המחברים מודים למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) למימון עבודה זו.

1. הכנת Media ותרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור LB + Amp: כן 500 מיליליטר של מרק לוריא- Bertani (LB) מעוקר באמצעות חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מוסף עם אמפיצילין להניב לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של אמפיצילין ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור TB + Amp: היכונו גדול (500 מ&quot;ל או יותר) כרכים של ministring הייצור. כן 600 מיליליטר של מרק נהדר סטרילי (TB) מעוקר באמצעות חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מוסף עם אמפיצילין להניב לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של אמפיצילין ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור LB אגר + Amp: להכין צלחות אגר LB סטרילי על ידי הכנת LB + Amp השלימו עם 15 גר &#39;/ ל של אגר. Aliquot כ 15 - 20 מ&quot;ל במנות סטרילי פטרי החנות במהופך על 4 מעלות צלזיוס עד לרגע השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת פס של W3NN [PDMS] על ידי בסביבה נקייה מחיידקים פסים W3NN [PDMS] תאים על אגר LB + Amp. דגירה את הצלחת overnight על 30 מעלות צלזיוס, עד שניתן לראות מושבות אחת. אין דגירה W3NN מעל לטמפרטורה זו כדי למנוע derepressing ביטוי protelomerase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 5 מ&quot;ל של LB + Amp לתוך מבחנה סטרילית. הכן תרבות הלילה של W3NN [PDMS] על ידי יחסנו נפח זה עם מושבה אחת מהצלחת פס. דגירת לילה התרבות ב 30 מעלות צלזיוס שייקר ב 230-250 סל&quot;ד. </li></ol> 2. צמיחת שלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 10 מ&quot;ל של LB + Amp לתוך בקבוק 125 מ&quot;ל Erlenmeyer סטרילית לחסן עם 100 μl של תרבות לילה W3NN [PDMS] לתוך Amp LB + מוכן, מה שהופך דילול 1: 100. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת נפחים גדולים יותר, להוסיף 500 μl של תרבות הלילה לתוך 50 מ&quot;ל של שחפת + Amp בבקבוק Erlenmeyer 250 מ&quot;ל, במקום LB + Amp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש כמו התרבות &quot;נציג&quot; השנייה בשלב 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת חממה רועדת ב 30 ° C ו 250 סל&quot;ד עד המבוי הסתוםture מגיע באמצע לשלב יומן מאוחר, שמסומן על ידי צפיפות אופטית (OD) או ספיגה: 600 = 0.8. לאחר 1-2 שעות, המדיום צריך להתחיל להופיע עכור לעין בלתי מזוינת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 1 מ&quot;ל של תרבות קובט ספקטרופוטומטר נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת האור באמצעות ספקטרופוטומטר UV-VIS עם אורך גל מוגדר 600 ננומטר. השתמש 1 מ&quot;ל של התקשורת שבו התאים גדלו להגדיר את החסר (LB או TB). לחלופין, השתמש תרבות נציג משלב 2.1.3 עבור שלב זה במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התרבות טרם הגיעה OD המתאים, לחזור שייקר ולבדוק שוב כל חצי שעה. בדוק את OD בתדירות גבוהה יותר כמו A 600 מתקרב 0.8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התרבות הגיעה בשלב מאוחר יומן, שמציינים 600 = 0.8, בסביבה נקייה מחיידקים ולהעביר את התרבות לתוך צינורות צנטריפוגות סטרילי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי צנטריפוגה התרבות ב XG 10,000 למשך 10 דקות. בדוק עבור PEllet בתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant פינה לתוך מיכל פסול Biohazard מתאים. נא לא להפריע התא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.4-2.5 עד שכל התאים כבר נאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות גלולה ב 100 μl LB + Amp. לשאוב באמצעות micropipette או להשתמש במיקסר מערבולת. לייצור ministring יותר, מחדש להשעות את הגלולה מתוך 50 מיליליטר TB + תרבות Amp לתוך 1 מיליליטר של תקשורת LB + Amp הטרי. </li></ol> 3. הפקת Ministring <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף 20 מ&quot;ל של LB + Amp בבקבוק 125 מ&quot;ל Erlenmeyer וחום עד 42 ° C. לייצור ministring יותר, להכין 500 מ&quot;ל של LB + Amp, שחומם מראש ל 42 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את resuspension לתוך המדיום שחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 42 מעלות צלזיוס, 250 סל&quot;ד עד שלב יומן בעבר, שמציינים 600 = 1.0. אל תשאיר 20 מ&quot;ל של התרבות ב 42 מעלות צלזיוס בעבר 1 hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר את התרבות עבור addi90 דקות תזונתיות. עבור 500 מיליליטר, לעזוב את התרבות לתקופת אינדוקציה נוספת של 90 - דקות 120 ואינו להפחית את הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את הטמפרטורה ל 30 מעלות צלזיוס ולהשאיר את התרבות הרועדת ב 200 סל&quot;ד במשך תקופת downshift טמפרטורה נוספת של 2 שעות. עבור 500 מ&quot;ל, להאריך את downshift הטמפרטורה ל 4 שעות או למשך הלילה. </li></ol> 4. Ministrings קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, להעביר את התרבות לתוך צינורות צנטריפוגות סטרילי 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 10 דקות ולבדוק עבור גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant לתוך מיכל פסול Biohazard מתאים מבלי להפריע הגלולה. חזור על הפעולה עד שכל התאים כבר נאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור גלול להפקת פלסמיד עם כל הפקה מסחרית וערכת הסרת רעלן פנימית או להקפיא פלאש בחנקן נוזל חנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך חילוץ מאוחר יותר. </li></ol>

