Name: production of double-stranded dna ministrings
Uploaded: 2016-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
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Gli autori ringraziano i scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (NSERC) per il finanziamento di questo lavoro.

1. Preparazione di Media e Culture <ol><li> Per LB + Amp: Preparare 500 ml di Luria-Bertani brodo (LB) sterilizzati con autoclave a 121 ° C per 30 minuti. Supplemento con ampicillina fino ad ottenere una concentrazione finale di 100 ug / ml di ampicillina e conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per TB + Amp: Preparare per le grandi (500 ml o superiore) volumi di Ministring produzione. Preparare 600 ml di sterile Terrific Broth (TB) sterilizzati in autoclave a 121 ° C per 30 min. Supplemento con ampicillina fino ad ottenere una concentrazione finale di 100 ug / ml di ampicillina e conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per LB agar + Amp: Preparare sterili piastre di agar LB preparando LB + Amp integrata con 15 g / L di agar. Aliquota di circa 15 - 20 ml in piastre di Petri sterili e conservare a testa in giù a 4 ° C fino al momento. </li><li> Preparare un piatto striscia di W3NN [PDMS] da asetticamente striature W3NN [PDMS] celle su agar LB + Amp. Incubare la piastra di overnight a 30 ° C, fino singole colonie possono essere osservati. Non incubare W3NN di sopra di questa temperatura per evitare derepressing espressione protelomerase. </li><li> Trasferire asetticamente 5 ml di LB + Amp in una provetta sterile. Preparare una cultura durante la notte di W3NN [PDMS] inoculando questo volume con una singola colonia dalla piastra consecutive. Incubare la notte coltura a 30 ° C in un agitatore a 230-250 rpm. </li></ol> 2. fase di crescita <ol><li> Asetticamente trasferimento 10 ml di LB + Amp in una sterile 125 ml beuta e inoculare con 100 ml di una notte W3NN [PDMS] cultura nel preparato LB + Amp, facendo una diluizione 1: 100. <ol><li> Per i volumi superiori aggiungere 500 ml di cultura durante la notte in 50 ml di TB + Amp in un pallone da 250 ml Erlenmeyer, invece di LB + Amp. </li><li> In alternativa, utilizzare come secondo la cultura &quot;rappresentante&quot; al punto 2.2. </li></ol></li><li> Incubare in un incubatore agitazione a 30 ° C e 250 rpm fino alla culture raggiunge metà alla fase logaritmica tardiva, indicato da una densità ottica (OD) o l&#39;assorbanza: A 600 = 0,8. Dopo 1-2 ore, il mezzo dovrebbe cominciare ad apparire torbido a occhio nudo. <ol><li> Trasferire asetticamente 1 ml di cultura ad una provetta spettrofotometro pulito. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza luce utilizzando uno spettrofotometro UV-vis con la lunghezza d&#39;onda di 600 nm impostato. Usare 1 ml di media in cui le cellule sono state coltivate per impostare il vuoto (LB o TB). Facoltativamente, utilizzare la cultura rappresentante dal punto 2.1.3 per questo passo, invece. </li><li> Se la cultura non ha ancora raggiunto la OD del caso, tornare al shaker e verificare ancora una volta ogni mezz&#39;ora. Controllare il OD più frequentemente come la A 600 si avvicina a 0,8. </li></ol></li><li> Una volta che la cultura ha raggiunto la fase di log in ritardo, indicato con A 600 = 0,8, in modo asettico trasferire la cultura in provette da centrifuga 50 ml sterili. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione della coltura a 10.000 xg per 10 min. Controllare per un peLLET sul fondo della provetta. </li><li> Decantare il surnatante eliminato in un contenitore per rifiuti biologici appropriata. Non disturbare il pellet. </li><li> Ripetere i passaggi 2,4-2,5 fino a quando tutte le cellule sono state raccolte. </li><li> Risospendere il pellet in 100 ml LB + Amp. Aspirare con una micropipetta o utilizzare un vortex. Per una maggiore produzione Ministring, risospendere il pellet da una cultura Amp 50 ml TB + in 1 ml di fresca mezzi LB + Amp. </li></ol> 3. Ministring Produzione <ol><li> Asetticamente aggiungere 20 ml di LB + Amp in una beuta da 125 ml e di calore a 42 ° C. Per una maggiore produzione Ministring, preparare 500 ml di LB + Amp, preriscaldato a 42 ° C. </li><li> Trasferire la risospensione nel mezzo preriscaldato. </li><li> Incubare a 42 ° C e 250 rpm fino fase di log passato, indicato con A 600 = 1,0. Non lasciare 20 ml di coltura a 42 ° C oltre 1 ora. </li><li> Ridurre la temperatura a 37 ° C e lasciare la coltura di un addizionale 90 min. Per 500 ml, lasciare la cultura per un periodo di induzione supplementare di 90-120 min e non diminuire la temperatura. </li><li> Ridurre la temperatura a 30 ° C e lasciare cultura agitazione a 200 rpm per un ulteriore periodo di temperatura downshift di 2 ore. Per 500 ml, estendere la scalata di temperatura per 4 ore o durante la notte. </li></ol> 4. Ministrings raccolta <ol><li> Asetticamente trasferire la cultura in provette da centrifuga 50 ml sterili. Centrifugare a 10.000 xg per 10 min e controllare un pellet. </li><li> Decantare il surnatante in un contenitore per rifiuti biologici appropriata senza disturbare il pellet. Ripetere fino a quando tutte le cellule sono state raccolte. </li><li> Conservare il pellet per l&#39;estrazione plasmide con qualsiasi estrazione commerciale e kit per la rimozione delle endotossine o congelare il flash in azoto liquido e conservare a -80 ° C per l&#39;estrazione successiva. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Descriviamo qui un sistema semplice per la produzione di ministrings LCC DNA utilizzando un calore inducibile protocollo one-step, che non richiede particolari attrezzature oltre a quello che viene utilizzato nella crescita batterica tipica e manipolazione. ministrings DNA sono stabili, cassette di espressione del DNA lineari senza torsione, prive di elementi genetici procarioti. Essi possono essere utilizzati al posto dei metodi convenzionali per trasferimento genico, espressione di geni reporter, nonché nelle valutazioni verso l&#39;efficienza di espressione del transgene in sistemi eucariotici. ministrings DNA combinano la biocompatibilità e l&#39;aumento dei benefici di efficienza trasfezione di vettori &quot;mini&quot; con il profilo di sicurezza superiore di vettori di DNA lineari. Il nostro robusto un&#39;unica fase nella piattaforma di produzione vivo rapidamente e facilmente produce ministrings DNA per qualsiasi applicazione trasferimento genico senza la necessità di più processi costosi in vitro. Ci sono diversi passaggi critici digarantire una produzione ottimale Ministring (figure 2 e 3). induzione di calore è la fase più critica per Ministring produzione. Completa mancanza di Ministring produzione è molto probabilmente a causa della mancanza di induzione di calore (le cellule conservate a 30 ° C), dove la repressione di espressione protelomerase impedisce la conversione del precursore plasmide per LCC Ministring. A seguito del protocollo di induzione di calore, si aspettano una efficienza di produzione di circa il 75%. induzione di calore è ottimale, mentre le cellule sono in fase di log. Anche se non vi è alcuna differenza statisticamente significativa nella Ministring PE quando si utilizzano le cellule in fase stazionaria ( &quot;Overgrown&quot;, figura 3), abbiamo fatto osservare quasi una diminuzione del 50% nel rendimento complessivo plasmide. I rendimenti dipenderanno dal protocollo di estrazione plasmide usato. Per la produzione ottimale Ministring, innescare induzione di calore mentre le cellule sono in fase di log. produzione Ministring Poor sarà molto probabilmente il risultato di cambio marcia temperatura prolungata o insufficient scalata della temperatura. Passaggio alla marcia superiore della temperatura prolungata è sconsigliato in quanto questo attiva il E. coli risposta allo shock termico 15, che possono inibire l&#39;attività protelomerase e interferire