを挿入します。サンプルホルダーにマイクロ波の導波管を挿入します。 </li></ol></li><li> 1 K冷却手順を開始することにより、クライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「1K冷却」ボタンをクリックします。 </li><li>上のマイクロ波源をオンにして、サンプルを照射します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「MW-ON」ボタンをクリックします。 </li></ol> 3.固体NMR測定<ol><li> 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、分光器コイルからNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。クライオスタットの同軸コネクタに検出チャンネルの同軸ケーブルを差し込みNMRコイル。オリエンテーションピンに着目し、クライオスタットのNMRコイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。 </li><li> T = 5分の間隔で繰り返さ未校正し、低フリップ角パルスでシンプルなパルス取得シーケンスを使用して、クライオスタットサイトで固体状態でNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li><li> DNP-強化されたNMR信号を測定します。第2節で説明したように、DNPプロセスを開始した後、ステップ3.2の動作を繰り返します。 </li><li> 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、クライオスタットのNMRコイルからのNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。 DETEの同軸ケーブルを差し込み分光器コイルの同軸コネクタにctionチャンネル。オリエンテーションピンに着目し、分光器コイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。 </li></ol> 4.メインマグネットフィールド（ &#39;シミング&#39;）の均一性を最適化<ol><li>分析計内で前の実験（ すなわち 、ステップ6.2の後）で製造された混合物の500μLを含むチューブを置きます。 </li><li>最大値を探索するシミング勾配コイルの電流を変化させることにより、NMR分光計のシミングを行う重水素の信号を「ロックします」。 NMRコンソールに対応するボタンを押すことにより、関連するシミングコイルを選択します。 <ol><li>ロック信号を増加させ、回転方向を決定するためにNMRコンソール上のノブを回します。信号が最大に達するまで回転し続けます。別のシミングコイルを選択し、最大化解除を繰り返しますすべてのシムコイル用の極大ゴマ発見されました。詳細については、NMR分光計の取扱説明書を参照してください。最後には、ロックに用いたサンプルを削除します。 </li></ol></li></ol> 5.解散<ol><li>溶解挿入ボイラーでD 2 Oの5ミリリットルを挿入します。加圧するとT≈180〜200゜Cに達するまで抵抗ワイヤによってD 2 Oを加熱します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「ヒーターの準備」ボタンをクリックします。 </li><li>サンプル偏光手順の完了後（ 例えば 、3 T DNP後）は、室内圧力よりわずかにクライオスタットを加圧します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「SSオペレーション」ボタンをクリックします。溶解インサートからのマイクロ波ガイドを削除します。 </li><li>サンプルホルダーにダウン溶解インサート（ 図3B）をスライドさせ（ 図3A-C）。溶解インサートは、サンプルホルダーの底に達する必要があり、クライオスタットでD 2 O漏れを回避するために、試料容器との漏れ止め接続を行うためにしっかりと押さなければなりません。 </li><li>溶解シーケンス、空気弁の操作の予め定めタイミングシーケンスを開始するために、ハードウェア・トリガ（ 図3C-h）を押してください。 </li></ol> 6.