We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Preparação de Células e Reagentes <ol><li> No dia antes do ensaio, placa de células hospedeiras apropriadas para o vírus em questão (Tabela 1 e 2) em 90 - 100% de confluência. </li><li> Preparar a solução de fixação de 10% de formaldeído em dH 2 O. No exemplo, misturar 5,56 ml de estoque 36% de formaldeído, com 14,44 mL de H 2 O destilada (dH2O). NOTA: Use as práticas de manuseio seguro adequado e ventilação quando se utiliza formaldeído. </li><li> Prepare a mancha violeta de cristal: 1% de cristal violeta (CV) em etanol a 20% e dH 2 O. </li><li> Prepare a mídia de placa 2x (tipo de célula dependente na concentração 2x; ver Tabela 2). Filtrar através de um filtro de 0,2 um, se quaisquer reagentes não são estéreis. </li><li> Preparação de sobreposições de imobilização (Tabela 3) <ol><li> Para sobreposições de líquidos, fazer uma solução estéril de 2,4% de Avicel em dH 2 O. Para evitar aglomeração, adicionar o pó a um balão contendo água tha mistura é rapidamente com uma barra de agitação, verter em Avicel lentamente e agita-se rapidamente à temperatura ambiente (RT). Quando a solução for muito viscoso para uma barra de agitação para homogeneizar, mudar para um shaker frasco para&gt; 30 min com agitação pesado para garantir uma homogeneização. NOTA: As soluções de reserva pode ser feita em concentrações mais baixas, mas as soluções podem separar-se e terá de ser remisturado para assegurar a homogeneização. As soluções de trabalho de Avicel pode ser utilizado variando 0,6-3%. </li><li> Após homogeneização, a solução autoclave selado e armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Para agarose e carboximetilcelulose (CMC) sobreposições, preparar uma solução de reserva em dH2O de 2% de CMC ou 0,6% de agarose. Misture com uma barra de agitação e autoclave ou forno de microondas para trazer a solução. </li></ol></li></ol> 2. As diluições e Infecções <ol><li> No dia após o plaqueamento, verificar visualmente a confluência e viabilidade das células antes de se iniciar o ensaio. Certifique-se de um padrão celular morfologiand uma monocamada confluente ~ 90% está presente. </li><li> Realizar uma diluição em série de dez vezes das amostras infecciosas. Usar o meio de crescimento celular para a propagação viral como diluente (Tabela 2). Variar o número de diluições necessárias com base na titulação esperada do vírus em causa, e sempre usar uma amostra de controlo não infectado, independentemente, para assegurar a viabilidade celular e ajuda na identificação de placas. </li><li> A partir das diluições em série, infectar as células durante 45 min a 1 h (Tabela 1). Utilizar um volume suficiente de inoculo para cobrir as células, mantendo o volume tão baixo quanto possível para maximizar o contacto com a monocamada viral (Tabela 4). Placas rochosas suavemente a cada 20 min para garantir uma cobertura uniforme e evitar a monocamada celular de secagem. </li><li> Após a infecção, sobrepor um volume apropriado de meio de imobilizar directamente para os inóculos no poço (Tabela 2) usando uma mistura 1: 1 de 2 x media de placa e o immobilizing sobreposição de escolha (CMC, agarose ou Avicel). Agite suavemente para misturar. <ol><li> Para sobreposições de líquidos, misture 1: 1 com aquecido mídia chapa 2x e 1,2-2,4% da RT Avicel para obter uma solução de trabalho de 0,6-1,2% Avicel meio de cobertura. </li><li> Para obter uma camada de agarose, utilizar uma mistura 1: 1 de meios de placa 2x aquecido e uma solução de estoque de 0,6% de agarose aquecido, em lugar de um C num banho de água a 56 ° durante 30 minutos para equilibrar a temperatura a obtenção de uma concentração final de agarose / sobreposição de 0,3 %. </li><li> Para CMC, preparar uma solução stock de 2% e tratar como descrito para a sobrecamada de agarose. </li><li> Ao aplicar-se uma camada superior ao