We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

Hücreler ve Reaktiflerin hazırlanması 1. <ol><li> % 100 konfluansa - bir gün önce, söz konusu virüs için tahlil, levha, uygun konakçı hücrelerde (Tablo 1 ve 2) kullanılarak, 90 için. </li><li> DH 2 O% 10 formaldehit tespit solüsyonu hazırlayın Örnekte, 14.44 ml damıtılmış H2O (DH 2 O) ile% 36 stok formaldehid 5.56 ml karıştırın. NOT: Uygun güvenli kullanım uygulamaları ve havalandırma formaldehit kullanılarak. </li><li> Kristal mor leke hazırlayın:% 1 Crystal Violet (CV)% 20 etanol ve dH 2 O </li><li> 2x plak ortam (2x konsantrasyonda bağımlı hücre tipi, Tablo 2 ye bakınız) hazırlayın. Herhangi reaktifler steril değilse 0.2 mikron filtre kullanarak filtre. </li><li> Hareketsizleştirir bindirmeleri hazırlanması (Tablo 3) <ol><li> Sıvı bindirmeleri için, dH 2 O Avicel&#39;e bir steril% 2.4 solüsyonu yapmak Kümeleşmesini önlemek üzere, inci su ihtiva eden bir şişeye tozu ilavehızlı bir karıştırma çubuğuna sahip olan karıştırma ile, yavaş yavaş Avicel dökün ve oda sıcaklığında (RT) hızlı bir şekilde karıştırıldı. Çözelti bir karıştırma çubuğu homojenize etmek için çok viskoz kaldığı zaman bile homojenleştirilme yoğun çalkalama ile&gt; 30 dakika boyunca bir şişeye bir karıştırıcı geçin. Not: stok çözeltileri daha düşük konsantrasyonlarda yapılabilir, fakat solüsyonlar ayrı olabilir ve homojen hale getirilmesini sağlamak için karıştırılmalıdır gerekecektir. Avicel çalışma solüsyonları 0.6-3% arasında değişen kullanılabilir. </li><li> Homojenizasyon sonra, oda sıcaklığında kapalı çözüm ve mağaza otoklav. </li><li> Agaroz ve karboksimetil selüloz (CMC), şablon için, dH 2% 2 CMC ya da% 0.6 agaroz O içinde bir stok çözelti hazırlayın. Çözüm haline getirmek için bir karıştırma çubuğu ve otoklav veya mikrodalga ile karıştırın. </li></ol></li></ol> 2. Seyreltmeler ve Enfeksiyonlar <ol><li> Günlük kuluçkadan sonra görsel olarak Deneye başlamadan önce, hücrelerin birleşik duruma ve yaşayabilirliğini de kontrol edin. Standart hücresel morfoloji a sağlamaknd ~% 90 sık tek tabaka mevcuttur. </li><li> Bulaşıcı örneklerin on kat seri seyreltme gerçekleştirin. Seyreltici (Tablo 2) gibi viral çoğalma için bir hücresel büyüme ortamı kullanın. Söz konusu virüsün beklenen titresi dayalı gerekli seyreltilerin sayısını Vary, ve her zaman bağımsız plak kimlik hücresel canlılığı ve yardım sağlamak için bir bulaşmamış kontrol örneği kullanın. </li><li> Seri seyreltiler kaynaktan, 1 saat karıştırıldı (Tablo 1) 45 dakika boyunca hücreleri enfekte etmektedir. Mümkün olduğu kadar düşük bir hacmini tutan tek tabaka (Tablo 4), viral temasını maksimize etmek için ise, hücreleri kapsayacak şekilde aşı yeterli bir hacmi kullanın. Yavaşça kaya plakaları her 20 dk kapsama hatta sağlamak ve kuruma hücresel tek tabaka önlemek için. </li><li> 2x plak medya ve Hareketsizleştirme 1 karışımını: Enfeksiyondan sonra, 1 kullanılarak (Tablo 2) &#39;de mikroorganizma doğrudan ortam hareketsiz uygun bir hacim kaplamasıseçim kaplamasını ing (CMC, agaroz ya da Avicel®). Hafifçe karıştırın sallayın. <ol><li> 0,6-1,2% Avicel bindirme orta çalışan bir çözüm elde etmek için% 2.4 RT stok Avicel&#39;e - ısındı 2x plak medya ve 1.2 ile 1: Sıvı paylaşımları, 1 karıştırın. </li><li> 0.3 nihai bir agaroz / katlamalı konsantrasyonu elde sıcaklığına dengelenmeye 30 dakika için 56 ° C su banyosu içinde ısıtıldı 2x plak ortam 1 karışımını ısıtıldı% 0.6 agaroz içinde bir stok çözeltisi, yeri: bir agaroz bindirme için, 1 kullanın %. </li><li> CMC için, bir% 2 stok solüsyonu hazırlanır ve agaroz bindirme için tarif