Os autores agradecem as Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) pelo financiamento deste trabalho.

1. Preparação de Mídia e Cultura <ol><li> Para LB + Amp: Preparar 500 ml de meio Luria-Bertani (LB) esterilizado utilizando um autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento com ampicilina para se obter uma concentração final de 100 ug / ml de ampicilina e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Para TB + Amp: Prepare-se para grandes (500 ml ou superior) volumes de ministring produção. Preparar 600 ml de solução estéril de Terrific Broth (TB) esterilizado utilizando um autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento com ampicilina para se obter uma concentração final de 100 ug / ml de ampicilina e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Para agar LB + Amp: Preparar placas de agar LB estéril através da preparação de LB + Amp suplementado com 15 g / L de agar. Alíquotas de aproximadamente 15 - 20 ml em placas de Petri estéreis e armazenamento de cabeça para baixo a 4 ° C até serem necessárias. </li><li> Prepare um prato raia de W3NN [PDMS], assepticamente, estrias W3NN [PDMS] células em LB agar + Amp. Incubar a placa overnight a 30 ° C, até que colónias individuais podem ser observadas. Não incube W3NN acima dessa temperatura para evitar derepressing expressão protelomerase. </li><li> Transfira assepticamente 5 ml de LB + Amp num tubo de ensaio estéril. Prepare uma cultura durante a noite de W3NN [PDMS] inoculando este volume com uma única colónia da placa de raia. Incubar durante a noite a cultura a 30 ° C num agitador a 230-250 rpm. </li></ol> 2. Fase de crescimento <ol><li> Transferir assepticamente 10 ml de LB + Amp num estéril de 125 ml e inocular balão de Erlenmeyer com 100 ul da cultura da noite W3NN [PDMS] no preparado de LB + Amp, fazendo uma diluição de 1: 100. <ol><li> Para volumes maiores, adicionar 500 mL de cultura durante a noite em 50 ml de TB + Amp num balão de Erlenmeyer de 250 ml, em vez de LB + Amp. </li><li> Em alternativa, utilizar como segunda cultura &quot;representante&quot; no passo 2.2. </li></ol></li><li> Incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C e 250 rpm até que a cultura atinge a fase mid log tardia, indicada por uma densidade óptica (OD) ou absorvância: A 600 = 0,8. Após 1-2 hr, a forma deve começar a aparecer turvação a olho nu. <ol><li> Transfira assepticamente 1 ml de cultura em uma tina espectrofotômetro limpo. </li><li> Medir a absorvância de luz, utilizando um espectrofotómetro de UV-vis com o comprimento de onda ajustado para 600 nm. Use 1 ml dos meios de comunicação no qual as células foram cultivadas para definir o espaço em branco (LB ou TB). Opcionalmente, utilizar a cultura representativa a partir do passo 2.1.3 para este passo em vez disso. </li><li> Se a cultura ainda não atingiu o OD apropriado, retornar ao agitador e verificar mais uma vez a cada meia hora. Verifique a OD com mais frequência como o A 600 se aproxima de 0,8. </li></ol></li><li> Uma vez que a cultura atingiu a fase logarítmica tardia, indicado por A 600 = 0,8, Transferir assepticamente a cultura em 50 ml estéreis, tubos de centrífuga. </li><li> Recolher as células por centrifugação da cultura a 10000 xg durante 10 min. Verifique se há um epllet na parte inferior do tubo. </li><li> Decantar o sobrenadante clarificado para um recipiente de resíduos de risco biológico apropriado. Não perturbe o pellet celular. </li><li> Repita os passos de 2,4-2,5 até que todas as células foram recolhidas. </li><li> Re-suspender o sedimento em 100 mL de LB + Amp. Aspirar utilizando uma micropipeta ou usar um misturador de vórtice. Para uma maior produção ministring, re-suspender o pellet a partir de uma TB 50 ml + cultura