Yazarlar bu çalışmayı finanse Doğal Bilimler ve Kanada (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi teşekkür ederim.

Medya ve Kültürler 1. Hazırlık <ol><li> LB + amp: Luria-Bertani etsuyu (LB) ve 500 mi, 30 dakika boyunca 121 ° C&#39;de bir otoklav ile sterilize hazırlayın. kullanılana kadar ampisilin ile Ek 4 ° C&#39;de ampisilin ve deposunun 100 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. </li><li> TB + Amp için: büyük (500 ml veya daha fazla) üretimi ministring hacimleri hazırlanın. 30 dakika boyunca 121 ° C&#39;de bir otoklav sterilize steril Terrific Broth (TB) 600 ml hazırlayın. kullanılana kadar ampisilin ile Ek 4 ° C&#39;de ampisilin ve deposunun 100 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. </li><li> LB agar + amp: agar 15 g / l ile desteklenmiş LB + amp hazırlanması steril LB agar levhaları hazırlayın. Lik bir porsiyon yaklaşık 15 - ters 4 ° C&#39;de steril petri deposunda 20 mi gerekene kadar. </li><li> tarafından aseptik W3NN [pdms] çizgiler W3NN [pdms] bir çizgi tabak hazırlayın LB agar + Amp üzerinde hücreleri. plaka overni inkübe30 ° C&#39;de GHT tek koloniler gözlenebilir kadar. protelomerase ifadesini yeniden tutmanın önlemek için bu sıcaklığın üzerinde W3NN inkübe etmeyin. </li><li> Aseptik olarak transferi steril bir test tüpüne LB + Amp 5 ml. çizgi plaka tek bir koloni ile bu hacim aşılayarak W3NN [pdms] bir gecede kültür hazırlayın. 230-250 rpm&#39;de bir çalkalayıcıda 30 ° C &#39;de kültür bir gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 2. Büyüme Aşaması <ol><li> Aseptik olarak steril 125 ml Erlenmeyer şişesi içine transferi LB + Amp 10 mi ve 1 yapma hazırlanan LB + Amp içerisine gece boyunca W3NN [PDMS] kültür, 100 ul ile inoküle: 100 seyreltme. <ol><li> Daha büyük miktarlar için, bunun yerine LB + Amp, 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde TBC + amp 50 ml gecelik kültürün 500 ul ekle. </li><li> Alternatif olarak, aşama 2.2 ikinci &quot;temsilci&quot; kültür olarak kullanmak. </li></ol></li><li> cul kadar 30 ° C ve 250 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe inkübe600 = 0.8: Türe bir optik yoğunluk (OD) veya absorbans ile gösterilen, eski kütük fazı için orta ulaşır. 1-2 saat sonra, orta çıplak gözle bulanık görünmeye başlaması gerekir. <ol><li> Aseptik olarak transferi temiz bir spektrofotometre küvetine kültür 1 ml. </li><li> 600 nm&#39;ye ayarlanmış dalga boyunda bir UV-vis spektrofotometre kullanarak ışık absorbansı ölçülür. Hücreler boş (LB veya TB) ayarlamak için yetiştirilen edildiği medya 1 ml kullanın. İsteğe bağlı olarak, yerine bu adım için adım 2.1.3 temsilcisi kültür kullanın. </li><li> kültür henüz uygun OD ulaşmış değilse, çalkalayıcı dönmek ve bir kez daha her yarım saatte bir kontrol edin. 600 0.8 yaklaştıkça daha sık OD edin. </li></ol></li><li> Kültür 600 = 0.8 ile gösterilen eski kütük fazı, ulaştığında, aseptik olarak steril bir 50 ml santrifüj tüplerine kültür aktarın. </li><li> 10 dakika için 10,000 x g&#39;de kültürü santrifüj hücreleri toplamak. pedikür için kontrol edinTüpün alt llet. </li><li> uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabı içine temizlenmiş süpernatant süzün. Hücre pelet Rahatsız etmeyin. </li><li> tüm hücreleri toplanıncaya kadar tekrarlayın 2,4-2,5 adımları. </li><li> 100 ul LB + Amp pelet yeniden askıya. Aspire bir mikropipet kullanarak veya bir vorteks karıştırıcı kullanın. daha ministring üretimi için, taze LB + Amp eden 1 ml&#39;lik ortam içine 50 mi TB + amp kültürünü pelet yeniden askıya. </li></ol> 3. Ministring Üretimi <ol><li> Aseptik 42 ° C&#39;ye kadar bir 125 mL Erlenmeyer şişesi ve ısı LB + amp 20 ilave edin. daha ministring üretimi için, 42 ° C&#39;ye kadar ön ısıtmaya tabi LB + Amp 500 ml hazırlanması. </li><li> Önceden ısıtılmış ortama tabanda aktarın. </li><li> 42 ° C&#39;de inkübe edilir ve 600 = 1.0 ile gösterilen son log fazı kadar 250 rpm. 1 saat geçmiş 42 ° C&#39;de kültür 20 ml bırakmayın. </li><li> 37 ° C sıcaklığı azaltmak ve bir addin kültür bırakıntional 90 dakika. 500 ml için 90 ek indüksiyon dönemi için kültür bırakın - 120 dakika ve sıcaklığını düşürür yoktur. </li><li> 30 ° C&#39;ye düşürülür ve 2 saat arasında ek bir sıcaklık vites küçültme süreyle 200 rpm&#39;de sallama kültüründen bırakın. 500 ml için 4 saat veya gece sıcaklık vites küçültme uzatmak. </li></ol> 4. Hasat Ministrings <ol><li> Aseptik steril bir 50 ml santrifüj tüplerine kültür aktarın. 