edildiği gibi muamele. </li><li> Tabakasına bindirme uygularken, her zaman tek tabaka zarar görmesini önlemek için 56 ° C su sıcak agarozun veya CMC dengelenmesi. Solüsyon sıcak olduğundan emin olun, ancak hücre ölümü ve düşük viral titreleri önlemek için dokunulmayacak kadar sıcak değil. En agaroz bindirmeleri, 42 ° C&#39;nin altında katılaşmaya başlar hızlı çalışır ve / veya taşıma sırasında katılaşma önlemek için küçük gruplar halinde hazırlayacaktır. </li></ol></li><li> Kaplamanın ilave edildikten sonra, açıkça sayılabilir olan ayrı plaklar üretmek üzere inkübe edin. Plak oluşumu, virüse bağlı olarak 2-14 gün analiz ediliyor Tablo 1 alabilir. NOT: Sıvı Kaplanmış plakalar inkübatör konduğunda, onları hareket yok. Kuluçka süresi boyunca sıvı bindirmeleri hareket smear istilanın neden olur. Agaroz ve CMC bindirmeleri yarı katı ve taşınır veya plak gelişimini izlemek için bir ışık mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edilebilir. </li></ol> 3. Tespit ve Boyama Hücreler <ol><li> , Hücrelerin tespit edilmeleri dökülür ya da Avicel bindirme havalandırın, ve (6 delikli plaka için &lt;1 mi, her bir kuyucuk) bir karışımı, 30 dakika boyunca% 10 formaldehid çözeltisi kullanılarak hücreleri düzeltmek için. <ol><li> Agaroz veya CMC için, doğrudan 1 saat gecede için bindirme için formaldehit çözüm ekleyin. NOT: Örnekler sabitleştirici uzun süre muhafaza edilebilir yapar sağlananbuharlaşması ve bu tek tabaka bozabilir gibi kurumaz. </li></ol></li><li> Önceki boyama ve tespit sonrasında, formaldehit atmak ve bir spatula ile manuel akan su ya da biriyle agaroz ve CMC&#39;nin yarı katı fişlerini çıkarın. Boyamadan önce bakiye katlamalı / fiksatif çıkartılması için su ile Avicel® plaklar durulayın. </li><li> Boyama için, ~ 15 dakika boyunca kristal menekşe renkli çözelti bir az miktarda hücreleri kapsar. Rock plates gerekirse bile kapsama sağlamak. </li><li> Yavaşça su ile kristal mor leke yıkayın. Bir kez, sabit, lekeli ve gelecek analizi için süresiz, mağaza plaklar kurutulmuştur. </li></ol> 4. viral titreleri belirlenmesi <ol><li> Aynı seyreltme teknik kopya için ortalaması alınarak, herbir göz içindeki plaklar sayın. Büyük levha formatları için, 100 plaklardan çok daha 5 daha az veya daha büyük indirim kuyu. Plak boyutu ve morfolojisi not alın. Negatif kontrol düzgün bir tek tabaka olmalıdır vebir referans kontrol olarak kullanılabilir. </li><li> Bir seyreltme ve toplam seyreltme faktörü ters için plakların ortalama sayısı dikkate alınarak bir stok örneğinden viral titresi belirlenir. </li></ol><img alt="Denklem 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOT: Bir örnek olarak, 30 ve 32 plaklar, 1 x 10 -7 seyreltme [31 (ortalama) / 10 -7 (dilüsyon) x 0.4 mi (inokulum)] 7,75 arasında bir titreye oluşacaktır 8 x 10 pfu tekrarlar için sayılan / ml olmuştur.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Koşulları önemli ölçüde değişebilir gibi başarılı bir plak tahlili için en kritik faktör söz belirli viral kültür için protokol optimizasyon yatıyor. Dikkate almak temel noktalar şunlardır: açıkça plaklar farklılaştırmak için söz konusu virüs, uygun viral büyüme koşulları, yeterli seyreltme aralıkları ile hücresel uyumluluk ev sahipliği, ve söz konusu hücreler ve virüs için doğru bindirme seçimi ve boyama. VEEV ve RVFV hem aynı konak hücre tiplerinin çok kullanan çok benzer koşullar altında büyürken, plak morfolojisi ve büyüme kinetiği farklılıklar büyük ölçüde değişmektedir. Geleneksel hemorajik ateş virüsleri ve alfavirüsler bir yayılım ve endikatör hücre hattı olarak kullanılmıştır Plak