<ol>
	<li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6,+interleukin+12,+and+interferon+&#947;.">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon &#947;.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li><li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+from+plasmid+DNA+gene+therapy+vectors+is+negatively+affected+by+CpG+dinucleotides.">Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides.</a> Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).</li><li>Darquet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle:+an+improved+DNA+molecule+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer.">Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.</a> Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).</li><li>Gracey Maniar, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+achieve+sustained+expression+reflected+by+active+chromatin+and+transcriptional+level.">Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.</a> Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).</li><li>Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercoiled+minivector+DNA+resists+shear+forces+associated+with+gene+therapy+delivery.">Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery.</a> Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).</li><li>Hacein-bey-abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li><li>Nafissi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+ministrings:+highly+safe+and+effective+gene+delivery+vectors.">DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal-size+vector+(MIDGE)+improves+transgene+expression+in+colon+carcinoma+cells+and+avoids+transfection+of+undesired+DNA.">A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA.</a> Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).</li><li>Wang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+micro-linear+vector+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+delivery+and+its+application+for+EBV+positive+tumors.">A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors.</a> PLoS One. 7 (10), (2012).</li><li>L&#243;pez-Fuertes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+with+linear+minimalistic+(MIDGE)+vectors+confers+protection+against+Leishmania+major+infection+in+mice.">DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice.</a> Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+size+MIDGE+vectors+improve+transgene+expression+in+vivo.">Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo.</a> In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).</li><li>Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PY54,+a+linear+plasmid+prophage+of+Yersinia+enterocolitica+with+covalently+closed+ends.">PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends.</a> Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).</li><li>Nafissi, N., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+in-vivo+linear+covalently+closed+DNA+vector+production+system.">Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system.</a> Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).</li><li>Xu, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcriptional+regulatory+elements+for+constructing+plasmid+vectors.">Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.</a> Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).</li><li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+induced+by+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli.">Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).</li><li>Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+purification+of+linear+covalently+closed+deoxyribonucleic+acid+by+Q-anion+exchange+membrane+chromatography.">Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography.</a> J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).</li><li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+amplification+in+Escherichia+coli+after+temperature+upshift+is+impaired+by+induction+of+recombinant+protein+synthesis.">Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).</li><li>Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system.">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li></ol>