10 dakika boyunca 10.000 x g&#39;de santrifüj ve pelet olup olmadığını kontrol edin. </li><li> pelet rahatsız etmeden uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabına süpernatant süzün. tüm hücreleri toplanmıştır kadar tekrarlayın. </li><li> Daha sonra çıkarılması için -80 ° C&#39;de sıvı nitrojen ve mağaza herhangi bir ticari çıkarma ve endotoksin çıkarma kiti veya flash dondurma ile plazmid çıkarılması için pelet saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6,+interleukin+12,+and+interferon+&#947;.">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon &#947;.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li><li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+from+plasmid+DNA+gene+therapy+vectors+is+negatively+affected+by+CpG+dinucleotides.">Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides.</a> Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).</li><li>Darquet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle:+an+improved+DNA+molecule+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer.">Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.</a> Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).</li><li>Gracey Maniar, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+achieve+sustained+expression+reflected+by+active+chromatin+and+transcriptional+level.">Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.</a> Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).</li><li>Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercoiled+minivector+DNA+resists+shear+forces+associated+with+gene+therapy+delivery.">Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery.</a> Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).</li><li>Hacein-bey-abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li><li>Nafissi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+ministrings:+highly+safe+and+effective+gene+delivery+vectors.">DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal-size+vector+(MIDGE)+improves+transgene+expression+in+colon+carcinoma+cells+and+avoids+transfection+of+undesired+DNA.">A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA.</a> Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).</li><li>Wang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+micro-linear+vector+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+delivery+and+its+application+for+EBV+positive+tumors.">A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors.</a> PLoS One. 7 (10), (2012).</li><li>L&#243;pez-Fuertes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+with+linear+minimalistic+(MIDGE)+vectors+confers+protection+against+Leishmania+major+infection+in+mice.">DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice.</a> Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+size+MIDGE+vectors+improve+transgene+expression+in+vivo.">Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo.</a> In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).</li><li>Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PY54,+a+linear+plasmid+prophage+of+Yersinia+enterocolitica+with+covalently+closed+ends.">PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends.</a> Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).</li><li>Nafissi, N., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+in-vivo+linear+covalently+closed+DNA+vector+production+system.">Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system.</a> Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).</li><li>Xu, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcriptional+regulatory+elements+for+constructing+plasmid+vectors.">Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.</a> Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).</li><li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+induced+by+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli.">Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).</li><li>Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+purification+of+linear+covalently+closed+deoxyribonucleic+acid+by+Q-anion+exchange+membrane+chromatography.">Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography.</a> J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).</li><li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+amplification+in+Escherichia+coli+after+temperature+upshift+is+impaired+by+induction+of+recombinant+protein+synthesis.">Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).</li><li>Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system.">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var beyan.