analizi için, Vero hücreleri kullanıldığında, tipik haliyle VEEV RVFV daha yüksek titrelere kadar büyür ve 48 HPI 4 de büyük düzgün plaklar, geliştirme, çoğaltma kinetik artış ortaya koyduğunu, 10-12. VEEV aksine, RVFV 72 HPI gerektirir ve tipik olarak boyut olarak daha küçük ve değişken olan plaklar gösterir. RVFV karşı ve VEEV olarak, influenza virüsü yüksek konakçı hücre spesifiktir ve doku kültürü yoluyla yaymak için zor olabilir. Grip virüsü için viral giriş ve füzyon normal olarak ev sahibi hücrenin α-sialik asit yüzey reseptörüne bağlanma yoluyla hedef hücreye girişini aracılık viral glikoprotein hamagglutinin (HA) ile hücre yüzey reseptörünün bağlanması ile başlatılır. HA tüm influenza virüsleri membran zarfı içinde mevcut olan ve spesifik bir konakçı hücre proteazı ile alt birimi HA1 ve HA2 bölünme gerektirir trimerik glikoproteinidir. Ayrıca sorunu karmaşık hale getirmektedir, bu bölünme siteleri genellikle viral suşlar 13 arasında değişebilir. Belirli bir doku ile sınırlı olduğunu HA bölebilen proteazların ekspresyonu gibi, ar proteazlarE, genellikle, seçilen konakçı hücrede 13 viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için, hücre kültür ortamına ilave edildi. Viral HA 14,15 proteolitik aktivasyonu ile (herhangi bir tripsin inaktive serum yokluğunda) çoklu-döngü replikasyonu kolaylaştıran: deneme için TPCK-tripsin MDCK ve Vero hücreleri hem de hücre kültüründe kullanıldığı yaygın olarak kullanılan bir proteazın bir örnektir. Bu çalışma ve diğerlerinin de gösterildiği gibi, virüs yaşam döngüsünün farklılıklar farklı sınıfları ve virüsleri türler arasında büyük farklılıklar göstermek üzere katlamalı seçimleri, levha biçimleri ve toplama süreleri etkileyebilir. Bizim çalışmamızda, agaroz kaplamaları virüs ve hücre tiplerinin geniş bir yelpazede arasında yararını takviye edici, CMC ya da RVFV ve grip B virüsü, hem sıvı, şablon ya da daha yüksek titrelerde açık plaklar gösterdi. Büyük ölçüde katı fişleri ve basitleştirilmiş lekelenmeye giderilmesinde destekli agaroz düşük bir nihai konsantrasyon kullanma. CMC Genel p gösterdiİnfluenza B virüsü için her üç test virüsler ve üretilen çok küçük ve belirsiz plaklar için bir kaplama olarak oorest etkinlik. Genel CMC, en az arzu edilen özellikleri göstermesine rağmen, hızla büyüyen ve titresi sadece minimal bir azalma ile plak boyutunu azaltmak için görünür olduğu gibi son derece öldürücü virüsler, avantajlı olabilecek kullanımı. Sıvı kaplama bunun kullanım kolaylığı artan hazırlamak son derece basit olduğunu en çok yönlü olduğunu kanıtladı, ve seçilen virüslerin tamamında agarosa karşılaştırılabilir. Daha yüksek geçirimli bir 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, uygulama ve çıkarmaya geleneksel bindirmeleri ile olduğu gibi, katılaşma nedeniyle engellenmiştir, doğru ve tutarlı sonuçlar verilmemiştir. Plakalar daha önce karakterize çoğaltma kinetik olan virüslere bu uyarlamayı sınırlayıcı, toplama noktasına kadar hareket olamaz gibi sıvı bindirmeleri kullanan bir göz opak renk ve plak oluşumunu izlemek için yetersizlik yatıyor. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; plak deney koşullarında küçük değişiklikler sonuçlar önemli ölçüde değiştirebilir ve herhangi bir yeni sistem veya teknik değerlendirme ve performans her zaman garanti edilir. Optimize edilmiş ve standardize plak tahlil protokolü her durum için mevcut değil iken daha fazla kullanıcı değişiklikler için yeterli altyapıya sağlarken, bizim rapor, çok yönlülük ve geleneksel kullanım yanı sıra plak deneyleri için yeni sıvı bindirmeleri kolaylığı göstermek.