monocamada, sempre equilibrar agarose quente ou CMC numa água de 56 ° C para evitar danos na monocamada. Certifique-se de que a solução é quente, mas não quente ao toque para evitar a morte celular e reduzidos os títulos virais. A maioria das camadas de agarose vai começar a solidificar abaixo de 42 ° C, trabalhar rapidamente e / ou preparar pequenos lotes para evitar a solidificação durante o manuseio. </li></ol></li><li> Após a adição da sobreposição, incubar as placas para produzir chapas que são claramente distintos contáveis. A formação de placa pode demorar de 2-14 dias, dependendo do vírus a ser analisada, Tabela 1. NOTA: Uma vez que as placas sobrepostas líquidos são colocados na incubadora, não movê-los. Movimento das sobreposições de líquidos durante o período de incubação resultará em placas borratadas. Agarose e CMC sobreposições são semi-sólidas e podem ser movidos ou verificada periodicamente sob um microscópio de luz para monitorar o desenvolvimento da placa. </li></ol> 3. Fixação e coloração de células <ol><li> Para fixar as células, deitar fora ou aspirar o Avicel sobreposição, e fixar as células usando a solução de formaldeído a 10% durante 30 minutos a durante a noite (&lt;1 ml por poço para uma placa de 6 poços). <ol><li> Para agarose ou CMC, adicionar directamente a solução de formaldeído à sobreposição durante 1 hora a durante a noite. NOTA: As amostras podem ser mantidas por longos períodos de tempo no fixador desde que faznão evaporar e secar como isto pode falsear a monocamada. </li></ol></li><li> Antes da coloração e após a sua fixação, descartar o formaldeído e remover os bujões semi-sólidas para a agarose e CMC quer com água corrente ou manualmente com uma espátula. Lavar as placas Avicel com água para remover o residual de sobreposição / fixador antes da coloração. </li><li> Para a coloração, cobrir as células com uma quantidade mínima de solução de violeta de cristal durante ~ 15 min. Placas de rocha se necessário para garantir uma cobertura uniforme. </li><li> Delicadamente, lave a mancha violeta de cristal com água. Uma vez fixados, corados e seco, placas de loja por tempo indeterminado para análise futura. </li></ol> 4. Determinar virais Títulos <ol><li> Contar as placas em cada poço, considerando a média de todas as repetições técnicos da mesma diluição. Para grandes formatos de placas, poços de desconto com menos de 5 ou maior do que 100 placas. Tome nota do tamanho e morfologia de placas. O controle negativo deve ter uma monocamada uniforme epode ser usado como um controlo de referência. </li><li> Determinar o título viral da amostra stock tendo o número médio de placas para uma diluição e o inverso do factor de diluição total. </li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Como um exemplo, 30 e 32 para as placas foram contadas repetições do 1 x 10 -7 diluição [31 (média) / 10 -7 (diluição) x 0,4 ml (inoculo)] iria originar um título de 7,75 x 10 8 pfu / ml.

<ol>
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The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

O factor mais crítico para um ensaio de placa de sucesso encontra-se na optimização do protocolo para a cultura viral particular em questão como condições podem variar significativamente. Pontos-chave a ter em conta são: sediar compatibilidade celular com o vírus em questão, as condições de crescimento virais apropriadas, faixas de diluição suficientes, a fim de diferenciar claramente placas e seleção sobreposição correta e coloração para as células e os vírus em questão. Enquanto VEEV e RVFV tanto crescer sob condições muito semelhantes, utilizando muitos dos mesmos tipos de células hospedeiras, as diferenças na cinética de crescimento e morfologia de placas variar significativamente. Ao usar células Vero para ensaios de placa, que têm sido usados ​​tradicionalmente como uma linha de células de propagação