Amp em 1 ml de meio LB + Amp fresco. </li></ol> 3. Ministring Produção <ol><li> Assepticamente adicionar 20 ml de LB + Amp num balão de Erlenmeyer de 125 ml e de calor a 42 ° C. Para uma maior produção ministring, preparar 500 ml de LB + Amp, pré-aquecido a 42 ° C. </li><li> Transferir a ressuspensão em meio pré-aquecido. </li><li> Incubar a 42 ° C e 250 rpm até a fase logarítmica passado, indicado por A 600 = 1,0. Não deixar 20 ml de cultura a 42 ° C após 1 hora. </li><li> Reduzir a temperatura a 37 ° C e deixar a cultura para um adicional 90 min. Para 500 ml, deixar a cultura durante um período de indução adicional de 90-120 min e não diminuir a temperatura. </li><li> Reduzir a temperatura a 30 ° C e deixar a cultura sob agitação a 200 rpm durante um período de temperatura de redução de marcha adicional de 2 h. Por 500 ml, estender a redução de marcha temperatura para 4 horas ou durante a noite. </li></ol> 4. Ministrings Colhendo <ol><li> Transferir assepticamente a cultura em estéreis 50 ml tubos de centrífuga. Centrifugar a 10.000 xg por 10 min e inspecionar para uma pelota. </li><li> Decantar o sobrenadante para um recipiente de resíduos de risco biológico apropriada sem perturbar o sedimento. Repetir até que todas as células foram recolhidas. </li><li> Manter a pelota para a extração de plasmídeo com qualquer extração comercial e kit de remoção de endotoxina ou congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C para posterior extração. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos aqui um sistema simples para a produção de ADN ministrings LCC utilizando um protocolo induzida pelo calor de um passo, o qual não requer nenhum equipamento especial para além de que o que é utilizado no crescimento bacteriano típico e manipulação. ministrings DNA são, cassetes lineares estáveis ​​livre de torção de expressão de ADN, desprovido de elementos genéticos procariotas. Eles podem ser utilizados em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, bem como nas avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de &quot;mini&quot; vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. A nossa robusta de um só passo em plataforma de produção in vivo de forma rápida e facilmente produz ministrings ADN para qualquer aplicação de transferência de genes, sem a necessidade de múltiplos processos dispendiosos in vitro. Há vários passos críticos paragarantir a produção ministring ideal (Figuras 2 e 3). indução de calor é a etapa mais importante para a produção ministring. Ministring completa falta de produção é muito provavelmente devido à falta de indução de calor (células retidos a 30 ° C), em que a repressão da expressão protelomerase impede a conversão do plasmídeo precursor para ministring LCC. Seguindo o protocolo de indução de calor, esperar uma eficiência de produção de aproximadamente 75%. indução de calor é optimizada, enquanto as células estão na fase log. Embora não haja nenhuma diferença estatisticamente significativa na ministring PE ao utilizar células em fase estacionária ( &quot;Overgrown&quot;, Figura 3), fizemos observar quase uma diminuição de 50% no rendimento global plasmídeo. Os rendimentos vão depender do protocolo de extracção de plasmídeo utilizado. Para a produção ministring ideal, desencadear indução de calor, enquanto as células estão em fase de registro. produção ministring pobres provavelmente será resultado de upshift temperatura prolongada ou insufficient downshift temperatura. Prolongada upshift temperatura é desencorajado, pois isso ativa a E. resposta de choque de calor coli 15, que pode inibir a actividade protelomerase e interferir com a estabilidade do plasmídeo. Portanto, cronometrando o downshift temperatura é mais um passo crítico para