Biz tipik bakteriyel büyüme ve manipülasyonu kullanılan bu kenara özel ekipman gerektirir tek aşamalı bir ısı ile uyarılabilir bir protokol kullanılarak LCC DNA ministrings üretimi için basit bir sistem tarif eder. DNA ministrings Prokaryotik genetik elemanların yoksun torsiyonsuz ve sabit lineer DNA ekspresyon kasetleri vardır. Ökaryotik sistemlerde transgen ekspresyonunun etkinliğine yönelik gen transferi, haberci genlerin ekspresyonu yanı sıra değerlendirmeler için geleneksel yöntemlerin yerine kullanılabilmektedir. DNA ministrings biyouyumluluk ve lineer DNA vektörleri üstün güvenlik profili ile &quot;mini&quot; vektörlerin artan transfeksiyon verimliliği faydalarını birleştirir. In vivo üretim platformu bizim sağlam tek aşamalı hızlı ve kolay bir çok pahalı in vitro işleme gerek olmadan herhangi bir gen transfer uygulama için DNA ministrings üretir. birkaç kritik adımlar vardırOptimal ministring üretimini (Şekil 2 ve 3) emin olun. Isı indüksiyon üretimini ministring için en kritik adımdır. üretim ministring tam olmaması nedeniyle protelomerase ifade baskı LCC ministring haberci plazmidinin dönüşüm önleyen ısı indirgemesi (30 ° C &#39;de muhafaza edilmiş), eksikliği muhtemeldir. Isı indüksiyon protokolü takiben, yaklaşık% 75 bir üretim verimliliğini bekliyoruz. Hücreler log fazında ise ısı indüksiyon en uygunudur. ( &quot;Büyümüş&quot; Şekil 3) sabit faz hücreleri kullanırken PE ministring istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmasına rağmen, biz genel plazmid verimi neredeyse% 50&#39;lik bir azalmaya dikkat yaptı. Verim kullanılan plazmid çıkarma protokolü bağlıdır. Hücreler log fazında iken uygun ministring üretimi için, ısı indirgemesi tetikler. Kötü ministring üretimi, büyük olasılıkla uzun süreli sıcaklık yükseltme veya insufficie bir sonucu olacaktırnt sıcaklık vites küçültme. Bu E. aktive olarak uzun süreli sıcaklık vites büyütme önerilmez protelomerase aktivitesini inhibe edebilir ve plazmid stabilitesi müdahale edebilir coli ısı şokuna cevap veren 15. Bu nedenle, sıcaklık downshift zamanlama verimli ministring üretimi için bir başka kritik bir adımdır. 30 ° C &#39;de ek bir inkübasyon süresi olmadan ministring üretim verimliliği çok zayıf olduğu bulundu ( &quot;erken kaldırılması&quot;, Şekil 3). Bu Tel ifade ve aktivite için gerekli olan süreyi bağlı olabilir. Menşeli profajından PY54 şifreleyen Tel protelomerase normal optimal 30 ° C de, Tel aktivitesi için daha optimum olabileceğini göstermektedir, yaklaşık 28 ° C 12 büyür Yersinia, bozar. DNA, minivector üretim sistemi, yüksek kaliteli bakteriyel sekansı içermeyen DNA minivectors üretmek için bir in vivo platformu kullanır. protokole Değişiklikler i mayçoğalma fazı sırasında hücre büyümesini (yerine LB TB) teşvik ya da üretim ve dönüşüm etkinliğini ministring artırmak için plasmid ve protein üretimini optimize etmek için büyüme ortamı değiştirme nclude. Daha büyük kültür hacimleri (200 ml ve üzeri), sıcaklık vites küçültme ve 30 ° C&#39;de inkübasyon için PE ministring üzerinde ciddi olumsuz etkisi olmadan bir gecede uzatılabilir. Bu örnek olarak, 500 ml kültürler için protokol taditattan. DNA ministrings saflaştırılması prokaryotik omurgası in vitro endonükleaz sindirim yoluyla hızlandırılmış olabilir. Endonükleaz, hedef siteye vardır (örneğin, PI-SceI, Pvu, Scal) açık doğrusal ortaya çıkarmak için kesilebilir ön-madde plazmid prokaryotik omurgası üzerine prokaryotik omurgasının in vitro degradasyon sağlayan, sona erer. Diğer vektör türlerden ministrings izolasyonu da anyon değiştirmeli membran kromatografisi 16 ile elde edilebilir. LCC DNA vektörü üretim sistemi ile ilişkili bir akım sınırlama diğer LCC ve CCC ürünleri DNA ministring saflaştırılması için ihtiyaç vardır. Kolayca standart plazmid izolasyon yöntemleri kullanılarak saflaştınldı, ancak izolasyon aşaması, yine de büyük ölçekli bir ortamda bir dezavantaj olabilir. ministring ayrılması zaman alıcı ministring ve LCC prokaryotik omurga boyutu çok benzer ise AGE kullanarak olabilir. Seçenek olarak ise, anyon değiştirmeli membran kromatografisi CCC vektörü türlerinin 16 ministrings daha iyi ayrılmasını sağlayabilir. Yüksek sıcaklıklar da E. ısı şok tepki aktive olarak sıcaklık vites büyütme başka potansiyel sınırlama olabilir olumsuz rekombinant proteini etkileyen E. coli, 17 verir ve dolayısıyla dönüşüm ministring için plazmid oranlarını azaltmak. Biz üretim platformu optimizasyonları aşmak ve / veya ısı şoku 18 gibi etkilerini azaltmak için başka bir yerde rapor. BizAyrıca, şu anda ortadan kaldırmak ya da in vivo LCC prokaryotik omurga kirlenmesini azaltmak için yöntemler optimize ediyoruz. LCC, DNA ministring kromozomal entegrasyon konak kromozomu bozar ve apoptoz hücreyi tabi. Sadece bu tür onkogenezde ve komşu genlerin susturma, böylece onun güvenliğini iyileştirilmesi gibi girmeyle mutagenez olumsuz sonuçlarını azaltmak gelmez; öldürücü etkisi, aynı zamanda ilişkili yan etkileri ve entegrasyon zarar vermeden knock-in ve gen değiştirme çalışmaları için ideal bir yöntem olarak kullanılabilir. DNA, ministring vektörleri in vivo olarak belirli bir hedef haline Terapötik proteinlerin, RNA, antikorlar veya antijenler için genlerin transferi ve ifadesi olarak uygulanacak ya da arızalara veya çalışmayan alel yerine edilebilir. Basit tek aşamalı ısı ile uyarılabilir in vivo üretim sistemi, DNA ministring vektörleri kolaylıkla klinik veya endüstriyel uygulamalar için üretilen sağlar.