החוקרים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לייצור ministrings LCC DNA באמצעות פרוטוקול חום מושרת צעד אחד, שאינו דורש שום ציוד מיוחד מלבד זה אשר משמש התפתחות חיידקים טיפוסית ומניפולציה. ministrings DNA הם נטול פיתול, קלטות ביטוי ה- DNA ליניארי יציבות, נטולות אלמנטים גנטיים פרוקריוטים. הם עשויים לשמש מקום של שיטות קונבנציונליות עבור העברת גנים, ביטוי של גני כתב, כמו גם בהערכות לקראת יעילות ביטוי transgene במערכות איקריוטיים. ministrings DNA לשלב את biocompatibility והטבות יעילות transfection מוגברת של וקטורים &quot;מיני&quot; עם פרופיל בטיחות מעולה של וקטורים DNA ליניארי. הצעד האחד החזק שלנו ב לפלטפורמת הפקת vivo במהירות ובקלות מייצר ministrings DNA עבור כל יישום העברת גנים ללא הצורך בתהליכים במבחנה יקר רבים. ישנם מספר צעדים קריטייםלהבטיח ייצור ministring אופטימלי (איורים 2 ו -3). אינדוקציה החום הוא השלב הקריטי ביותר כדי ministring הייצור. חוסר מוחלט של ministring הייצור הוא ככל הנראה בשל חוסר אינדוקציה (תאי שמר על 30 מעלות צלזיוס), שבו דיכוי הביטוי protelomerase מונע ההמרה של פלסמיד מבשר ministring LCC. בעקבות פרוטוקול האינדוקציה, מצפה יעיל ייצור של כ 75%. אינדוקציה חומה היא אופטימלית תוך תאים נמצאים בשלב יומן. למרות שאין הבדל משמעותי סטטיסטית ministring PE בעת שימוש תאים בשלב נייח ( &quot;מגודל&quot;, איור 3), עשינו להשקיף כמעט ירידה של 50% בתשואה פלסמיד הכולל. תשואות תהיינה תלויות בפרוטוקול חילוץ פלסמיד המשמש. לייצור ministring אופטימלי, לעורר השראה חומה תוך תאים נמצאים בשלב יומן. ייצור ministring מסכן יהיה ככל הנראה בעקבות upshift הטמפרטורה ממושכת או insufficiedownshift הטמפרטורה NT. טמפרטורת upshift הממושכת היא מיואשת כמו זה מפעיל את ה בתגובת הלם חום coli 15, אשר עשוי לעכב פעילות protelomerase ולהפריע יציבות פלסמיד. לכן, תזמון downshift הטמפרטורה היא עוד שלב קריטי לייצור ministring יעיל. בלי זמן הדגירה נוסף על 30 מעלות צלזיוס, יעילות הייצור ministring נמצאה להיות מאוד עלוב ( &quot;הסרת מוקדמת&quot;, איור 3). זה ניתן לייחס את כמות הזמן הנדרשת עבור ביטוי תל ופעילות. Protelomerase תל קידוד שמקורם prophage PY54 בדרך כלל מדביק Yersinia, אשר גדל בצורה אופטימלית סביב 28 מעלות צלזיוס 12, המציין כי 30 ° C יכול להיות גם אופטימלי יותר לפעילות תל. מערכת ייצור DNA minivector מנצל פלטפורמה in vivo כדי ליצור minivectors רצף ה- DNA ללא חיידקים באיכות גבוהה. שינויים בפרוטוקול יורשה ליnclude לשנות את התקשורת צמיחה לייעל פלסמיד וייצור חלבון כדי להאיץ גדילת תאים במהלך שלב הצמיחה (TB במקום LB), או להגדיל ministring יעילות הייצור וההמרות. עבור אמצעי אחסון תרבות גדול יותר (200 מ&quot;ל ו יותר), downshift הטמפרטורה הדגירה על 30 מעלות צלזיוס ניתנת להארכה לילה ללא השפעה שלילית חמורה על ministring PE. כללנו שינויים בפרוטוקול שלנו עבור 500 מ&quot;ל תרבויות כדוגמה. טיהור ministrings DNA יכול להיות מזורזת דרך עיכול במבחנה endonuclease של עמוד השדרה פרוקריוטים. ישנם מספר אתרי יעד endonuclease (למשל, PI-SCEI, PvuI, SCAI) נגיש עמוד השדרה פרוקריוטים של פלסמיד המבשר, אשר ניתן לחתוך לחשוף ליניארי פתוח מסתיים, המאפשר שפל במבחנה של עמוד השדרה פרוקריוטים. בידוד של ministrings ממיני וקטור אחרים יכול גם להיות מושג באמצעות כרומטוגרפיה קרום אניוני 16. מגבלה הנוכחית אחת הקשורים למערכת ההפקה וקטור LCC DNA הוא הצורך לטיהור של ministring DNA ממוצרים LCC ו CCC אחרים. למרות מטוהרים בקלות באמצעות שיטות בידוד פלסמיד סטנדרטיות, צעד הבידוד עדיין יכול להיות חסרון באווירה בקנה מידה גדולה. ההפרדה של ministring יכול להימשך זמן רב באמצעות AGE אם ministring ועמוד השדרה פרוקריוטים LCC דומות מדי בגודל. לחלופין, כרומטוגרפיה קרום אניוני עשויה לספק הפרדה טובה יותר של ministrings ממיני וקטור CCC 16. Upshift טמפרטורה יכול להיות אחרת הגבלה פוטנציאל כמו טמפרטורות גבוהות גם מפעיל את התגובה להלם חום ב E. coli, אשר משפיע באופן שלילי חלבון רקומביננטי מניב 17 ולהפחית עקב שיעורי פלסמיד ministring המרה. אנו מדווחים במקום אחר אופטימיזציות של פלטפורמת ההפקה לעקוף ו / או להפחית תופעות כאלה של חום הלם 18. אָנוּגם הם אופטימיזציה שיטות כרגע למנוע או להפחית LCC זיהום עמוד השדרה פרוקריוטים in vivo. אינטגרציה כרומוזומלית של ministring DNA LCC משבש את כרומוזום מארח ומשעבד התא לאפופטוזיס. לא זו בלבד להפחית תוצאות שליליות אפשריות של mutagenesis insertional כגון oncogenesis והשתקה של גנים סמוכים, ובכך לשפר את הבטיחות שלה; האפקט הקטלני גם יכול לשמש ככלי עזר אידיאליים-ב דפיקה ומחקרי החלפת הגן ללא תופעות הלוואי הקשורות והניזק של אינטגרציה. וקטורים DNA ministring יכול להיות מיושם כלפי ההעברה ואת הביטוי של גנים עבור חלבונים תרופתיים, RNA, נוגדנים, או אנטיגנים לתוך יעד נתון in vivo או להחליף אלל פונקציונלי רַע או אי. החום-מושרה צעד אחד פשוט במערכת הייצור vivo מאפשרת וקטורי ministring DNA להיות מיוצרים בקלות ליישומים קליניים או תעשייתיים.