Canlı viral örneklerin doğru izolasyon ve miktar tutarlı viroloji devam eden bir araştırma hedefi olmuştur. İlk 1,2 geliştirilen bir araç nicelik ve nitelik hayvan viral titreleri hesaplamak için 1952 yılında plak denemesinin gelişiyle kadar değildi. Bu teknik ilk olarak adapte ve daha önce bitki biyolojisi 1,2 stok bakteriyofajların titreleri hesaplamak için kullanılır olmuştu faj deneyleri, modifiye edildi. Viral tayini için alternatif vasıtalar bu yana bu tür bağışıklık, floresans ve transmisyon elektron mikroskopisi, ayarlanabilir darbe dirençli algılama (TRPS) olarak geliştirilmiş ve adapte edilmiş olmakla beraber, sitometrisi yeniden birleşmiş muhbir sistemleri, akış ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) bu yöntemler, kopyelemeye yetkin Virionlar 1,3 tanımlama ve miktarını belirlemede başarısız olur. Teknolojiler ve teknikler gelişmeler rafine ve görünümünü değiştirecek devam ederken; plaque deneyleri bulaşıcı litik Virionlar 1,4 viral konsantrasyonlarını belirlemede altın standardı temsil etmeye devam. Bir plak deneyi esnasında, konakçı hücrelerinin konfluent tek tabaka seri 5-100 virionlann arasında tipik haliyle, bir sayılabilir dizi seyreltildikten bilinmeyen bir konsantrasyonda bir litik virüs ile enfekte edilir. Enfekte tek tabakalar daha sonra gelişigüzel virüs yayılması sırasında, sıvı ortamın mekanik ya da konveksiyon akımı ya da yayılan viral enfeksiyonunu önlemek için bir hareketsizleştirme katlamalı ortamı ile kaplıdır. Örneğin agaroz, metil selüloz ya da karboksimetil selüloz (CMC) gibi katı veya yarı-katı kaplamalar geleneksel olarak kullanılmış olsa da, sıvı kaplamalar, Avicel 5 ila 7 olarak yararlı olan yeni bir sıvı bindirmeleri gelişmesiyle giderek daha çekici bir alternatif haline gelmiştir. Bindirme olabilir gibi geleneksel bindirmeleri karşı sıvı kullanan plaka tahlilleri appl çeşitli avantajları vardırOda sıcaklığında, ve uygulama ve boşaltılması esnasında ied önemli ölçüde daha kolaydır. Sıvı bindirmeleri ısınma gerekmez gibi, hassas ve ısıya dayanıksız virüsler de plak daha kolay ortaya çıkabilir. Ilk enfeksiyon ve hareketsizleştirici yerleşimi, tek tek plaklar veya hücre ölümü bölgeleri uygulanmasından sonra, viral enfeksiyon ve replikasyon çevreleyen tek tabaka ile sınırlı olan geliştirmeye başlar. Enfekte hücreler, replikasyon parçalama Enfeksiyondan döngüsü devam ayrıca artan bir ayrı ve farklı plaklar ile sonuçlanan, enfeksiyon ilerleyen olacaktır. Kullanılan viral büyüme kinetikleri ve konakçı hücreye bağlı olarak, görünür bir leke, normal olarak 2-14 gün içinde oluşturacaktır. Hücresel monokatmanlar kolayca çıplak gözle plaklar tanımlamak için daha sonra standart bir aydınlık alan mikroskobu ile sayılabilir, ya da daha tipik nötr kırmızı veya şiddet kristal sabit ve zıt olabilir. Mevcut plak karşı lekeleri çok çeşitli, her sunan inci varEIR özgü avantajları ve dezavantajları. Kristal viyole tipik haliyle karışım yapısındaki mevcut olduğu zaman, çok küçük plaklar belirlenmesine izin veren bir hızlı ve farklı karşı leke sağlayan toplama noktasında ve bindirmenin sabitleme / çıkarılmasından sonra ilave edilir. Nötr kırmızı, bilinmeyen bir virüs ya da çoğaltma kinetiği ile çalışırken yararlıdır plak oluşumu, özellikle gelişmekte olan canlı izlenmesi için izin erken uygulanması ve bir kaplama ile sürekli temas avantajına sahiptir. Biz ancak nötr kırmızı ile lekeleme, tipik bir biçimde farklı olmadığını bulduk. Sarı renkli boya lekeler koyu mavi ve viral plaklar kaplamanın kaldırılması gibi olmadan sayılabilir hücrelerin canlı olarak 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolyum bromürde (MTT), birkaç avantaj sunar nötr kırmızı. MTT ile elde canlı ve ölü hücreleri arasındaki yüksek kontrastlı, daha erken bir zaman noktası, enfeksiyondan sonraki küçük plaklar tespit edilmesine izin verir, Depolama hala bindirme 8 çıkarılmasını gerektirecek olsa da. Kristal mor basit olarak su ve alkol çözeltisi yapılmış ve karışık Plak için yüksek bir hassasiyet derecesi içerir üzere protokol biz de çok sayıda yapı kullanılarak olarak gösterdi sağlamak için, tercih edilen ve basitleştirilmiş karşı leke olarak seçti özelliği virüsleri bulunmaktadır. Enfekte hücresel mono-katman, sabitleme ve boyama sonrasında, plakalar mililitre başına plak oluşturucu birim (pfu) cinsinden viral stok numuneleri titre etmek için sayılmıştır. 