インジェクション<ol><li>解散場所の前に5ミリメートルのNMRチューブ、500μlのサンプルを含む（ 例えば 、D 2 Oのために<img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> 11.74 T NMR分光計のアイソセンタのステップ9での酵素活性の測定のためのステップ8からステップ7またはLDH溶液中で測定）、（ステップ4を参照）。 </li><li>ただ、解散（ステップ5）した後、ステップ6.1にNMR分光器に置かれた試料に過分極溶液500μlを混合します。 <ol><li>マニュアルインジェクション：過分極を収集NMR分光器の磁石の近くに配置されたガラスビーカー中で2.5メートルの長い移送管の終わりにソリューションを提供します。手動でカスタムメイドのキャピラリシステムを介してNMR試料管に過分極溶液500μlを注入。 </li><li>自動注入：溶解工程の前に、転送に使用されるヘリウムガスから過分極ソリューションを分離する自動化されたカスタムメイドの噴射装置へ移送管を接続します。デバイスは自動的にサンプル管に過分極溶液500μlを実現します。 </li></ol></li></ol> 7.液体状態NMR測定<ol><li>溶解後、基板（A）の磁化の進行及び製品（B）に追従するために1.5秒だけ離れた10°のフリップ角パルス取得一連のシーケンスにより分光器のサンプルからのNMR、超偏極信号を測定。測定を設定した後、ソフトウェアのコマンドラインで「ZG」を書いて、キーを押します＆＃39; &#39;キーボードのキーを入力してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li><li>磁化が完全に緩和すると（ すなわち 、T = 10、T 1の後）、90°のフリップ角パルス-取得T = 3 T 1≈3分だけ離れた配列を一連のNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li></ol> （ピルビン酸から乳酸の変換のための具体的な）酵素含有試料の8準備<ol><li>以下のレシピとの反応緩衝液を調製：50mMの0.1 Mリン酸緩衝液中でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、1mMのエチレン - ジアミン四酢酸（EDTA）、0.1mMのジチオスレイトール（DTT）を低減し、pH値=7.0。 </li><li>ウサギ筋肉LDH溶液を20μg/ mlのウシ血清アルブミン、BSAとの反応緩衝液中で新たに調製した1 U / mlで調製します。 </li><li> 20μlのD 2 Oは、分光器の磁場安定化（ &#39;ロック&#39;）を可能にし、2μlのLDH溶液（ステップ7.2）するために、478μlの反応バッファー（ステップ8.1）を混ぜます。 </li><li> 5ミリメートルのNMRチューブにステップ8.3で調製した500μlの溶液量を置き、500 MHzのNMR分光計にチューブを置きます。 </li></ol> 9.完全な酵素反応速度測定手順<ol><li>偏光の試料（ステップ1）を準備し、（ステップ2）それを偏光。 </li><li>分光計（ステップ4）にシミング実行し、酵素サンプル（ステップ8）を準備します。 </li><li>溶解（ステップ5）、注射（ステップ6）を実行します。 </li><li> 1.5秒（ステップ7）離れた10°のフリップ角パルス買収に過分極サンプルからの一連の信号を測定します。このステップでは、過分極を測定することができます信号減衰および代謝産物の信号の蓄積。 </li></ol> 10.フィッティング<ol><li>ステップ9.4において取得された各スペクトルについて、それぞれ（A）及び生成物（B）が、基板と、それらを統合するために対応するピークを同定する（ピークの面積を決定します）。ピークの積分は、磁化の経時変化を信号（M（A、B）（t）は、式2を参照）を得ました。 </li><li>方程式の解を使用すると、（2）、F =（R A + K EFFの値を決定します ）ステップ10.1に統合された基板の信号の単純な指数関数フィットから。 </li><li>値F =（R の A + K effはを使用して、 ）ステップ10.2において判定式を積分した機能を持つ製品信号Mの B（t）の適合からのk effは及びR Bを決定する（2）。代表的な結果セクション（Enzymatを参照してください。反応モデリング、フィッティングおよびRF補正の詳細については、ICの活動と代謝の測定値）。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言