con la stabilità plasmide. Pertanto, i tempi della scalata di temperatura è un altro passo fondamentale per la produzione di Ministring efficiente. Senza tempo di incubazione supplementare a 30 ° C, Ministring efficienza di produzione è risultato essere molto poveri ( &quot;cancellazione anticipata&quot;, figura 3). Ciò può essere attribuito alla quantità di tempo richiesto per l&#39;espressione e l&#39;attività Tel. L&#39;originario profago codifica PY54 Tel protelomerase infetta normalmente Yersinia, che cresce in modo ottimale intorno a 28 ° C 12, indicando che 30 ° C può anche essere più ottimale per l&#39;attività Tel. Il sistema di produzione MINIVECTOR DNA utilizza una piattaforma in vivo per generare alta qualità batteriche minivectors DNA libero-sequenza. Le modifiche al protocollo PossoNCLUDE modifica i terreni di crescita per ottimizzare plasmid e produzione di proteine ​​al fine di promuovere la crescita delle cellule durante la fase di crescita (TB anziché LB), o aumentare MiniString produzione ed efficienza di conversione. Per i volumi più grandi della cultura (200 ml e maggiori), scalata di temperatura e di incubazione a 30 ° C può essere esteso durante la notte senza grave impatto negativo sulla Ministring PE. Abbiamo incluso modifiche nostro protocollo per 500 ml culture come un esempio. Purificazione di ministrings DNA può essere accelerato attraverso in vitro endonucleasi digestione della spina dorsale procariote. Ci sono un certo numero di siti bersaglio di endonucleasi (ad esempio, PI-SCEI, Pvul, SCAI) disponibile sul backbone procariotico del plasmide precursore, che può essere tagliato per esporre lineari estremità aperte, permettendo degradazione in vitro del backbone procariotico. Isolamento di ministrings da altre specie vettore può essere ottenuta anche attraverso la cromatografia a scambio anionico membrana 16. Una limitazione di corrente associata con il sistema produttivo vettoriale LCC DNA è la necessità di purificazione del DNA Ministring da altri prodotti LCC e CCC. Sebbene facilmente purificato utilizzando metodi di isolamento plasmide standard, la fase di isolamento può essere ancora uno svantaggio in un ambiente su larga scala. La separazione del Ministring può richiedere molto tempo utilizzando AGE se il Ministring e la spina dorsale procariote LCC sono troppo simili per dimensioni. In alternativa, l&#39;anione cromatografia a scambio membrana può fornire una migliore separazione dei ministrings da specie CCC vettore 16. Temperatura cambio marcia può essere un altro potenziale limitazione come alte temperature attivano anche la risposta di shock termico in E. coli, che influisce negativamente sulla proteina ricombinante produce 17 e di conseguenza ridurre i tassi di plasmide per Ministring conversione. Riportiamo altrove ottimizzazioni della piattaforma di produzione di aggirare e / o attenuare tali effetti di shock termico 18. Noisono inoltre attualmente ottimizzare i metodi per eliminare o ridurre la contaminazione LCC dorsale procarioti in vivo. l&#39;integrazione cromosomica del DNA Ministring LCC interrompe il cromosoma ospite e sottopone la cellula all&#39;apoptosi. Non solo questo ridurre i potenziali conseguenze negative di mutagenesi inserzionale quali oncogenesi e silenziamento di geni adiacenti, migliorando in tal modo la sua sicurezza; l&#39;effetto letale può anche servire come un metodo ideale per knock-in e studi sostituzione genica senza gli effetti collaterali associati e danni di integrazione. Vettori MiniString DNA può essere applicato verso il trasferimento e l&#39;espressione dei geni per le proteine ​​terapeutiche, RNA, anticorpi o antigeni in un determinato bersaglio in vivo o sostituire un allele funzionale malfunzionamento o non. La semplice calore inducibile in vivo sistema di produzione di uno stadio permette vettori MiniString DNA per produrre facilmente per applicazioni cliniche o industriali.