Amacı, kovalent (LCC), DNA minivectors basit ve yüksek verim tek-aşamalı ısı ile uyarılabilir İn vivo DNA ministring üretim sistemi kullanılarak kapalı doğrusal büyütülebilir miktarlarda üretilmesidir. DNA ministrings DNA teslim etmek için güvenli ve etkili bir viral olmayan bir strateji sağlar. Bunlar DNA kangallı verimlilikle LCC vektörlerinin güvenlik kombine ve aynı zamanda transfeksiyon verimi ödün vermeden virüs türevli vektörler için daha güvenli bir alternatif sunmaktadır. başarılı olması için bir transgen dağıtım sistemi için, DNA vektörü hedef konakçı hücrenin girerek kodlanmış transgen (ler) i eksprese gerekir. Özellikle memeli sistemlerinde, uygulamada aşılması gereken çeşitli hücresel engeller vardır. retiküloendotelyal sistem serum nükleazlar ve immün tayini ile bozulmasını önlemek için, DNA vektörü hedef sisteme sahip biyolojik ve bağışıklık-uyumlu olmalıdır. Korunmasız DNA hızla plazma nükleazlar tarafından sindirilirDNA vektörü, hızla hedef hücrelerin plazma membran geçme kabiliyetine sahip olmalıdır, böylece ve plazmid membran yoğun lipoprotein bariyerleri oluşmaktadır. hücreye bir kez, vektörler sitoplazmaya hareket olması ve transgen sentezlenmesi için çekirdeğe girmek için çekirdek membranından geçerler. Viral olmayan gen iletim sistemleri doku ve hücre hedefleme geliştireceklerdir. Bununla birlikte, bu teknikler ile geleneksel plasmidlerin kullanımı nedeniyle hızlı bir şekilde gen ekspresyonu 1,2 sessizlikler imünojenik bakteriyel dizilerin varlığında transfeksiyon verimini azaltır. Konvansiyonel plazmidler genellikle prokaryotik sistemlerde bakım için antibiyotik direnç genleri taşır. Bununla birlikte, bu, insan ana olası yan etkilere ya da doğal olarak yatay gen transfer etkileri üzerinden ana florasının oluşan karşı direnci olabilir. Konvansiyonel plazmidler de potansiyel istenmeyen immünostimulan tepkisini tetikleyebilir dinükleotid CpG motifleri 2 içerenazaltılması veya transgen ekspresyonunu susturulması. Bunlar sadece ökaryotik ekspresyon kasetinin oluşmaktadır olarak, DNA kangallı 3 DNA minivectors, dolayı azaltılmış boyut ve immünostimülatör prokaryotik elemanlarının bulunmaması da hücre dışı ve hücre içi biyolojik ve gelişmiş bir gen ekspresyonunu sergilemiştir gen dağıtımı için daha iyi bir alternatif 4. Daha iyi bir hedef bölgeye 5 in vivo tatbikat ile ilgili kesme kuvvetlerine karşı direnç ile ilgili olarak düşük vektör boyutu bileti. Birim kütle başına vektörün yüksek kopya sayısı ve böylece toksisite azaltarak daha az transfeksiyon reaktifi gerektirir. Bununla birlikte, bir konukçu kromozomu içine entegrasyon Vektör durumunda, dairesel kovalent molekül süreklilik vermek DNA kangallı geleneksel plasmidlerin her iki dahil olmak üzere (CCC) vektörleri, kapalı ve dolayısıyla yıkıcı sonuçlara sahip olabilir girmeyle mutagenez, yol açabilir <s&gt; 6 kadar. Nispeten, lineer DNA vektörünün entegrasyonu bu şekilde çoğalan hücre popülasyonundan gelen mutant hücresidir çıkarılması ve sokma mutagenezi 7 önlenmesi, hücre ölümü, yollar kromozomu bozan ve başlatır. Minimalistic