a produção ministring eficiente. Sem tempo de incubação adicional a 30 ° C, ministring eficiência de produção verificou-se ser muito baixa ( &quot;remoção precoce&quot;, Figura 3). Isto pode ser atribuído ao período de tempo necessário para a expressão e a actividade Tel. A originários profago PY54 codificação Tel protelomerase normalmente infecta Yersinia, que cresce optimamente cerca de 28 ° C 12, indicando que a 30 ° C também podem ser mais óptimo para a actividade Tel. O sistema de produção DNA minivector utiliza uma plataforma in vivo para gerar alta qualidade minivectors ADN livre de sequências bacterianas. Modificações para o protocolo pode include alterando os meios de crescimento para optimizar plasmídeo e produção de proteína, a fim de promover o crescimento de células durante a fase de crescimento (em vez de TB LB), ou aumentar ministring produção e eficiência de conversão. Para volumes maiores de cultura (200 ml e maiores), downshift temperatura e incubação a 30 ° C pode ser alargado durante a noite, sem impacto negativo severo sobre ministring PE. Nós incluímos modificações em nosso protocolo para 500 ml culturas como um exemplo. A purificação do ADN ministrings pode ser acelerada através de digestão in vitro de endonuclease da espinha dorsal procariótica. Há um número de locais-alvo da endonuclease de (por exemplo, PI-Scel, Pvul, ScaI) disponível na espinha dorsal do plasmídeo procariótica precursor, o qual pode ser cortado para expor linear extremidades abertas, para permitir que a degradação in vitro de a espinha dorsal procariótica. Isolamento de ministrings a partir de outras espécies de vectores pode também ser alcançada através de cromatograf ia de membrana de permuta aniónica 16. Uma limitação de corrente associado com o sistema de produção de vector de ADN LCC é a necessidade de purificação do DNA a partir de ministring outros produtos LCC e CCC. Embora facilmente purificado utilizando métodos de isolamento de plasmídeo padrão, o passo de isolamento pode ainda ser uma desvantagem numa configuração em larga escala. Separação do ministring pode ser usando idade, se o ministring e a espinha dorsal procariótica LCC são muito semelhantes em tamanho demorado. Alternativamente, a cromatografia de membrana de troca aniônica podem proporcionar uma melhor separação de ministrings a partir de espécies CCC vetor 16. Temperatura upshift pode ser outra limitação potencial como altas temperaturas também ativar a resposta ao choque térmico em E. coli, que afeta negativamente a proteína recombinante produz 17 e, consequentemente, reduzir as taxas de plasmídeo para ministring conversão. Nós relatamos em outros lugares otimizações da plataforma de produção para contornar e / ou mitigar esses efeitos de choque térmico 18. NósTambém estão otimizando os métodos actualmente para eliminar ou reduzir a contaminação LCC backbone procariotas in vivo. integração cromossómica do ADN ministring LCC perturba o cromossoma do hospedeiro e sujeita a célula a apoptose. Isto não só reduzir potenciais consequências negativas da mutagénese de inserção, tais como oncogênese e silenciamento de genes adjacentes, melhorando assim a sua segurança; o efeito letal pode também servir como um método ideal para a knock-in e estudos de substituição de genes, sem os efeitos colaterais associados e danos de integração. Os vectores de ADN ministring pode ser aplicado para a transferência e expressão de genes para proteínas terapêuticas, ARN, anticorpos ou antigénios num dado alvo in vivo ou substituir um alelo funcional inadequadamente ou não. O calor indutível-in vivo sistema simples de uma etapa de produção permite vectores de ADN ministring para ser facilmente produzidas para aplicações clínicas ou industriais.