溶解DNP NMR実験の重要なポイントがある：（i）実験のために必要な最低の生成物濃度と同様に行わ及び（ii）可能な信号取得回数を決定した基板、のために達成分極レベル寿命偏光と検出サイト間および基板変換率への転送の持続時間に比べて、磁化。本明細書中に記載の溶解DNPセットアップの噴射システムは、わずか3-4として秒のサンプル転送を可能にします。転送はS.ボーエンとC.ヒルティによって提案された方法におけるほど急速ではなかったが、ピルビン酸のための26の偏光損失が低い分野での適度な縦緩和に制限されていました。 [1- 13 C]ピルビン酸、その長いカルボン核T 1で、10 -3 U / mlという低い濃度でLDHを通してフラックスを測定することができます。 ザ<html>高い信号対雑音比は、溶解DNPつより低い[1- 13 C]ピルビン酸濃度に感受性であり得ることを示唆し、そしてより低い酵素変換率を用いて得られました。達成分極レベルは有意な信号対雑音比の200以上の実験は、低フリップ角α= 10°を使用した液体状態のNMR分光計で取得することが得られます。これは、最適化のため、両方の繰り返し回数とフリップ角の点で部屋を出ます。いくつかの分子は、いくつかの偏光エージェント（TEMPO、OXO63）4と他の人とよく分極固体の分極のビルドアップのために、まだ完全には理解されていない理由のために、しないでください。実験的試験は、分極工程が成功したかどうかを判断する唯一の方法です。分極レベルを向上させるためには、異なるラジカル種4と「交差偏光」に依存する異なった技術の適用の使用を探索することができます。25 ontent &quot;&gt;ラジカルと基板濃度だけでなく、DNP試料中の溶媒組成のさらなる最適化は、偏光を改善しようとしたことができます。技術は、分子に限定されるもので核または溶解がすることができた後、偏光を維持することができ、核のグループ識別された。偏光のいずれか高い磁場中またはLLSの形式は、2つ以上の結合された核の非局在化における単核固有状態との間の不均衡として持続させることができる。最初のオプションのために、プローブ核が高いと、他の核から離れなければなりませんこのような陽子などの磁気回転比、。このような位置は、天然に見出されていない場合は、重陽子による活性核の近傍でのプロトンの分子または交換中に孤立したサイトでのNMR活性核における濃縮は、磁気双極子強度を低下させることが必要であり、 。LLSを得るために、核のグループ内の磁気結合の理論解析は、サップの最適な手段を見つけるために27,28を実施することができますORT分極。この戦略は、29アミノ酸、目的の代謝サイクルに関与する他の分子にも適用することができるような小分子で成功しています。より良い実験中に磁化を保持するには、LLSの励起による溶解DNPの組み合わせは、他の酵素反応のための測定時間スパンを延長することを約束する。20 ここで説明DNP-NMR実験は、癌細胞中でピルビン酸代謝の測定に適合されている。溶解DNP増強NMRによる酵素活性のリアルタイム測定はDNP増強MRIにより癌の診断において現在の努力を助けることができる6、既に使用しますクリニック。12 DNP-強化NMRの分子特異性は、分子標的とそれらの変換の製品を区別するための選択の方法になります。将来の改善は、代謝変換の他の分子トレーサーの評価に焦点を当てます30 </SUP&gt; MRI診断に関連する影響を受けやすいだけでなく、拡張された観測時間窓を得た上で。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNP polarizer</td>
			<td style="width:287px;">Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)</td>
			<td style="width:119px;">///</td>
			<td style="width:167px;">Cryostat and electronic equipment for sample polarization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum system components</td>
			<td style="width:287px;">Edwards vacuum (France)</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>
			- turbomolecular pumping setup
			- membrane pumping setup
			- high capacity roots pumping system
			- vacuum fittings and components
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNP 3.35T Magnet</td>
			<td style="width:287px;">Bruker (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">500MHz NMR Spectrometer</td>
			<td style="width:287px;">Bruker (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Origin 8.0</td>
			<td style="width:287px;">OriginLab (US)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:287px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">490709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">186414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;4-Hydroxy-TEMPO 97%</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">176141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">phosphate buffer, pH&#160;=&#160;7.0</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LDH enzyme in&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;">L-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin, BSA</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich (France)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissolution dynamic nuclear polarization instrumentation for real-time enzymatic reaction rate measurements by nmr