L&#39;obiettivo è quello di produrre quantità scalabili di lineare covalente chiuso minivectors (LCC) DNA utilizzando un solo passaggio in vivo DNA sistema di produzione Ministring semplice e ad alto rendimento termico-inducibile. ministrings DNA forniscono una strategia sicura ed efficace non virale per fornire DNA. Essi combinano la sicurezza dei vettori LCC con l&#39;efficienza di minicircoli DNA, e offrono anche un&#39;alternativa più sicura per i vettori di virus di derivazione senza compromettere l&#39;efficienza di trasfezione. Affinché un sistema di consegna transgene successo, il vettore DNA deve entrare nella cellula host di destinazione ed esprimere il transgene codifica (s). Ci sono diverse barriere cellulari che devono essere superate nella pratica, soprattutto nei mammiferi. Per evitare la degradazione da nucleasi siero e rilevazione immune sistema reticolo-endoteliale, il vettore di DNA deve essere bio e compatibile immunitario con sistema di destinazione. DNA non protetto è rapidamente digerito da nucleasi plasmae la membrana plasmide è composto di barriere lipoproteine ​​dense così il vettore di DNA deve poter rapidamente attraversare la membrana plasmatica delle cellule bersaglio. Una volta nella cellula, vettori devono attraversare citoplasma e passare attraverso la membrana nucleare per inserire il nucleo di espressione del transgene. le tecniche di trasferimento dei geni non virali si concentrano sulla valorizzazione del tessuto-e cellule-targeting. Tuttavia, l&#39;uso di plasmidi convenzionali con queste tecniche riduce l&#39;efficienza di trasfezione per la presenza di sequenze batteriche immunogenici, che fa tacere rapidamente l&#39;espressione genica 1,2. plasmidi convenzionali tipicamente portano geni resistenti agli antibiotici per la manutenzione in sistemi procarioti. Tuttavia, questi possono produrre effetti potenzialmente negativi per ospiti umani oa conferire resistenza alla naturale flora host tramite effetti trasferimento genico orizzontale. Plasmidi convenzionali contengono anche dinucleotide CpG motivi 2, che può innescare una risposta immunostimolante indesiderata, potenzialmenteridurre o tacere espressione del transgene. Come si comprendono solo della cassetta di espressione eucariotica, minivectors DNA, come minicircoli DNA 3, sono una migliore alternativa per la consegna del gene in quanto presentano migliorate biodisponibilità extracellulare e intracellulare e una migliore espressione genica causa delle loro dimensioni ridotte e l&#39;assenza di elementi procariote immunostimolante 4. Le dimensioni ridotte tariffe vettore migliori rispetto alla resistenza alle forze di taglio associate alla somministrazione in vivo di un sito di destinazione 5. Il numero di copie superiore del vettore per unità di massa richiede meno reagente di trasfezione, diminuendo così la tossicità. Tuttavia, nel caso di integrazione vettore casuale in un cromosoma ospite, circolarmente covalentemente chiuso vettori (CCC), inclusi sia minicircoli DNA e plasmidi convenzionali, conferire continuità molecolare e quindi può portare a mutagenesi inserzionale, che può avere conseguenze devastanti <sup&gt; 6. Comparativamente, l&#39;integrazione di un vettore di DNA lineare interrompe il cromosoma e avvia percorsi di morte cellulare, eliminando così la cellula mutante dalla popolazione di cellule proliferanti e prevenire mutagenesi inserzionale 7. Minimalista espressione genica immunologicamente definito (MIDGE) Vettori 8 e vettori micro-lineare 9 (MiLV) sono vettori LCC DNA sviluppati in vitro. Vettori Midge hanno mostrato fino ad un 17-fold migliorato l&#39;espressione del transgene in vivo rispetto al DNA plasmide convenzionale vettori 11, e hanno dimostrato risultati promettenti in vaccino 10 e il cancro 8 terapia genica. Inoltre, a causa della struttura senza torsione del MINIVECTOR LCC, meno reagente di trasfezione è necessaria rispetto alla controparte CCC supercoiled, riducendo così la tossicità 7. Le nostre avanzate vettori LCC DNA, ministrings DNA, hanno dimostrato l&#39;efficienza espressione superiore e bioavailabilità 7. Inoltre, ministrings DNA sono prodotti su un vivo sistema di produzione di uno stadio di calore-inducibile in, un espediente e conveniente alternativa al Midge e MiLV LCC vettori, che richiedono più passaggi in vitro. Il sistema di produzione Ministring DNA da dimostrare è un semplice processo di calore-inducibile eseguiti in vivo, il che rende sia conveniente e facilmente scalabile. Questo sistema sfrutta la Yersinia enterocolitica batteriofago Tel / PAL PY54-derivato sistema ricombinazione 12 protelomerase per separare il minimo cassetta di espressione eucariotica dalla spina dorsale plasmide procariote. Abbiamo progettato Escherichia coli (W3NN) per esprimere Tel protelomerase sotto il controllo del calore-inducibile batteriofago λ promotore, cI [Ts] 857 13. Al espressione, Tel protelomerase agisce sui siti di destinazione PAL presenti all&#39;interno di &quot;Super Sequence&quot; (SS) siti situati sul plasmide precursoreper produrre prodotti LCC, da cui il Ministring DNA può essere purificato (Figura 1). I siti SS sul plasmide DNA Ministring precursore codificare anche siti bersaglio per altre ricombinasi tra cui Cre ricombinasi (LOX), TELN protelomerase (telRL) e Flp ricombinasi (FRT), facilitando in tal modo la produzione di LCC isogenico e minivectors CCC da un plasmide precursore. Inoltre, ogni sito SS è affiancato su entrambi i lati da SV40 enhancer sequenze (SV40e), che servono a migliorare la traslocazione nucleare 14. Abbiamo dimostrato altrove che successiva aggiunta di SV40e conferisce progressivamente corrispondente aumento di efficienza di trasfezione 7. Il plasmide precursore (pDNA MiniString o PDMS) contiene un polylinker (Figura 1) per facilitare l&#39;inserimento di qualsiasi gene di interesse desiderato in fusione trascrizionale con il reporter fluorescente verde (GFP). La tecnologia MINIVECTOR DNA puòessere utilizzata al posto di metodi convenzionali per trasferimento genico, espressione di geni reporter, e le valutazioni verso l&#39;efficienza di espressione del transgene in sistemi eucariotici. ministrings DNA combinano la biocompatibilità e l&#39;aumento dei benefici di efficienza trasfezione di vettori &quot;mini&quot; con il profilo di sicurezza superiore di vettori di DNA lineari. La nostra solida piattaforma di produzione di uno stadio rapidamente e facilmente produce ministrings DNA per qualsiasi applicazione trasferimento genico e offre un profilo di sicurezza più elevato.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