המטרה היא לייצר כמויות להרחבה של ליניארי סגור קוולנטית (LCC) minivectors ה- DNA באמצעות מושרה חום צעד אחד יעילות פשוט גבוהה מערכת ייצור in vivo DNA ministring. ministrings DNA לספק אסטרטגיה שאינה ויראלי בטוחה ויעילה להעביר דנ&quot;א. הם משלבים את הבטיחות של וקטורי LCC עם היעילות של minicircles DNA, וגם להציע חלופה בטוחה יותר וקטורים הנגזרים וירוס מבלי להתפשר יעילות transfection. על מנת מערכת המסירה transgene כדי להצליח, וקטור DNA חייב להיכנס לתא היעד המארח ולהביע את הגן המקודד (ים). ישנן מספר מחסומי הסלולר שצריכים להתגבר בפועל, במיוחד במערכות יונקות. כדי למנוע שפלה ידי nucleases בסרום וזיהוי חיסוני על ידי מערכת reticulo-אנדותל, וקטור DNA חייב להיות ביו וחסין-תואם עם מערכת היעד. DNA לא מוגנים מתעכל מהר ידי nucleases פלזמהואת קרום פלסמיד מורכב מחסומים ליפופרוטאין צפופים כך וקטור DNA חייב להיות מסוגל לחצות את קרום התא במהירות של תאי יעד. לאחר בתא, וקטורים חייבים לחצות את הציטופלסמה ולהעביר דרך קרום הגרעין להיכנס לגרעין לביטוי transgene. טכניקות למסירת הגן ללא ויראלי להתמקד שיפור של רקמות ותא מיקוד. עם זאת, השימוש של פלסמידים קונבנציונאלי עם טכניקות אלו מפחית יעילות transfection בשל נוכחותם של רצפים חיידקי immunogenic, אשר במהירות משתיק ביטוי גנים 1,2. פלסמידים קונבנציונלי בדרך כלל לשאת גנים עמידים לאנטיביוטיקה לצורך התחזוקה במערכות פרוקריוטים. עם זאת, אלה עשויים לייצר השפעות שליליות אפשריות ב מארחי אדם או להקנות עמידות המתרחשים מארח צומח טבעי באמצעות אפקטי העברת גנים אופקיים. פלסמידים קונבנציונלי גם מכילים מוטיבים CPG dinucleotide 2, אשר יכול לעורר תגובה immunostimulatory רצויות, באופן פוטנציאליצמצום ביטוי transgene או השתקה. כפי שהם מורכבים אך ורק של קלטת ביטוי איקריוטיים, DNA minivectors, כגון דנ&quot;א minicircles 3, הם אלטרנטיבה טובה יותר עבור משלוח גן כפי שהם מציגים שיפור זמינות ביולוגית תאית ו תאי ביטוי גנים משופר בשל הגודל המופחת שלהם ואת העדר אלמנטים פרוקריוטים immunostimulatory 4. פארס גודל הווקטור המופחת טוב יותר ביחס התנגדות לכוחות גזירה הקשורים in vivo ממשל אתר יעד 5. מספר העותק הגבוה של הווקטור לכל המוני יחידה דורש הגיב transfection פחות, ובכך להקטין רעילות. עם זאת, במקרה של שילוב וקטור אקראי לתוך כרומוזום מארח, מעגלי סגור קוולנטית (CCC) וקטורים, כולל שני minicircles דנ&quot;א פלסמידים קונבנציונלי, להקנות המשכיות מולקולרית ועל כן היא עשויה להוביל mutagenesis insertional, אשר יכולה להיות השלכות הרסניות <sעד&gt; 6. יחסית, שילוב של וקטור DNA ליניארי משבש את כרומוזום ויוזמת מסלולים מוות של תאים, ובכך להסיר את התא מוטציה מן האוכלוסייה