imünolojik tanımlanan gen ekspresyonu (Sineği) vektörleri 8 ve mikro doğrusal vektörleri 9 (MiLV), in vitro gelişen LCC DNA vektörleri bulunmaktadır. Sineği vektörleri bilinen plazmid DNA 11 vektörleri ile karşılaştırıldığında in vivo koşullarında, bir 17-kat daha iyi transgen ekspresyonu kadar sergiledi ve Vaccine 10 ve kanser 8 gen terapisinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Buna ek olarak, LCC minivector bükülme olmadan bir yapıya, daha az transfeksiyon reaktifi, böylece toksisite 7 indirgeyici CCC süper-muadili göre gereklidir. Geliştirilmiş LCC DNA vektörleri, DNA&#39;nın ministrings üstün sentezleme verimlilik ve bioavai göstermiştiroynaklığı 7. Ayrıca DNA ministrings tek-aşamalı bir ısı ile uyarılabilir in vivo üretim sistemi, in vitro olarak çok sayıda basamak gerektirdiğinden tatarcık ve MiLV LCC vektörleri, bir uygun ve düşük maliyetli bir alternatif üretilmektedir. Gösterilmelidir DNA ministring üretim sistemi yapma, in vivo olarak gerçekleştirilen basit bir ısı ile indüklenebilen bir işlemdir hem de düşük maliyetli ve kolay bir şekilde büyütülebilir. Bu sistem, Yersinia enterocolitica bakteriyofaj PY54 türetilmiş Tel / PAL prokaryotik plazmid omurgasından az ökaryotik ekspresyon kaseti ayırmak için rekombinasyon sistemi 12 protelomerase patlatır. Biz ısı uyarılabilir bakteriyofaj λ promotör, cl [Ts] 857 13 kontrolü altında Tel protelomerase ifade Escherichia coli hücreleri (W3NN) tasarladık. İfade üzerine, Tel protelomerase &quot;Süper Sırası&quot; (SS) haberci plazmid üzerinde bulunan siteler içinde mevcut dostum hedef sitelerinde hareketDNA, ministring Daha sonra (Şekil 1) saflaştırılabilir olan LCC ürünler elde edilir. DNA, ministring ön-madde plazmid SS siteleri de böylece bir ön-madde plazmidden izogenik LCC ve CCC minivectors üretimini kolaylaştırmak Cre rekombinaz (lx), TelN protelomerase (telRL) ve Flp rekombinaz (STT) dahil olmak üzere diğer rekombinaz için hedef sitesi kodlayan. Buna ek olarak, her bir SS Alanı çekirdek translokasyonunu 14 geliştirmek için hizmet SV40 güçlendirici (SV40e) dizileri tarafından her iki yandan da taarruz edilen. Biz SV40e ardışık ilaveli kademeli Transfeksiyon etkinliğindeki 7 karşılık gelen bir artış sağladığını başka göstermiştir. Ön-madde plasmidi (pDNA MiniString veya PDMS), yeşil floresan haberci (GFP) ile transkripsiyonel füzyon daki herhangi bir istenen gen sokulmasını kolaylaştırmak için bir poli-(Şekil 1) içerir. DNA minivector teknolojisi olabilirökaryotik sistemlerde transgen ekspresyonunun etkinliğine yönelik gen transferi, haberci genlerin sentezlenmesi ve değerlendirmeler için geleneksel yöntemlerin yerine kullanılabilir. DNA ministrings biyouyumluluk ve lineer DNA vektörleri üstün güvenlik profili ile &quot;mini&quot; vektörlerin artan transfeksiyon verimliliği faydalarını birleştirir. Bizim sağlam bir adım üretim platformu hızla ve kolayca herhangi bir gen transfer uygulaması için DNA ministrings üreten ve daha yüksek bir güvenlik profili sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