O objetivo é produzir quantidades escaláveis ​​de linear covalentemente fechada minivectors (LCC) de ADN usando uma uma etapa in vivo DNA sistema de produção ministring induzida pelo calor da eficiência simples e alta. ministrings ADN fornecer uma estratégia não virai seguro e eficaz para entregar ADN. Elas combinam a segurança dos vectores LCC com a eficiência de minicirculos de ADN, e também oferecer uma alternativa mais segura para os vectores derivados de vírus sem comprometer a eficiência da transfecção. Para que um sistema de fornecimento de transgene a ser bem sucedida, o vector de ADN deve entrar na célula hospedeira alvo e expressam o transgene (s) codificados. Existem várias barreiras celulares que precisam de ser ultrapassados ​​na prática, particularmente em sistemas de mamíferos. A fim de evitar a degradação pelas nucleases do soro e detecção imunológica pelo sistema reticulo-endotelial, o vector de ADN devem ser bio- e imuno-compatível com o sistema de destino. DNA desprotegido é rapidamente digerido por nucleases de plasmae a membrana de plasmídeo é composto de barreiras de lipoproteínas densos de modo que o vector de ADN deve ser capaz de atravessar rapidamente a membrana plasmática das células alvo. Uma vez na célula, os vectores têm de atravessar o citoplasma e passar através da membrana nuclear para o núcleo para introduzir a expressão do transgene. técnicas de entrega de genes não virais concentrar no reforço da Tecido e célula-alvo. No entanto, a utilização de plasmídeos com estas técnicas convencionais reduz a eficiência da transfecção, devido à presença de sequências bacterianas imunogénicas, que silencia a expressão do gene rapidamente 1,2. plasmídeos convencionais normalmente carregam genes de resistência a antibióticos para manutenção em sistemas procariotas. No entanto, estes podem produzir efeitos adversos potenciais em hospedeiros humanos, a conferir resistência à ocorrência natural flora hospedeiras através de efeitos transferência horizontal de genes. Plasmídeos convencionais também contêm motivos dinucleótido CpG 2, o que pode desencadear uma resposta imunoestimuladora não desejada, potencialmentereduzir ou silenciar a expressão do transgene. Como eles são unicamente composta de a cassete de expressão eucariótica, minivectors ADN, tais como minicirculos de ADN 3, são a melhor alternativa para a entrega de genes que exibam uma biodisponibilidade melhorada extracelular e intracelular e expressão melhorada do gene devido ao seu tamanho reduzido e ausência de elementos procarióticas imunoestimuladores 4. As tarifas reduzidas tamanhos vector melhores no que diz respeito a resistência a forças de corte associadas com a administração in vivo a um local alvo 5. O maior número de cópias do vector por unidade de massa requer menos reagente de transfecção, diminuindo assim a toxicidade. No entanto, no caso de vector de integração aleatória num cromossoma do hospedeiro, circular covalentemente fechada (CCC) vectores, incluindo ambos os minicirculos de DNA e plasmídeos convencionais, conferir continuidade molecular e, por conseguinte, pode levar à mutagénese de inserção, que pode ter consequências devastadoras <s-se&gt; 6. Comparativamente, a integração de um vector de DNA linear interrompe o cromossoma e inicia percursos de morte celular, removendo assim a célula mutante a partir da população de células a proliferar e prevenção mutagénese de inserção 7. Vetores minimalistas expressão de genes imunologicamente definido (MIDGE) 8 e vetores micro-linear 9 (MiLV) são vectores de DNA LCC desenvolvidos in vitro. Vetores Midge exibiram até 17 vezes melhorada expressão do transgene in vivo em comparação com DNA plasmídeo convencional vetores 11, e têm demonstrado resultados promissores em terapia genética vacina 10 e câncer 8. Além disso, devido à estrutura livre de torção da minivector LCC, menos reagente de transfecção é necessário, em comparação com o homólogo CCC super-enrolado, reduzindo assim a toxicidade 7. Nossos vectores de DNA LCC avançados, ministrings DNA, demonstraram a eficiência expressão superior e bioavailabilidade 7. Além disso, ministrings de DNA são produzidos em um sistema de produção in vivo induzida pelo calor de um passo, uma alternativa conveniente e de baixo custo aos vectores MIDGE e MiLV LCC, que requerem etapas múltiplas in vitro. O sistema de produção ministring DNA a ser demonstrado é um processo termo-inducible simples realizado in vivo, tornando-a eficaz e facilmente escalável. Este sistema explora a Yersinia enterocolitica bacteriófago derivada-PY54 Tel / PAL protelomerase sistema de recombinação 12 para separar a cassete de expressão eucariótica mínima a partir da estrutura do plasmideo procariótica. Temos engenharia Escherichia coli (W3NN) para expressar Tel protelomerase sob o controle do promotor do bacteriófago λ induzida pelo calor, cl [TS] 857 13. Após expressão, Tel protelomerase age em locais-alvo pal presente dentro de &quot;Super Sequence&quot; (SS) sítios localizados no plasmídeo precursorpara produzir produtos LCC, a partir do qual o ministring ADN pode então ser purificado (Figura 1). Os locais de SS no plasmídeo de ADN ministring precursor também codificam locais alvo para outras recombinases incluindo a recombinase Cre (LOX), TELN protelomerase (telRL) e Flp recombinase (FRT), facilitando assim a produção de LCC isogénico e minivectors CCC a partir de um plasmídeo precursor. Além disso, cada sítio SS é flanqueado em ambos os lados por sequências de SV40 (SV40e), que servem para melhorar a translocação nuclear 14. Nós demonstramos noutro local que a adição sucessiva de SV40e confere progressivamente aumentos correspondentes na eficiência de transfecção 7. O plasmídeo precursor (pADN MiniString ou PDMS) contém um poli-ligante (Figura 1) para facilitar a inserção de qualquer gene desejado de interesse em fusão transcricional com o repórter fluorescente verde (GFP). A tecnologia de DNA minivector podeser utilizado em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, e as avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de &quot;mini&quot; vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. Nossa plataforma robusta de produção de uma etapa rápida e facilmente produz ministrings de DNA para qualquer aplicação de transferência de genes e oferece um perfil de segurança mais elevado.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