e indicador de vírus da febre hemorrágica e alphaviruses, VEEV tipicamente cresce para títulos mais altos do que RVFV e demonstra um aumento da cinética de replicação, o desenvolvimento de placas uniformes grandes às 48 hpi 4, 10-12. Em contraste com VEEV, RVFV requer 72 hpi e demonstra placas que são tipicamente muito menor e variável em tamanho. Em oposição a RVFV e VEEV, o vírus da gripe é altamente específico da célula hospedeira e pode ser difícil de propagar através de cultura de tecidos. Para o vírus da gripe, a entrada viral e fusão é normalmente iniciado pela ligação do receptor da superfície celular com a glicoproteína hamagglutinin viral (HA), que medeia a entrada na célula-alvo através da ligação com o receptor da superfície ácido siálico-α da célula hospedeira. HA trimérico é uma glicoproteína que está presente no envelope da membrana de todos os vírus Influenza e requer clivagem para a subunidades HA1 e HA2 por uma protease célula hospedeira específica. Para complicar ainda mais a questão, estes sítios de clivagem muitas vezes pode variar entre 13 cepas virais. À medida que a expressão de proteases capazes de clivar HA é restrita a tecidos específicos, proteases ARe frequentemente adicionadas ao meio de cultura de células, a fim de facilitar a fusão viral e a entrada na célula hospedeira seleccionada 13. TPCK-tripsina é um exemplo de uma protease vulgarmente utilizado que é usado em cultura de células MDCK com ambos e células Vero: facilitar a replicação multi-ciclo (na ausência de qualquer soro de inactivação da tripsina) por meio da activação proteolítica de HA viral 14,15. Como demonstrado neste estudo e outros, as diferenças no ciclo de vida viral pode influenciar seleções de sobreposição, formatos de placas, e tempos de coleta, com variações significativas entre as diferentes classes e espécies de vírus. Em nosso estudo, camadas de agarose demonstrou placas claras em títulos mais elevados do que qualquer CMC ou sobreposições de líquidos, tanto para RVFV e vírus Influenza B, reforçando sua utilidade entre uma ampla gama de vírus e tipos de células. Usando uma baixa concentração final de agarose muito auxiliado na remoção dos plugues sólidos e coloração simplificada. CMC global mostrou a poorest eficácia como uma cobertura para todos os três vírus testados e muito pequenas e indistintas placas produzidas para o vírus da Influenza B. Embora CMC global mostrou as características menos desejáveis, a sua utilização em rápido crescimento e extremamente virulentas vírus poderia revelar-se vantajoso, como o fez aparecer para reduzir o tamanho da placa com apenas uma redução mínima na titulação. A sobreposição de líquido provou ser o mais versátil na medida em que era extremamente simples de preparar, maior facilidade de utilização, e a agarose foi comparável em todos os vírus seleccionados. Num formato de placa de maior rendimento de 96 poços, aplicação e remoção não foi inibida devido à solidificação como com sobreposições tradicionais, e proporcionaram resultados precisos e consistentes. A consideração ao usar sobreposições de líquidos reside na coloração opaca e incapacidade de controlar a formação de placas como as placas não podem ser movidos até o ponto de coleta, limitando essa adaptação ao vírus com cinética de replicação anteriormente caracterizados. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pequenas modificações nas condições de ensaio de placa pode alterar significativamente os resultados, bem como a avaliação e desempenho de qualquer novo sistema ou técnica é sempre garantido. Enquanto um protocolo de ensaio de placa otimizada e padronizada não existe para cada situação, o nosso relatório demonstram a versatilidade e facilidade de uso em tradicional, bem como sobreposições de líquidos para novos ensaios de placa, proporcionando um fundo suficiente para mais modificações do usuário.