Bu, in vivo olarak basit bir platform ile üretilen bir non-viral gene teslim vektörü alternatif olarak lineer kovalent olarak kapalı (LCC), DNA minivectors inşa edilmiştir. DNA ministrings yükseltilmiş bir güvenlik profiline sahiptir ve aynı zamanda verimli bir şekilde hedeflenen hücrelere DNA yük sağlar. Geleneksel DNA vektörleri, antibiyotik direnç genleri, CpG motifleri ve konakçı bağışıklık yanıtlarının uyarılmasına neden olabilir bakteriyel replikasyon kökeni, aşağıdakileri içeren, istenmeyen prokaryotik sekansları taşır. Geleneksel bir DNA vektörlerinin biyoyararlanım nedeniyle daha büyük bir molekül boyutuna taviz verilmektedir. Onların dairesel doğası da sokma mutajenezi neden kromozomal entegrasyon vermek olabilir. Bakteriyel sekansları, ilgili (GOI) ve gerekli ökariyotik sentezleme elemanları, sadece gen bırakarak, DNA minivectors eksize edilir. Bizim LCC DNA minivectors veya DNA ministrings, bağışıklık bakteriyel dizilerin yoksun olan; Bu nedenle th iyileştirilmesiEIR biyoyararlanım ve GOI ifade. kromozom içine, vektör bütünleşmesinden durumunda, LCC DNA ministring öldürücü böylece proliferasyon hücre popülasyonundan tehlikeli mutantını kaldırma konakçı kromozomuna bozacaktır. istenmeyen vektör entegrasyon olaylar için potansiyel ortadan kaldırırken Sonuç olarak, DNA ministrings &#39;minicircle&#39; DNA avantajlar sunuyoruz. Geleneksel plasmidler ve izogenik dairesel kovalent olarak kapalı (CCC) meslektaşları karşılaştırıldığında DNA ministrings birçok biyolojik, transfeksiyon verimi ve sitoplazmik kinetiği göstermektedir - Dolayısıyla, hedef hücrelerin etkili transfeksiyon için katyonik yüzey aktif alt ihtiyaç duyarlar. Biz, kullanımı basit, hızlı ve ölçeklenebilir Escherichia coli DNA ministrings üretimi için in vivo sistem olarak uyanlabilir tek-aşamalı bir inşa ettiler.