Construiu-lineares fechados covalentemente minivectors (LCC) de ADN como uma alternativa vetor de administração de genes não virais produzidas através de uma plataforma simples in vivo. Ministrings ADN possuem um perfil de segurança elevado e também produzir com eficiência de carga de ADN para células alvo. vectores de ADN convencionais transportar sequências procarióticas indesejáveis, incluindo os genes de resistência a antibióticos, motivos de CpG, e as origens bacterianas de replicação, o que pode levar à estimulação de respostas imunológicas do hospedeiro. A biodisponibilidade de vectores de ADN convencionais também está comprometida devido ao seu tamanho molecular maior. A sua natureza circular também pode conferir a integração cromossômica, levando a mutagénese de inserção. sequências bacterianas são excisadas do ADN minivectors, deixando apenas o gene de interesse (GOI) e necessários elementos de expressão eucarióticos. Nossos minivectors DNA LCC, ou ministrings DNA, são desprovidos de sequências bacterianas imunogénicas; melhorando assim thbiodisponibilidade EIR e expressão GOI. No caso do vector de integração no cromossoma, o ADN ministring LCC letalmente vai perturbar o cromossoma do hospedeiro, removendo desse modo o mutante potencialmente perigosos a partir da população de células em proliferação. Consequentemente, ministrings ADN proporcionam os benefícios de ADN &#39;minicrculo&#39; enquanto elimina o potencial para eventos de integração vector indesejáveis. Em comparação com os plasmídeos e os seus homólogos convencionais (CCC) isogénicas circular covalentemente fechado, ADN ministrings demonstrar biodisponibilidade superior, a eficiência de transfecção, e a cinética citoplasmáticos - se, assim, necessitam de quantidades inferiores de agentes tensioactivos catiónicos para a transfecção eficaz das células alvo. Construímos um um passo indutível sistema in vivo para a produção de ministrings ADN em Escherichia coli, que é simples de utilizar, rápido, e escalável.