O isolamento precisas e quantificação das amostras virais viáveis ​​tem sido consistentemente um objetivo a investigação em curso em virologia. Não era até o advento do ensaio de placa em 1952 que um meio para calcular quantitativamente e qualitativamente os títulos virais animais foi desenvolvido pela primeira vez 1,2. Esta técnica foi adaptada e modificada a partir de ensaios de fagos, os quais foram anteriormente utilizados para calcular os títulos de banco de bacteriófagos em planta biologia 1,2 primeiro. Enquanto meios alternativos para quantificação viral desde então têm sido desenvolvidos e adaptados, como imunoensaios, fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão, ajustável de detecção de pulso resistiva (TRPS), citometria de fluxo, sistemas de repórter recombinantes, e reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase com transcrição (qRT-PCR) , esses métodos não conseguem identificar e quantificar replicação virons competentes 1,3. Embora os avanços nas tecnologias e técnicas de continuar a aperfeiçoar e alterar a paisagem; PLAQUE os ensaios continuam a representar o padrão ouro na determinação das concentrações virais para virons líticas infecciosas 1,4. Durante um ensaio de placa, uma monocamada confluente de células hospedeiras está infectado com um vírus lítico de uma concentração desconhecida que foi diluída em série para uma gama contáveis, tipicamente entre 5-100 viriões. As monocamadas infectadas são então coberto com um meio de cobertura de imobilização para impedir a infecção viral a partir de indiscriminadamente, quer através de difusão do fluxo de convecção mecânica ou do meio líquido durante a propagação viral. Apesar da sobreposição sólidas ou semi-sólidas, tais como agarose, metilcelulose ou carboximetilcelulose (CMC) têm sido tradicionalmente utilizados, sobreposições de líquidos tornaram-se cada vez mais uma alternativa atraente, com o desenvolvimento de novas folhas de prova de líquidos, tais como Avicel 5- 7. Ensaios de placa utilizando líquido contra sobreposições tradicionais têm várias vantagens como a sobreposição pode ser applied à temperatura ambiente, e a aplicação e remoção é significativamente mais fácil. Como sobreposições líquidos não requerem aquecimento, vírus lábil delicados e de calor também pode revelar-se mais fácil de placa. Após a infecção inicial e aplicação da sobreposição imobilizante, placas individuais, ou zonas de morte celular, irá começar a desenvolver infecção como a replicação viral e são constrangidas para a monocamada circundante. As células infectadas irão continuar o ciclo de replicação de lise-infecção, mais de propagação da infecção, resultando em placas cada vez mais distintos e separados. Dependendo da cinética de crescimento viral e célula hospedeira utilizada, uma placa visível forma, normalmente, dentro de 2-14 dias. As monocamadas celulares podem então ser contadas com um microscópio de campo brilhante padrão, ou mais tipicamente fixo e contrastadas pelo vermelho ou cristal violenta neutro, a fim de identificar prontamente placas a olho nu. Há uma grande variedade de contra placa manchas disponíveis, cada oferta their vantagens e desvantagens específicas. O violeta de cristal é tipicamente adicionado na altura da recolha e após a fixação / remoção da cobertura, proporcionando um contador de mancha rápida e distinta, que permite a identificação de placas muito pequenas quando morfologia mista está presente. Vermelho neutro tem a vantagem de aplicação antecipada e constante contato com a sobreposição, permitindo o monitoramento ao vivo de desenvolver a formação de placas, o que é particularmente útil quando se trabalha com um desconhecido cinética de vírus ou de replicação. Nós descobrimos que a coloração no entanto não é geralmente tão distinta quando utilizando vermelho neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) oferece diversas vantagens, como as manchas de cor amarelo vivo corantes células placas azuis escuras e virais podem ser contados, sem remoção da sobreposição quanto com vermelho neutro. O alto contraste entre as células vivas e mortas oferecidas pela MTT também permite a detecção de pequenas placas em uma hora mais cedo a infecção ponto pós, Apesar de armazenamento ainda exigiria a remoção da cobertura 8. Como violeta de cristal pode ser feita simplesmente em uma solução de água e álcool, e proporciona um elevado grau de sensibilidade para a morfologia da placa mista, optámos-lo como um contador de manchas preferido e simplificado para o protocolo como demonstrado que estamos utilizando várias famílias de bem vírus caracterizados. Após fixação e coloração da monocamada celular infectada, as placas são contadas no fim titule banco de amostras virais em termos de unidades formadoras de placas (pfu) por mililitro. Uma gota de registo deve ser observado entre diluições em série e, dependendo do tamanho da