NMRベースの調査の主な制限は、低感度です。これにより、代謝変換のリアルタイムNMR測定を防止し、長い取得時間を入力するよう求められます。溶解DNPを介した過分極は、電子・ツー・核スピン分極移動に起因する大規模なアウトオブ平衡核磁化のおかげで感度の問題の一部を回避します。得られた高NMR信号は、リアルタイムでの化学反応をモニターするために使用することができます。過分極NMRの欠点は、関連付けられた緩和時間定数のオーダーで、好ましい場合において、核スピン縦緩和時間定数、T 1、または程度で通常の信号取得のための限られた時間ウィンドウ内に常駐結合された核の一重項状態、T LLS。内因性分子および代謝速度の細胞取り込みは、腫瘍の発生と薬剤応答に不可欠な情報を提供することができます。ニューmerous以前の過分極NMR研究は、 インビボでの酵素活性をモニタリングするための代謝基質としてピルビン酸の関連性を実証しました。この作品は、特に、過分極NMRによる乳酸脱水素酵素（LDH）の存在下でピルビン酸対乳酸の変換率を、酵素反応の研究に必要な実験装置と方法の詳細な説明を提供します。

溶解DNPを使用して、NMR信号ゲイン DNPの効果は、サンプルのマイクロ波照射下、NMR活性核に、典型的には安定したラジカル分子から、不対電子スピンの高い偏光の伝達にあります。最も頻繁に使用されるフリーラジカルは、TAM（OXO63）およびTEMPOLある。TEMPOLを用いて4偏光手順は「交差偏光」によって最適化することができる。25 固体状態での最大の核分極を得るために、安定したラジカルの濃度を最適化する技術の成功に重要です。最適TEMPOL濃度は、この研究の実験条件で33ミリモルであることが見出されました。選択されたこの基板の偏光は、リアルタイムでその酵素変換をたどるのに十分です。 polariの磁場ZERパリデカルトに設置されたB 0 = 3.35 Tであり、このシステムの構成要素は、（ 図1から3）上記に記載されています。クライオスタットの設計は、最終サンプル位置は、磁石アイソセンタと一致することを保証します。偏光子の磁場は、傾斜したと代わりにクライオスタットで、唯一の超伝導シムコイルを使用してシム。 1×0.5×0.5センチ水サンプルの最終的な陽子線幅は23キロヘルツでした​​。私たちは、評価しました<img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" />そして<img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> [1 13 C]ピルビン酸のために。そのためには、13 C DNP強調信号を決定することが必要です<img alt="式5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" />溶解（ 図4A）の前に、偏光子サイトで固体インチ溶解後、我々は[1-測定しました13 C]ピルビン酸過分極信号<img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" />そして、分光器サイトでその崩壊。液体状態信号は、NMR分光計において試料としてD 2 Oの500μLを用いて、試験溶解を測定しました。これは、私たちは、固体DNPエンハンスメント（ 図4B、挿入図）、液体状態のNMR偏光レベル（ 図4B）および転送中の偏光損失を決定することができました。信号間の比率は、ステップ3.3で測定し、3.2は、固体エンハンスメントを定めるステップ<img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> 。ステップ7.1において測定された第一の信号と、ステップ7.2からの信号との間の比率は、液状過分極増強を定義します<img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> 。 ステップ3、sのデータ図4Aおよび 図4A（挿入図）でummarized、技術は[1- 13 C]ピルビン酸までに13 Cを分極することを可能にすることを示しています<img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> 13 Cの分極に対応する±5 = 22、 <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> = 1.5±0.3％。 この分極レベルは、一般的なMRS 条件 （例えば、11.74 Tおよび300 K）以上の千倍の炭素熱偏光です。 図4B及び図4B（挿入図）にまとめてステップ7からのデータは、[1- 13 C]ピルビン酸の液体状態の13 Cの過分極を決定できるように、 <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> = 1±0.2％。ピルビン酸のために、固体状態で得られた強化がありました実験の目的のために十分な、より高い拡張機能が異なる基を使用して実証されているものの5のステップ7.1からの時間経過データのフィットを緩和時定数の測定値を与えます。 500μlのDNP強化ソリューションと500μlのD 2 Oからなる混合物中のピルビン酸縦緩和時間は、T RF補正後の1 = 75±5秒（式（3）を参照）でした。 酵素活性および代謝の測定 13 C標識基質（A）の溶解DNP NMR検出は、リアルタイム酵素的変換のダイナミクスに従って、生成物（B）の形成を観察するために使用することができます。 <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation1.jpg" />直ちに過分極基材（A）の注射後、製品（B）の信号はnullです。その後、酵素的変換は、（1）（B）を生成し始めます。 13 C核の磁化は、異なる化学シフト、および分子の化学変化に影響されません。それにもかかわらず、新しい環境は、製品の信号の時間経過を定性的3段階で分離することができるB. 13 Cに対して異なる縦緩和速度をもたらし得る：最初に、Bに変換する酵素的変換は、B信号の増加を生成します。一定時間後に、実験条件に依存して、原因緩和への磁化損失は、この増加とBの信号をバランスさが最大に達しました。