Abbiamo costruito lineari covalente chiusi minivectors (LCC) del DNA come un non-virale gene-delivery vettore alternativo prodotto tramite una semplice piattaforma in vivo. Ministrings DNA possiedono un profilo di sicurezza intensificata e anche fornire in modo efficiente il carico del DNA di cellule bersaglio. vettori di DNA convenzionali portano sequenze procariote indesiderati, tra cui geni di resistenza agli antibiotici, motivi CpG, e le origini di replicazione batteriche, che possono portare alla stimolazione della risposta immunitaria dell&#39;ospite. La biodisponibilità di vettori di DNA convenzionali è anche compromessa a causa della loro dimensione molecolare maggiore. La loro natura circolare può anche impartire l&#39;integrazione cromosomica, che porta alla mutagenesi inserzionale. sequenze batteriche sono asportati dal minivectors DNA, lasciando solo il gene di interesse (GOI) e necessari elementi di espressione eucariotiche. I nostri minivectors LCC DNA, o ministrings DNA, sono privi di sequenze batteriche immunogeniche; migliorando quindi esimobiodisponibilità EIR ed espressione GOI. Nel caso di vettori integranti nel cromosoma, il Ministring LCC DNA lethally perturbare cromosoma ospite, eliminando così il mutante potenzialmente pericolosa dalla popolazione di cellule proliferanti. Di conseguenza, ministrings DNA offrono i vantaggi di DNA &#39;minicircolo&#39;, eliminando il rischio di eventi di integrazione vettore indesiderati. In confronto ai plasmidi convenzionali e le loro controparti in modo covalente chiusi isogenici circolari (CCC), ministrings DNA dimostrano biodisponibilità superiore, l&#39;efficienza di trasfezione, e la cinetica citoplasmatici - che quindi richiedono minori quantità di tensioattivi cationici per un&#39;efficace trasfezione di cellule bersaglio. Abbiamo costruito un solo passaggio inducibile sistema vivo per la produzione di ministrings DNA in Escherichia coli che è semplice da utilizzare, rapida e scalabile.