5-100, plaklar bir referans olarak kullanılan bir negatif kontrol grubuna, sayılan arasında bir günlük damla, plaka boyutuna bağlı olarak, seri seyreltileri ile not edilmelidir. İstatistiksel örnekleri örnek karşılaştırarak 3 çoğaltır sayılır, her 100 plaklar için% 10 oranında değişir. Viral titreleri belirlemek için plak tahliller kullanılarak avantajı ağırlık Bulaşıcı viral parçacıkların fiili sayısı miktarını belirlemek için kendi yatmaktadırörnek ithin. Birden çok virionları ve potansiyel olarak tek bir hücre enfekte olabilir zamanda, Virionlar karşı birimleri terminolojisi plak titrasyonu ya da 1,2 sırasında kullanılır. Plak önemli ölçüde farklı gelişim koşulları altında ve viral türler arasında değişebilir. Onlar söz konusu virüsün büyüme ve virülans faktörleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir olarak plak boyut, berraklık, sınır tanımı ve dağıtım tüm unutulmamalıdır. Temel plak deneyi ilkelerin aynı zamanda uyarlanmış ve fokus oluşturucu tahlillerde (SYA) olarak kullanılmasında olduğu gibi, farklı şekillerde, bir dizi modifiye edilebilir. SYA&#39;leri plak oluşumunu tespit etmek için hücre erimesi ve counterstaining güveniyor değil, doğrudan doğruya etiketli antikorlar aracılığıyla hücre içi viral proteinleri tespit teknikleri immünboyama istihdam yok. Artan hassasiyet, en önemlisi litik olmayan virüsleri, her farklı olan miktarını belirlemek için yeteneği, enfeksiyondan sonra bir bekleme süresi azalmış veavantajlar SYAleri kullanıldığında. Yaygın olarak kullanılmakla beraber, geleneksel bir plak deneyi kıyasla FFAs olarak kritik sınırlayıcı faktörler, uygun antikorlar için ihtiyaç ve fiili enfeksiyon Virionlar 4 karşısında virüs protein alt-birimleri, yalnızca sondaya yatmaktadır. Bu çalışmanın amacı sağlamak için, klasik Plak analizi için kısıtlayacağız ve yeni sıvı mikrokristal selüloz bindirmeleri ile birlikte geleneksel katı ve yan katı bindirmeleri (agaroz CMC) kullanımını tarif etmektedir.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Plak deneyleri, hücre kültüründe ayrı plaklar (bulaşıcı birimleri ve hücresel ölü bölgeler) olarak sayma ile bulaşıcı Virionlar ve antiviral maddelerin doğrudan ölçümü için en doğru yöntemlerden biri olmaya devam etmektedir. Burada biz bir temel plak deneyi gerçekleştirmek için nasıl göstermek, ve ayrılan bindirmeleri ve teknikleri plak oluşumunu ve üretimini etkileyebilir nasıl. Tipik haliyle, örneğin agaroz ya da karboksimetil selüloz gibi bir katı veya yarı-katı katlamalı alt-tabakalar, likit büyüme ortam içinden geçerek gelişigüzel enfeksiyonun önlenmesi, viral yayılmayı sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Hareketsizleştirilmiş kaplamalar ayrık sayılabilir odakları ve daha sonra, plak oluşumunun oluşumuna izin hemen saran tek tabaka hücresel enfeksiyonu kısıtlar. Geleneksel kapaklar kullanıldığında doğasında zorlukların üstesinden gelmek için, mikrokristalin selüloz ve karboksimetil selüloz sodyum kullanan yeni bir sıvı kaplama artan standart bir yedek olarak kullanılmaktadırplak deneyi. Sıvı bindirme plak tahlilleri kolayca geleneksel tekniklerine göre standart 6 veya 12 sıra plaka biçimlerinden birinde yapılan ve hiçbir özel ekipman gerektirmez edilebilir. Nedeniyle sıvı bir halde ve uygulanması ve kaldırılması daha sonra çok kolay olduğu için mikro-plak formatlarını alternatif büyük ölçekli bir viral titrasyon için, doğru, hızlı ve yüksek kapasiteli bir alternatif olarak kullanılabilir. Isıtılmayan viskoz sıvı polimer kullanımı, çalışmalarını düzene fırsatı sunuyor reaktifleri, kuluçka alanı, ve hiçbir reaktif ısıtma veya cam gibi geleneksel ya da yüksek tutma laboratuvarlarında kullanılan operasyonel güvenlik gereklidir artar korur. Sıvı bindirmeleri de belirli ısıya dayanıksız virüsler için geleneksel bindirmeleri daha duyarlı ispat edebilir.