תא מתרבים ומניעת mutagenesis insertional 7. ביטוי גנים Minimalistic מוגדר אימונולוגית (מידג &#39;) וקטורים 8 ו וקטורים ליניארי מיקרו 9 (MiLV) הם וקטורים LCC דנ&quot;א שפותח במבחנה. וקטורי מידג הפגינו עד ביטוי transgene השתפר 17 פי in vivo בהשוואה ל- DNA פלסמיד הקונבנציונלי וקטורי 11, ו הראו תוצאות מבטיחות 10 חיסון ריפוי גנטי לסרטן 8. בנוסף, בשל מבנה פיתול חינם של minivector LCC, מגיב transfection נדרש פחות בהשוואה למקבילו supercoiled CCC, ובכך להקטין רעילות 7. וקטורים DNA LCC משופרת שלנו, ministrings DNA, הוכיחו יעילות ביטוי מעולה bioavaiלביליונים 7. יתר על כן, ministrings DNA מיוצר על מערכת ייצור חום-מושרה צעד אחד in vivo, חלופה כדאית וחסכונית וקטורי מידג ו MiLV LCC, הדורשים שלבים מרובים במבחנה. מערכת ייצור DNA ministring להיות הפגינה היא תהליך חום מושרה פשוט בצע in vivo, מה שהופך אותו הן חסכונית וניתן להרחבה בקלות. מערכת זו מנצלת את תל PY54 הנגזר בקטריופאג enterocolitica Yersinia / PAL protelomerase מערכת רקומבינציה 12 להפריד את קלטת ביטוי איקריוטיים המינימאלית מן שדרת פלסמיד פרוקריוטים. יש לנו מהונדסים Escherichia coli תאים (W3NN) להביע תל protelomerase תחת שליטה של האמרגן λ בקטריופאג חום מושרה, CI [Ts] 857 13. עם הביטוי, תל protelomerase פועלת באתרים PAL היעד הנוכחי בתוך &quot;רצף סופר&quot; (SS) אתרים הממוקמים על פלסמיד מבשרכדי להניב מוצרי LCC, שממנה ministring DNA יכול להיות מטוהר אז (איור 1). האתרים SS על פלסמיד מבשר DNA ministring גם לקודד אתרי היעד recombinases אחרים כולל Cre recombinase (לקס), TelN protelomerase (telRL) ו FLP recombinase (FRT), ובכך מקלות על ייצור של LCC isogenic ו CCC minivectors מן הפלסמיד מבשר אחד. בנוסף, כל אתר SS הוא מוקף משני עברי רצפים משפרים SV40 (SV40e), המשמשים לשיפור טרנסלוקציה גרעין 14. אנחנו הוכחנו במקום אחר כי בנוסף רצוף של SV40e בהדרגה מקנה עליות המקבילה יעיל transfection 7. הפלסמיד המבשר (pDNA MiniString או PDMS) מכיל polylinker (איור 1) כדי להקל על כניסה של כל גן רצוי של עניין היתוך תעתיק עם כתב הניאון הירוק (GFP). הטכנולוגיה DNA minivector רשאילשמש מקום של שיטות קונבנציונליות עבור העברת גנים, ביטוי של גני כתב, והערכות לקראת יעילות ביטוי transgene במערכות איקריוטיים. ministrings DNA לשלב את biocompatibility והטבות יעילות transfection מוגברת של וקטורים &quot;מיני&quot; עם פרופיל בטיחות מעולה של וקטורים DNA ליניארי. פלטפורמת הפקת הצעד אחד החזקה שלנו במהירות ובקלות מייצרת ministrings DNA עבור כל יישום העברת גנים ומציעה פרופיל בטיחותי גבוה.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