Dopo l&#39;estrazione del DNA, il plasmide precursore residuo, LCC spina dorsale procariote, e il Ministring DNA sarà recuperato. resa plasmide complesso e la purezza possono essere valutati utilizzando uno spettrofotometro. Purezza è stimato utilizzando il rapporto tra l&#39;assorbanza a 260 nm e 280 nm (A260 / A280), dove un rapporto di 1.9-2.0 è ottimale. Tutti i prodotti LCC e CCC possono essere separati mediante elettroforesi su gel di agarosio (AGE) (Figura 2). AGE visualizza i risultati di Ministring produzione dopo l&#39;induzione di calore, prima di Ministring purificazione. Una valutazione qualitativa della produzione MiniString può essere effettuato in questa fase confrontando intensità della banda del Ministring (2.4 kb) al plasmide genitore (5,6 kb) (Figura 2). Ministring DNA può essere recuperato mediante protocolli di estrazione gel plasmide standard di seguito l&#39;età. La figura 3 riassume Ministring efficienze produttive in varie condizioni che possono verificarsi durante il trasportoing fuori del protocollo. Ministring efficienza di produzione è stato determinato sulla base di intensità della banda del DNA utilizzando il programma di analisi del produttore. Qualsiasi programma di densitometria simile può essere utilizzato per analizzare i risultati di età. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Panoramica di Ministring produzione (A) Il vettore principale contiene un polylinker in fusione trascrizionale con un gene reporter, incorniciato da due siti SS. La spina dorsale codifica di beta-lattamasi per la resistenza ampicillina e contiene anche diversi siti di taglio uniche per la spina dorsale per la digestione in vitro. (B) Panoramica del protocollo principale. Procedura 2) fase di crescita e 3) Ministring Produzione sono rappresentati in un diagramma di fornire uno schema generale delle fasi coinvolte, evidenziando la semplicità del protocollo. Induzione (C) Ministring. Induzione di calore inattiva il repressore sensibile alla temperatura, consentendo l&#39;espressione tel seguita da attività di Tel sui siti delle SS nei plasmidi genitore. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figura 2: Ministring produzione dopo deviazioni dal protocollo. 1: Controllo, 2: non indotte, 3: Coperto di vegetazione, 4: Overinduced, 5: rimozione precoce. Ministring DNA è di circa 2,4 kb, LCC spina dorsale è di 3 kb, e pNN9 plasmide genitore è di 5,6 kb. intensità della banda delle bande MiniString e LCC backbone cadere con deviazioni dal protocollo, indicando in basso rendimento Ministring. Da sinistra a destra: 1 kb scaletta dal New England Biolabs; Controllo, seguendo il protocollo; Non indotte, nessun cambio marcia di temperatura; Coperto di vegetazione, temperatura di cambio marcia During fase stazionaria; Overinduced, passaggio alla marcia superiore di temperatura esteso; rimozione precoce, senza scalata temperatura. I plasmidi sono stati estratti utilizzando il kit di Omega-Biotek EZNA plasmidi Mini. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3:. Effetti di deviazioni dal protocollo sulla Ministring efficienza produttiva (PE) I risultati sono la media di 3 prove. PE stimato in base a intensità della banda relativa misurata utilizzando AlphaImager HP dopo l&#39;età. Le deviazioni si verificano le seguenti operazioni: controllo, a seguito del protocollo; Non indotte, nessun cambio marcia la temperatura al punto 2; Coperto di vegetazione, cambio marcia temperatura ha cominciato durante la fase stazionaria al punto 1.6; Overinduced, cambio marcia temperatura esteso al punto 2.3; rimozione precoce, le cellule rimosso ed estrattosenza scalata temperatura alla fase 2.3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