Doğru viral titreleri değerlendirmek için Plak analizi yeteneği, çok sayıda faktöre dayanır: uygun bir konakçı hücre seçimi, uygun bir ortam ve hücre ve virüs canlılığı, büyümesi koşulları, hareketsizleştirilmiş virüs yayılması ve virüs Kuluçka süresinin doğru belirlenmesi farklı için yeterli zaman sağlamak için ve sayılabilir plak oluşumu. Örnek türleri farklı karşısında kaplama, seçimin, kuluçka dönemleri ve plak morfolojisi: Bu çalışma için, üç temsilci ailelerin virüsler farklılıkları göstermek için seçildi. Venezüella at ensefalit (VEEV) at tür ve insanlarda ciddi hastalığa neden Togaviridae ailesindendir bir (+) ssRNA, viral modeli olarak seçildi. Influenza B Tayvan suşu, bir segmente (-) öncelikle insanlara bulaşmasını ssRNA virüs, Orthomyxoviridae ailesini temsil eder. Ateşli Rift Valley virüsü (RVFV), bir (-) öncelikle eklembacaklıları enfekte ssRNA, artropod doğan virüsü,geviş ve insanlar, Bunyaviridae ailesinin temsilcisi olarak seçildi. RVFV (Şekil 1) için, titreleri 72 saat sonra enfeksiyonu için yan-yana kuluçkalanmıştır CMC, agaroz ya da Avicel bindirmeleri kullanan bir 12 kuyucuklu bir plaka biçiminde RVFV bir rekombinant canlı zayıflatılmış MP12 soyunun bir stok çözeltiden belirlendi (HPI). 10 -4 10 -7 arasında değişen dilüsyonlarını gösteren bir temsili plaka CMC kullanarak Panel A. Plaketlerinin görülen ve agaroz bindirmeleri iyi tanımlanmış bir dairesel sınırında, küçük, açık ve belirgin plaklar gösterdi edilebilir. Bir sıvı kalıbı ile plaklar biraz daha bol ve CMC plaklar agarosa ve kıyasla daha büyük olduğunu, ve daha az belirgin bir sınır sağladı. Viral titreleri bindirmeleri tüm karşılaştırılabilir performans ile Panel B karşılaştırıldı. Yeniden Üretim belirlemek için daha büyük bir örnek büyüklüğü ile MP12 için bindirme arasında net bir görsel bir karşılaştırma elde etmek içinnün, bir 6 yuvalı plaka da aynı şekilde üçlü (Şekil 2) trialed edildi. 6 yuvalı plaka biçiminde, CMC bindirmenin birbirinin boyut olarak karşılaştırılabilir agaroz ya da sıvı, şablon, &#39;den daha küçük plaklar gösterdi. Viral titreleri her üç bindirmeleri (Panel D) arasında benzer iken, agaroz ve sıvı bindirmeleri oluşan plaklar nedeniyle artan boyutu saymak daha kolay olmuştur. Belirgin değişmiştir (Şekil 3A), farklı şablonlar arasında RVFV, VEEV titreleri ve Plak aksine. Plak boyutu ve hassasiyet (Panel B) pahasına, 12 de plaka biçimi kullanarak CMC bindirmeleri oluşan plaklar, açık ve net morfolojisi gösterdi. CMC aksine, agaroz ve sıvı şablonlar kullanımı VEEV çoğaltma daha düşük viral önleme ve artan duyarlılık gösteren, önemli ölçüde daha büyük bir plaklar elde edildi. Sadece ap CMC&#39;nin karşı agarozun karşılaştırırken Bu önceden doğrulandıaper Juarez ve ark. 4 tarafından yayınlandı. Agaroz ve sıvı bindirmeleri CMC daha büyük plaklar üretirken, plaklar kötü sınırları tanımlanmış ve büyük sınır yaygınlaşmasını sağlayan sıvı bindirmeleri ile, bir 12 iyi biçimde saymak zordu vardı. Plakalar 6 yuvalı plakalar (Şekil 4) &#39;de trialed edildiğinde, büyük 6 göz formatındaki açısından CMC bindirmelere üstün kanıtlayan agaroz ile, 12 gözlü bir formatta ayırt etmek zor açıkça birikimdir ve sıvı bindirmeleri konusunu etkisiz plak tanımı ve hassas (Şekil 4D). Karşılaştırma RVFV ya da harici bir proteaz gereği olarak, plaquing zaman VEEV, grip birkaç benzersiz zorluklarla sağlar. Agaroz markalar farklı olarak küçük değişiklikler olması varken önemli değişiklikler belirtildiği gibi farklı bindirme seçimleri için grip virüsünün duyarlılığı da iyi geçmişte belgelenmiştirtr 9 kullanılır. İlginç İnfluenza B Tayvan suşu için bir kaplama olarak CMC&#39;nin kullanımı saymak zor ve (Şekil 5A) güvenilir puanı zor kanıtladı belirgin küçük plaklar sonuçlandı. Bir agaroz kaplamanın kullanılması iyi plaklar (Panel C) sağlanır ve (artan tek tabakalı canlılığı olasılığı nedeniyle) daha koyu bir arka plan leke sonuçlandı ve sıvı bindirme kullanımı (Panel B doğrudan karşılaştırıldığında daha net ve keskin plaklar gösterdi ). Böyle agaroz ve CMC gibi katı ve yarı katı bindirmeleri üzerinde sıvı polimerler, bir avantajı, kaldırma ve uygulama kolaylığı yatıyor. Yarı Katı bindirmeleri ısıtma gerektiren, ve taşıma ve kaldırma sırasında katılaşma problemli olabilir. Bu avantajlardan yararlanmak ve RVFV için yüksek verimli bir şekilde Avicel kullanan pratiklik belirlemek için, 96 kuyucuklu plak format değişik katlamalı konsantrasyon derecesinden en trialed edildions (Şekil 6). RVFV MP-12 için, seyreltme Avicel hem de 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlarda dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. Bini ve kaldırma tekrarlanabilirlik yüksek derecede gösteren, kopya arasından veya belirtilen konsantrasyonları arasında belirgin farklar, basit olduğu kanıtlanmamıştır. Puanlama yaparken, plaklar RVFV için yüksek verimli bir şekilde sıvı bindirmeleri kullanan fizibilitesini gösteren, çıplak gözle belirgin ve sayılabilir idi. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. 12 gözenekli plakalar kullanılarak RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plakalanmış ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Enfeksiyon% 0.3 agaroz 1.5 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC (son c sonraPanel A. plaklardaki gösterdi sayıldı ve Panel B&#39;de titre gibi oncentrations) doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak plakalanır ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 400 ul ile enfekte edilmiştir. Paneller AC için tarif edildiği gibi Panel A&#39;da gösterildiği gibi% 0.3 agaroz üç mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı, B ve C Ayrı deneyler ile aynı şekilde gerçekleştirilmiştir plakalar sayılmıştır ve Panel D&#39;ye (n = 3) olarak titre. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Şekil 3: &lt;12 gözenekli plakalar kullanılarak strong&gt; VEEV plak katlamalı karşılaştırmaları. Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plaka haline getirilmiş ve VEEV, TC-83 aşı soyunun aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Panel A. plaklardaki gösterildiği gibi virüsle enfekte edildikten sonra% 0.3 agaroz 1.5 mi, şablon,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC, Pand B&#39;de sayıldı ve titre edildi doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Şekil 4:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması V EEV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak kaplandı ve 400 ul VEEV TC-83 ile aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak ile enfekte edilmiştir. Gösterildiği gibi enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da bir% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandıC sayılır ve Panel D titre plaklarla göre, (N = 3) - Panel A için tarif edildiği gibi paneller A, B ve C, ayrı deneyler aynı yapılmıştır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Şekil 5: İnfluenza plak katlamalı karşılaştırmalar MDCK hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde 5 x 10 5 hücre plakalanmış ve Influenza Tayvan aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak aşı 400 ul ile enfekte edilmiştir.. FBS, viral füzyon için gerekli olan belirli proteazlann inhibisyonu yoluyla grip yayılmasını inhibe gibi fetal sığır serumu (FBS), büyüme ortamı veya üst kullanılmıştır. TPCK-tripsin konakçı hücrelerde viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için uygulamadan önce bindirmeleri tümüne eklenmiştir. Enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC doğrudan karşılaştırmak amacıyla uygulananCı, Panel D sayıldı ve titre plaklarla (n = 3) - Panel A tarif edildiği gibi Panel A, B ve C ile ayrı deneylerde gösterildiği gibi kaplamalar aynı yapılmıştır. Ortalama bir CMC plaklar için alınan iken diffüz sınırları ve çok küçük plak boyutları gösterdiği gibi onlar güvenilir saymak zor oldu. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Şekil 6:. Yüksek üretim leke düzenleri Veros bir 96 yuvalı plaka dörtlü olarak, 1 saat boyunca RVFV MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak aşı 50 ul ile enfekte edilmiştir, oyuk başına 3 x 10 4 hücre kaplama. Bindirmeleri için Avicel 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlara eklenmiştir bir yüksek verimli bir şekilde, paneller A ve B sıvı bindirmeleri kullanılmasının fizibilitesi ve tekrarlanabilirliğini belirlemek amacıyla trialed edilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Enfeksiyon dönemi </td><td> 1 saat </td><td> 1 saat </td><td> 45 dakika </td></tr><tr><td> İnkübasyon süresi </td><td> 3 gün </td><td> 2 gün </td><td> 3 gün </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Plak Testi Aşılama Koşulları ve Hücre Tipleri <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre Tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Büyüme Tipi</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plak Medya </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / streptomisin ile takviye edilmiştir. 2. Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / Streptomisin,% 0.2 öküz serum albumini,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran 50 ug / ml ile takviye edilmiştir. % 5 FBS (25 mi),% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi),% 1 sodyum piruvat (5 mi),% 1 L-glutamin (5 ml) ile takviye edilmiş A 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi), % 2 / Strep (10 mi). % 0.2 öküz serum albumini,% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi), 50 ug / ml,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran, Tripsin-TPCK ile takviye edilmiş B 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi) * * Hazırlık hemen önce, 25 başına 1 ul eklemekalikotuna 2 ug TPCK-tripsin / ml stok ml Eğer plaklar için agaroz ile karıştırmak için kullanıyor olacak. Tablo 2: Plak ve Viral / Hücresel Büyüme Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Enfeksiyon dönemi </td><td> 1 saat </td><td> 1 saat </td><td> 45 dakika </td></tr><tr><td> İnkübasyon süresi </td><td> 3 gün </td><td> 2 gün </td><td> 3 gün </td></tr></tbody></table> Çok uzun kısırlık muhafaza olarak yapıldığı zaman Yerleşimi çözümler dolacak değil. Tablo 3: Kaplamalar Stok <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 yuvalı </td><td> 12 gözlü </td><td> 96 gözlü </td></tr><tr><td> Hücreler içinde / oyuk </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2.5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Inokulum hacmi (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> paylaşımının hacmi (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Plaka Biçimleri

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.4K Görüntüleme.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Video: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biyoloji

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

Mikrobiyoloji

Analyzing the Antigenic Relationship between Viruses using an Image-Based Microneutralization Assay

Source: Lin, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54897">Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relations between influenza A and B viruses. It provides a quantitative and visual way to assess the effectiveness of antibodies or other treatments in preventing viral infection.

Virüsler Arasındaki Antijenik İlişkinin Görüntü Tabanlı Mikronötralizasyon Testi Kullanılarak Analiz Edilmesi

1. Virus Titration
NOTE: Depending on the number of viruses and the number of duplicates, a well plate can be set up with the following flexibilities: (1) ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Görüntüleme ve Görselleştirme Teknikleri

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Plak Testi ile Deneysel İlaçların Antiviral Etkinliğinin Belirlenmesi

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

	To ...