בנינו ליניארי הסגור קוולנטית (LCC) DNA minivectors כחלופת וקטור שאינו ויראלי גן-משלוח המיוצרת באמצעות פלטפורמה פשוטה in vivo. Ministrings DNA בעל פרופיל בטיחות מוגבר וגם ביעילות ולספק מטען DNA אל תאים ממוקדים. וקטורי DNA קונבנציונליים לבצע רצפים פרוקריוטים רצויים, כוללים גנים עמידים לאנטיביוטיקה, מוטיבי CPG, ומקורותיה בקטריאלי של שכפול, דבר שעלול להוביל לגירוי של תגובות חיסוניות מארח. הזמינות הביולוגית של וקטורי DNA קונבנציונליים נפגעת גם בשל הגודל המולקולרי הגדול שלהם. טבעו המעגלי שלהם עשוי גם להקנות אינטגרציה כרומוזומליות, שמוביל mutagenesis insertional. רצפים חיידקית הם נכרתו מן minivectors DNA, ומשאירים רק את הגן של עניין (ממשלת ישראל) ואלמנטי ביטוי איקריוטיים צורך. minivectors DNA LCC שלנו, או ministrings DNA, הם נטולי רצפים חיידקי immunogenic; ולכן שיפור הזמינות ביולוגית EIR וביטוי ממשלת ישראל. במקרה של שילוב וקטור לתוך הכרומוזום, ministring DNA LCC יהיה קטלני לשבש את כרומוזום המארח, ובכך להסיר את המוטציה המסוכנת מן אוכלוסיית התא מתרבה. כתוצאה מכך, ministrings DNA מציע את היתרונות של DNA &#39;minicircle&#39; תוך ביטול פוטנציאל אירועי אינטגרצית וקטור רצויים. בהשוואה פלסמידים קונבנציונאלי וסגר עגול isogenic שלהם קוולנטית (CCC) עמיתיהם, ministrings DNA להפגין הזמינות הביולוגית מעולה, יעילות transfection, קינטיקה ציטופלסמית - הם כן הם דורשים כמויות נמוכות של חומרים פעילי שטח קטיוני עבור transfection יעילה של תאים היעד. בנינו-צעד אחד מושרה במערכת vivo לייצור ministrings דנ&quot;א coli Escherichia כי הוא פשוט לשימוש, מהיר, וניתן להרחבה.