La produzione di DNA a doppia elica Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K Views.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Video: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Ricerca

Genetica

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Svolgimento del DNA mediato da CMG osservato dalla crescita del tratto ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Svelare le dinamiche della replicazione del DNA eucariotico attraverso la visualizzazione di una singola molecola

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Biochimica

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

La forca di replicazione del DNA

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

Didattica

JoVE Core

Biologia Molecolare

Unità 1

DNA Replication

TERMINI E CONCETTI CHIAVE

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

Replicazione nei procarioti

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Cell Biology

Unit 1

DNA Replication and Repair

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

Riparazione delle rotture a doppio filamento

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

DNA Riparazione e Ricombinazione

The Replisome

DNA replication is carried out by a large complex of proteins that act in a coordinated matter to achieve high-fidelity DNA replication. Together this complex is known as the DNA replication machinery or the replisome.
The synthesis of the leading and lagging strands is a highly coordinated process. To explain this, the &#8220;Trombone model&#8221; was proposed by Bruce Alberts in 1980. The DNA loop formation starts when a primer is synthesized on the parent lagging strand. The loop grows with the synthesis of an Okazaki fragment and finally dissolves when synthesis of the fragment ends. The DNA polymerase then attaches to another primer and the whole cycle, from loop formation to collapse, is repeated. The replisome allows all of the activities to be coordinated as a replication machinery complex.
Replisome components
Helicases unwind and separate double-stranded DNA.&#160; These enzymes are present as a single hexamer ring in prokaryotes and as a double hexamer ring in eukaryotes. Eukaryotic helicases depend on additional proteins, Cdc45 and GINS, to function.&#160; Single-stranded DNA binding (SSB) proteins keep the DNA strands from reannealing.&#160; In prokaryotes, SSBs consist of a single subunit, whereas in eukaryotes, they are a heterotrimeric protein known as replication protein A (RPA).
Primase adds an RNA primer to where DNA synthesis will originate.&#160; In prokaryotes, primase is present as a single subunit enzyme called DnaG, which synthesizes an RNA primer of around 12 nucleotides.&#160; In eukaryotes, a multisubunit enzyme, DNA polymerase-&#945; primase, synthesizes an RNA-DNA hybrid primer of around 25 nucleotides. In addition to polymerase-&#945;, replicative polymerase will extend the newly synthesized DNA. While a single type of replicative polymerase, DNA polymerase III, is present in prokaryotes, two different types of replicative polymerases, Pol &#949; and Pol &#948;, are present in eukaryotes, for leading strand and lagging strand synthesis, respectively.&#160;
Sliding Clamp proteins keep the polymerases attached to the DNA template. &#160;&#946;-clamp, a homodimeric protein, acts as the clamp in prokaryotes. In eukaryotes, the same task is performed by proliferating cell nuclear antigen (PCNA), a homotrimeric protein. The central pore of the sliding clamp is positively charged, which enables it to have electrostatic interactions with the negatively charged phosphate backbone of the DNA. The clamp is attached to the DNA by a Clamp Loader. These pentameric proteins belong to the AAA+ class of ATPases. The eukaryotic clamp loader is known as replication factor C, while the prokaryotic E. coli clamp loader is known as the &#947; complex; however, the clamp proteins and clamp loaders are thought to be evolutionary homologs unlike many other components of the replisome.

The Replisome Components and the Trombone Model

Il replisoma

DNA replication is carried out by a large complex of proteins that act in a coordinated matter to achieve high-fidelity DNA replication. Together this ...

La produzione di DNA a doppia elica Ministrings

Riepilogo

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Capitoli in questo video

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

La forca di replicazione del DNA

Replicazione nei procarioti

Riparazione delle rotture a doppio filamento

Il replisoma