Após a extracção do ADN, plasmídeo precursor residual, LCC procariótica espinha dorsal, e o ADN ministring vai ser recuperado. rendimento plasmídeo geral e pureza pode ser avaliada utilizando um espectrofotómetro. A pureza é estimada utilizando a razão da absorvância a 260 nm e 280 nm (A260 / A280), em que uma proporção de 1,9-2,0 é óptima. Todos os produtos LCC e CCC podem ser separados através de electroforese em gel de agarose (AGE) (Figura 2). AGE visualiza os resultados de ministring produção após a indução de calor, antes ministring purificação. Uma avaliação qualitativa da produção ministring podem ser feitas nesta fase através da comparação da intensidade da banda de ministring (2,4 kb) para o plasmídeo progenitor (5,6 kb) (Figura 2). DNA Ministring podem ser recuperados através de protocolos de extração de gel plasmídeo padrão seguintes AGE. Figura 3 resume ministring eficiências de produção sob várias condições que possam ocorrer enquanto carrying fora do protocolo. Ministring eficiência da produção foi determinada com base na intensidade da banda DNA usando o programa de análise do fabricante. Qualquer programa de densitometria semelhante pode ser usada para analisar os resultados de idade. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Visão de ministring produção (A) O vector pai contém um poliligante na fusão transcricional com um gene repórter, emoldurado pelos dois locais da SS. A espinha dorsal codifica beta-lactamase para a resistência à ampicilina e também contém vários locais únicos para cortar a espinha dorsal de digestão in vitro. (B) Visão geral do protocolo principal. Passos 2) fase de crescimento e 3) Ministring produção são representados num diagrama para fornecer um esquema geral dos passos envolvidos, destacando a simplicidade do protocolo. Indução (C) Ministring. Indução de calor inactiva o repressor sensível à temperatura, permitindo a expressão tel seguido pela atividade Tel em sites da SS nos plasmídeos pais. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figura 2: Ministring produção após desvios de protocolo. 1: Controle, 2: não induzido, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: remoção precoce. ministring DNA é de aproximadamente 2,4 kb, LCC backbone é de 3 kb, e pNN9 plasmídeo pai é de 5,6 kb. intensidade da banda de ministring e backbone LCC bandas cair com desvios do protocolo, indicando menor rendimento ministring. Da esquerda para a direita: 1 kb escada de New England Biolabs; Controle, seguindo o protocolo; Não induzidas, nenhuma mudança acima da temperatura; Repleto de Vegetação, temperatura upshift during fase estacionária; Overinduced, upshift temperatura ampliada; remoção precoce, sem redução de marcha temperatura. Os plasmídeos foram extraídos utilizando o Kit Omega-Biotek EZNA plasmídeo Mini. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3:. Efeitos de desvios de protocolo sobre a eficiência da produção ministring (PE) Os resultados são a média de 3 ensaios. PE é estimado a partir intensidade da banda relativa medida usando AlphaImager HP após a AGE. Os desvios ocorrem nas seguintes etapas: controle, seguindo o protocolo; Não induzidas, sem troca de marcha temperatura no passo 2; Repleto de Vegetação, upshift temperatura começou durante a fase estacionária no passo 1,6; Overinduced, upshift temperatura estendida no passo 2.3; remoção precoce, as células removida e extraídasem redução de marcha temperatura no passo 2.3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

Produção de Double-stranded DNA Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K visualizações.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Vídeo: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

<meta charset="utf8"></head><body>Cortinas de DNA lançam luz sobre sistemas moleculares complexos durante a recombinação homóloga

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Cortinas de DNA lançam luz sobre sistemas moleculares complexos durante a recombinação homóloga

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genética

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Desenrolamento de DNA mediado por CMG observado pelo crescimento do trato ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a dinâmica da replicação do DNA eucariótico por meio da visualização de uma única molécula

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Bioquímica

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

A forquilha de replicação do DNA

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

Education

JoVE Core

Biologia Molecular

Unidade 1

Replicação do DNA

TERMOS E CONCEITOS CHAVE

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

Reparando Quebras de Fita dupla

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

Reparo e Recombinação de DNA

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

Replicação em Procariontes

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Produção de Double-stranded DNA Ministrings

Resumo

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Cortinas de DNA lançam luz sobre sistemas moleculares complexos durante a recombinação homóloga

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Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

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