לאחר מיצוי DNA, פלסמיד מבשר שיורית, עמוד השדרה פרוקריוטים LCC, ואת ministring DNA יהיה התאושש. תשואה וטוהר פלסמיד בסך הכל ניתן להעריך באמצעות ספקטרופוטומטר. טוהר נאמד לפי היחס של הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר (A260 / A280) שבו יחס של 1.9-2.0 הוא אופטימלי. הכל מוצרי LCC ו CCC ניתן להפריד באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose (AGE) (איור 2). גיל מדמיין את תוצאות ministring ייצור לאחר אינדוקציה, לפני ministring טיהור. הערכה איכותית של ייצור ministring יכול להתבצע בשלב זה על ידי השוואת עוצמת הלהקה של ministring (2.4 kb) כדי פלסמיד הורה (5.6 kb) (איור 2). Ministring DNA ניתן לשחזר באמצעות פרוטוקולי מיצוי ג&#39;ל תקן פלסמיד הבאים AGE. איור 3 מסכם ministring יעיל ייצור בתנאים שונים עשויים להתרחש בעת carrying את הפרוטוקול. יעילות הייצור Ministring נקבע בהתבסס על עוצמת הלהקה DNA באמצעות תוכנית ניתוח של היצרן. כל תוכנית צפיפות דומה ניתן להשתמש כדי לנתח את התוצאות של גיל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1:. סקירה כללית של ministring ייצור (א) וקטור האב מכילה polylinker בתהליך איחוי תעתיק עם גן כתב, ממוסגרת על ידי שני אתרי SS. עמוד השדרה מקודד-lactamase בטא להתנגדות אמפיצילין וגם מכיל מספר אתרים לחתוך ייחודיים לשדרה לעיכול במבחנה. (ב) סקירה כללית של הפרוטוקול הראשי. שלבים 2) צמיחת שלב ו -3) Ministring הפקה מיוצגים דיאגרמה לספק סכמטית כוללת של השלבים הכרוכים, המדגיש את הפשטות של הפרוטוקול. (C) אינדוקציה Ministring. אינדוקציה חומה inactivates המדכא רגישה לטמפרטורה, המאפשר ביטוי תל ואחריו פעילות תל באתרי ס&quot;ס פלסמידים ההורה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> איור 2: Ministring ייצור לאחר חריגות פרוטוקול. 1: שליטה, 2: Uninduced, 3: מגודל, 4: Overinduced, 5: הסרת הקדומה. DNA ministring הוא כ 2.4 קילו, עמוד השדרה LCC הוא 3 kb, ואת הפלסמיד הורה pNN9 הוא 5.6 kb. עוצמת להקה של להקות עמוד שדרת ministring ו LCC טיפה עם חריגות פרוטוקול, מציין תשואת ministring נמוכה. משמאל לימין: 1 סולם kb מניו אינגלנד Biolabs; שליטה, בעקבות פרוטוקול; Uninduced, לא upshift הטמפרטורה; מגודל, הטמפרטורה upshift דוריןבשלב נייח גרם; Overinduced, upshift טמפרטורה מורחב; הסרה מוקדם, לא downshift טמפרטורה. פלסמידים חולצו באמצעות ערכת מיני פלסמיד אומגה Biotek EZNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> איור 3:. השפעות חריגות פרוטוקול על ministring יעילות הייצור (PE) תוצאות הם ממוצע של 3 ניסויים. PE נאמד עוצמת הלהקה יחסית למדוד באמצעות AlphaImager HP לאחר גיל. הסטיות להתרחש בכל השלבים הבאים: בקרה, בעקבות פרוטוקול; Uninduced, לא upshift הטמפרטורה בשלב 2; upshift מגודל, הטמפרטורה החל בשלב נייח בשלב 1.6; Overinduced, upshift הטמפרטורה הוארך בשלב 2.3; הסרת מוקדם, תאים יוסרו חילוץללא downshift הטמפרטורה בשלב 2.3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Double-stranded DNA Ministrings at JoVE.com

Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K Views.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Video: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetics

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

<meta charset="utf8"></head><body>התרת DNA בתיווך CMG שנצפתה על ידי צמיחת דרכי ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת הדינמיקה של שכפול דנ"א אאוקריוטי באמצעות הדמיה של מולקולה אחת

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Biochemistry

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

מזלג שכפול הדנ"א

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

Education

JoVE Core

Molecular Biology

Unit 1

DNA Replication

KEY TERMS AND CONCEPTS

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

שכפול בפרוקריוטים

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Cell Biology

DNA Replication and Repair

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

תיקון שברים דו-גדיליים

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

DNA Repair and Recombination

The Replisome

DNA replication is carried out by a large complex of proteins that act in a coordinated matter to achieve high-fidelity DNA replication. Together this complex is known as the DNA replication machinery or the replisome.
The synthesis of the leading and lagging strands is a highly coordinated process. To explain this, the &#8220;Trombone model&#8221; was proposed by Bruce Alberts in 1980. The DNA loop formation starts when a primer is synthesized on the parent lagging strand. The loop grows with the synthesis of an Okazaki fragment and finally dissolves when synthesis of the fragment ends. The DNA polymerase then attaches to another primer and the whole cycle, from loop formation to collapse, is repeated. The replisome allows all of the activities to be coordinated as a replication machinery complex.
Replisome components
Helicases unwind and separate double-stranded DNA.&#160; These enzymes are present as a single hexamer ring in prokaryotes and as a double hexamer ring in eukaryotes. Eukaryotic helicases depend on additional proteins, Cdc45 and GINS, to function.&#160; Single-stranded DNA binding (SSB) proteins keep the DNA strands from reannealing.&#160; In prokaryotes, SSBs consist of a single subunit, whereas in eukaryotes, they are a heterotrimeric protein known as replication protein A (RPA).
Primase adds an RNA primer to where DNA synthesis will originate.&#160; In prokaryotes, primase is present as a single subunit enzyme called DnaG, which synthesizes an RNA primer of around 12 nucleotides.&#160; In eukaryotes, a multisubunit enzyme, DNA polymerase-&#945; primase, synthesizes an RNA-DNA hybrid primer of around 25 nucleotides. In addition to polymerase-&#945;, replicative polymerase will extend the newly synthesized DNA. While a single type of replicative polymerase, DNA polymerase III, is present in prokaryotes, two different types of replicative polymerases, Pol &#949; and Pol &#948;, are present in eukaryotes, for leading strand and lagging strand synthesis, respectively.&#160;
Sliding Clamp proteins keep the polymerases attached to the DNA template. &#160;&#946;-clamp, a homodimeric protein, acts as the clamp in prokaryotes. In eukaryotes, the same task is performed by proliferating cell nuclear antigen (PCNA), a homotrimeric protein. The central pore of the sliding clamp is positively charged, which enables it to have electrostatic interactions with the negatively charged phosphate backbone of the DNA. The clamp is attached to the DNA by a Clamp Loader. These pentameric proteins belong to the AAA+ class of ATPases. The eukaryotic clamp loader is known as replication factor C, while the prokaryotic E. coli clamp loader is known as the &#947; complex; however, the clamp proteins and clamp loaders are thought to be evolutionary homologs unlike many other components of the replisome.

The Replisome Components and the Trombone Model

התשובה

DNA replication is carried out by a large complex of proteins that act in a coordinated matter to achieve high-fidelity DNA replication. Together this ...

הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

מזלג שכפול הדנ"א

שכפול בפרוקריוטים

תיקון שברים דו-גדיליים

התשובה