DNA ekstraksiyonu, artık habercisi plazmid, LCC prokaryotik omurga ve DNA ministring sonra telafi edilecektir. Genel olarak plazmid verim ve saflık, spektrofotometre kullanılarak değerlendirilebilir. Saflık 260 nm ve 1.9-2.0 lik bir oran optimal 280 nm&#39;de (A260 / A280) absorbans oranı kullanılarak tahmin edilir. Tüm LCC ve CCC ürünleri, agaroz jel elektroforezi (AGE) (Şekil 2) vasıtasıyla ayrılabilir. YAŞ öncesi saflaştırma ministring için, ısı indüksiyon sonrası üretim ministring sonuçlarını görüntüler. Ministring üretim kalite değerlendirmesi ebeveyn plazmid (5.6 kb) (Şekil 2) ministring (2.4 kb) bant yoğunluğu karşılaştırarak, bu aşamada yapılabilir. Ministring DNA YAŞ aşağıdaki standart plazmid jel ekstraksiyon protokolleri üzerinden elde edilebilir. 3 taşıma sırasında oluşabilecek çeşitli koşullar altında üretim verimliliği ministring özetlemektedir Şekilprotokol dışarı ing. Ministring üretim verimliliği üreticinin analiz programı kullanılarak DNA bandı yoğunluğuna göre belirlenmiştir. Herhangi benzer dansitometrisi programı YAŞ sonuçlarını analiz etmek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1:. Üretim ministring genel (A) ana vektör iki P sitelerinin çerçeveli bir raportör gen ile kopyalama füzyon bir poli içerir. Omurga ampisilin direnci için beta-laktamaz kodlar ve ayrıca in vitro sindirim için omurgaya özgü birçok kesim siteleri içerir. Ana protokol (B) genel bakış. Adımlar 2) Büyüme Faz ve 3) Ministring Üretim protokolünün sadeliği vurgulayarak, ilgili adımların genel bir şematik sağlamak için bir diyagram temsil edilmektedir. (C) Ministring indüksiyon. Isı indüksiyon ana plazmidler SS sitelerinde Tel etkinliği takip tel ifadesini sağlayan, sıcaklığa duyarlı bastırıcı inaktive. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Şekil 2: protokolden sapmalar sonra üretime Ministring. 1: Kumanda, 2: indüklenmeyen, 3: Büyümüş, 4: Overinduced, 5: Erken Kaldırma. DNA ministring LCC omurgası 3 kb, yaklaşık 2,4 kb ve pNN9 ebeveyn plazmid 5.6 kb. ministring ve LCC omurga bantların bant yoğunluğu düşük ministring verimi gösteren protokolden sapmalar ile bırakın. Soldan sağa: New England Biolabs&#39;dan 1Kb lader; Kontrol, protokol takip edilerek Uyarılmamış, hiçbir sıcaklık vites büyütme; Büyümüş, sıcaklık Durin viteseg durağan faz; Overinduced, geniş sıcaklık vites büyütme; Erken kaldırma, hiçbir sıcaklık vites küçültme. Plazmidler Omega-Biotek EZNA Plazmid Mini Kit kullanılarak çıkarıldı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Şekil 3:. Üretim verimliliğini (PE) ministring protokolüne sapmaların Etkileri Sonuçları 3 çalışmaların ortalamasıdır. PE YAŞ sonrası Alphalmager&#39;in HP kullanılarak ölçülen bağıl bant yoğunluğu tahmin edilmektedir. sapmaları aşağıdaki adımlardan meydana: Kontrol, protokolü takip; Uyarılmamış, 2. adımda hiçbir sıcaklık vites büyütme; Büyümüş, sıcaklık vites büyütme aşamasında 1.6 de sabit faz sırasında başladı; Adım 2.3 de Overinduced, genişletilmiş sıcaklık vites büyütme; Erken kaldırma, hücreler çıkarıldı ve çıkarılanAdım 2.3 sıcaklık vites küçültme olmadan. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Double-stranded DNA Ministrings at JoVE.com

Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

Çift şeritli DNA Ministrings üretimi

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K Görüntüleme.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Video: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

<meta charset="utf8"></head><body>DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetik

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Yolu Büyümesi ile Gözlenen CMG Aracılı DNA Çözülmesi

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tek Moleküllü Görselleştirme Yoluyla Ökaryotik DNA Replikasyonunun Dinamiklerini Çözme

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Biyokimya

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

DNA Replikasyon Çatalı

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

Education

JoVE Core

Moleküler Biyoloji

Unit 1

DNA Replikasyonu

KEY TERMS AND CONCEPTS

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

Çift İplik Kopmalarının Onarımı

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

DNA Tamiri ve Rekombinasyonu

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

Prokaryotlarda Replikasyon

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Çift şeritli DNA Ministrings üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

DNA Perdeleri Homolog Rekombinasyon Sırasında Karmaşık Moleküler Sistemlere Işık Tutuyor

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

DNA Replikasyon Çatalı

Çift İplik Kopmalarının Onarımı

Prokaryotlarda Replikasyon