最終的に、より長い時間で、Bの信号は、縦緩和による減衰します。酵素飽和の仮説では、逆変換を無視し、アカウント磁気緩和を考慮して、酵素的変換中に2分子種（A及びB）の磁化はCOUによって記述することができますPLED微分方程式系：22 <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation2.jpg" /> M（A、B）（t）が分子種AおよびBの磁化である場合、それぞれ、K effは 、酵素反応によって信号伝達のための効果的な変換速度定数であり、R（A、B）は、見かけの縦緩和速度定数であります分子種AとBで観測された核の、それぞれ純粋な縦磁化緩和と高周波パルス化の効果の両方のためのR（A、B）のアカウント。： <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation3.jpg" /> T 1、（A、B）は、縦緩和でありますそれぞれの分子種AとBの局所分子環境における核の時定数、。θ、τ は 、RFフリップ角と、それぞれ2つの信号の取得、間の遅延です。 本研究では、基板Aと製品Bは、それぞれ[1- 13 C]ピルビン酸および[1- 13 C]乳酸であった、との目的はありません（同位体の条件でLDHにより[1- 13 C]乳酸産生を測定することでした非標識）乳酸は、実験の開始時に溶液中に存在しました。測定は、T = 21℃での簡単なpulseacquire系列で記録された13 Cスペクトルのシリーズで構成されています。較正10°フリップ角パルスを順次励起する（ステップ9）のために使用しました。 2つの連続するパルス間の遅延は、τ= 1.5秒でした。 NMR取得シーケンスは、数十秒の超偏極solut前に開始しました。イオン注入。注入後、サンプルチューブ内のピルビン酸基質濃度は25〜35 mmでした。ステップ10 -3 U / mlでのLDH濃度でピルビン酸の変換速度の乳酸を測定しました。乳酸およびピルビン酸から記録された信号だけでなく、式中のモデル（2）（ 図5の点線）と歩留まりのk effのに合わせ = 0.9±0.1×10 -3 秒 -1（ 図5）。この値は、比[ラック] / [Pyrで]時間0秒で（ 図5、挿入図）によって決定された初期反応速度と一致します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig1.jpg" /> 実験装置の 1 回路図を 図 。偏光子は、（左）、ワイドボア3.35 T超電導磁石に入れクライオスタット（d）の内側に位置するマイクロ波キャビティ（C）からなります。カスタムメイドのNMRコイル（b）の周囲トン彼は、サンプル（A）は、 その場での核スピンの分極を監視するために使用されます。サンプルはマイクロ波周波数νMW = 94 GHzで照射しながらヘリウム浴温度は1.12±0.03 Kに維持されます。 NMR測定は、偏光の間に、固体サンプル上で実行するためのシステムを可能にします。偏サンプルが過熱水に溶解し、以前に隣接NMR分光計（右）の内側に配置された試料管への移送ラインを介して圧縮されたヘリウムガスでプッシュされます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig2.jpg" /> 図2.クライオスタットや真空システム回路図。 （A）クライオスタット断熱デュワー。 （B）の叫び<html>メインインサートostat。 （C）真空システムの接続、 （D）ステップ2およびプロトコルセクションの手順5で説明した特定の操作を実行するために使用されるボタンを持つ管理ソフトウェアインターフェイスのスクリーンショット。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig3.jpg" /> 図3.サンプルハンドリングと解散。 （A）サンプル処理インサート。 （B）溶解インサート。 （C）溶解インサートの電空接続の詳細。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &quot;&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig4.jpg" /> 図4. ソリッド・ステート・偏光の蓄積及び過分極信号減衰。溶解DNP信号。 DNP分極（指数関数S（T）を取り付け交雑、= A X EXP（-t / T中の1.12 Mナトリウム[1- 13 C]ピルビン酸溶液（A）固体NMR偏光蓄積信号B）+ = 270秒時定数T bの B）と緩和（円、S（t）は・EXP（トン/ T B）+ B、T SS 1 = 840秒）=; （A、挿入図）固体状態でDNPenhancedと熱的に偏（スケールアップ10倍）磁化信号間の比較（εのSS =固体分極P SS = 1.5±0.3％に相当する22±5）。 （B）の溶解とアベラ後に記録された第1のスペクトルとの比較熱偏13 Cから得られたGEDスペクトル（100回をスケールアップ）が1024トランジェント（ε=千±200）を使用して、室温でスピン。溶解プロセスは、40％の推定信号損失で3.3秒、自動注入は約2秒を要しました。手動注入することによって、試料を移送行った実験のために、長い射出遅延による追加の損失は30％と推定されました。 （B、挿入図）LDHの不在（T 1 = 75±5秒）で溶解した後、ピルビン酸の過分極信号減衰。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig5.jpg" /> 図5. LDH活性と癌細胞の代謝の結果。原因enzymaに[1- 13 C]乳酸塩信号のアップを構築10のLDH濃度でチック変換-3 U / mlの原因13 C磁化の縦緩和に信号減衰が続きます。赤い線は、リラクゼーションと酵素変換の効果を備えた式（2）で説明したモデルとの適合を示しています。 [1- 13 C]乳酸と反応速度の外挿と[1 -13 C]ピルビン酸濃度との間の（挿入図）比時刻 t = 0（赤線）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Nanyang Technological University

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10.6K ビュー.  Université Paris Descartes. The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

ビデオ: Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

Channels for the transportation of water molecules in enzymes influence active site solvation and catalysis. Herein we present a protocol for the engineering of these additional catalytic motifs based on in silico computer modeling and experiments. This will enhance our understanding of the influence of solvent dynamics on enzyme catalysis.

膜酵素で溶剤ダイナミクスによって誘導される解明エントロピーレートの高速化

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

化学

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

光駆動酵素的脱炭酸

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

薄いガラス質膜のダイナミクスを決定するレート依存エリプソメトリー測定を冷却

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

リアルタイムでのキトサンフィルム上にペプチドグラフトを監視するためのキャピラリー電気泳動

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

動的光散乱顕微鏡による濁りソリューションにおける粒度分布の測定

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

高分解能質量分析に結合された二次 Nanoelectrospray イオン化を用いたリアルタイム呼吸解析

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

U2O5 Film Preparation via UO2 Deposition by Direct Current Sputtering and Successive Oxidation and Reduction with Atomic Oxygen and Atomic Hydrogen

We describe a method to produce U2O5 films in situ using the Labstation, a modular machine developed at JRC Karlsruhe. The Labstation, an essential part of the Properties of Actinides under Extreme Conditions laboratory (PAMEC), allows the preparation of films and studies of sample surfaces using surface analytical techniques such as X-ray and ultra-violet photoemission spectroscopy (XPS and UPS, respectively). All studies are made in situ, and the films, transferred under ultra-high vacuum from their preparation to an analyses chamber, are never in contact with the atmosphere. Initially, a film of UO2 is prepared by direct current (DC) sputter deposition on a gold (Au) foil then oxidized by atomic oxygen to produce a UO3 film. This latter is then reduced with atomic hydrogen to U2O5. Analyses are performed after each step involving oxidation and reduction, using high-resolution photoelectron spectroscopy to examine the oxidation state of uranium. Indeed, the oxidation and reduction times and corresponding temperature of the substrate during this process have severe effects on the resulting oxidation state of the uranium. Stopping the reduction of UO3 to U2O5 with single U(V) is quite challenging; first, uranium-oxygen systems exist in numerous intermediate phases. Second, differentiation of the oxidation states of uranium is mainly based on satellite peaks, whose intensity peaks are weak. Also, experimenters should be aware that X-ray spectroscopy (XPS) is a technique with an atomic sensitivity of 1% to 5%. Thus, it is important to obtain a complete picture of the uranium oxidation state with the entire spectra obtained on U4f, O1s, and the valence band (VB). Programs used in the Labstation include a linear transfer program developed by an outside company (see Table of Materials) as well as data acquisition and sputter source programs, both developed in-house.

U2O5 Film Preparation via UO2 Deposition by Direct Current Sputtering and Successive Oxidation and Reduction with Atomic Oxygen and Atomic Hydrogen

This protocol presents the preparation of U2O5 thin films obtained in situ under ultra-high vacuum. The process involves oxidation and reduction of UO2 films with atomic oxygen and atomic hydrogen, respectively.

U2O5膜を介して直流スパッタリングと連続酸化による UO2成膜と酸素原子と水素原子の還元

We describe a method to produce U2O5 films in situ using the Labstation, a modular machine developed at JRC Karlsruhe. The Labstation, an essential part ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition parameters such as gas flow rate that results in changes on composition and thus in the film required properties. In this report, reactive sputtering is used to deposit niobium oxide films. A niobium target is used as metal source and different oxygen flow rates to deposit niobium oxide films. The oxygen flow rate was changed from 3 to 10 sccm. The films deposited under low oxygen flow rates show higher electrical conductivity and provide better perovskite solar cells when used as electron transport layer.

Here, we present a protocol for niobium oxide films deposition by reactive sputtering with different oxygen flow rates for use as an electron transport layer in perovskite solar cells.

反応性スパッタリングによって堆積した酸化ニオブ膜:酸素流量の影響

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...