placa, entre as placas foram contadas 5-100, com um controlo negativo utilizado como uma referência. Amostras estatisticamente irá variar em 10% para cada 100 placas contados quando se compara amostra replica 3. A vantagem de usar ensaios de placas para determinar os títulos virais reside na sua capacidade para quantificar o número real de partículas virais infecciosas within a amostra. Como múltiplos viriões poderia potencialmente infectar uma célula única, a terminologia de unidades contra virons é utilizado durante as titulações em placa 1,2. Morfologia da placa pode variar drasticamente sob diferentes condições de crescimento e entre espécies virais. Tamanho da placa, a clareza, a definição das fronteiras, e distribuição devem todos ser notado como eles podem fornecer informações valiosas sobre o crescimento e fatores de virulência de vírus em questão. Os princípios básicos da placa de ensaio também pode ser adaptado e modificado num número de maneiras diferentes, tais como no uso de ensaios de formação de foco (FFAs). FFAs não dependem de lise celular e de contraste para detectar a formação de placa, mas sim empregar técnicas para detectar diretamente as proteínas virais intracelulares através de anticorpos marcados imunomarcação. O aumento da sensibilidade, diminuição dos tempos de incubação após a infecção, e mais importante a capacidade para quantificar os vírus não-líticos são todos distintosvantagens quando se emprega FFAs. Embora amplamente utilizados, os factores críticos que limitam FFAs em comparação com um ensaio de placa tradicional reside na necessidade de anticorpos apropriados e a capacidade de somente sonda para subunidades de proteínas virais contra viriões infecciosos 4 reais. Para o propósito deste estudo, vamos limitar nossa discussão para ensaios de placa clássicos e descrever o uso de sobreposições de sólidos e semi-sólidos tradicionais (agarose e CMC), juntamente com novas sobreposições de celulose líquido microcristalinas.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Ensaios de placa continuam sendo um dos métodos mais precisos para a quantificação direta de virons infecciosas e substâncias antivirais através da contagem de placas discretas (unidades infecciosas e zonas mortas celulares) em cultura de células. Aqui demonstramos como realizar um ensaio básico placa, e como sobreposições e técnicas diferentes podem afetar a formação de placas e de produção. Tipicamente substratos sólidos ou semi-sólidos de sobreposição, tais como agarose ou carboximetil celulose, têm sido utilizados para restringir propagação viral, prevenindo a infecção indiscriminada através do meio de crescimento líquido. Sobreposições imobilizadas restringir a infecção celular para a monocamada imediatamente circundante, permitindo a formação de focos contáveis ​​discreta e subsequente formação de placa. Para superar as dificuldades inerentes ao uso de sobreposições tradicionais, uma sobreposição de líquido romance utilizando celulose microcristalina e carboximetilcelulose de sódio tem sido cada vez mais utilizado como um substituto no padrãoensaio de placas. Ensaios de placas de sobreposição líquidos podem ser prontamente realizada em qualquer padrão 6 ou 12 formatos de placas, bem como por técnicas tradicionais e não requerem equipamento especial. Devido ao seu estado líquido e subsequente facilidade de aplicação e remoção, formatos de placas de microcultura podem, alternativamente, ser utilizado como uma alternativa de transferência rápida, precisa e de alta para titulações virais maior escala. O uso de um polímero líquido viscoso aquecido não oferece a oportunidade de agilizar o trabalho, conserva reagentes, espaço incubadora, e aumenta a segurança operacional quando usado em laboratórios de contenção tradicionais ou altos como nenhum aquecimento do reagente ou das suas obras são necessárias. Sobreposições de líquidos podem também revelar-se mais sensível do que as sobreposições tradicionais para determinados calor vírus lábil.

A capacidade dos ensaios de placas para avaliar com precisão os títulos virais depende de numerosos factores: selecção da célula hospedeira apropriada, meios apropriados e condições de crescimento para a viabilidade celular e viral, a propagação viral imobilizada, e uma determinação exacta do período de incubação viral para permitir um tempo adequado para distinta e formação de placas contáveis. Para este estudo, os vírus de três famílias representativas foram escolhidas para demonstrar as diferenças de: seleção de sobreposição, períodos de incubação e morfologia da placa através de diferentes tipos de amostras. Encefalite Equina Venezuelana (VEEV) foi seleccionada como um modelo viral (+) ssRNA, o que pode causar doença significativa em equinos e humanos e representa a família Togaviridae. Influenza B tensão Taiwan, um segmentado (-) vírus ssRNA infectando principalmente os seres humanos, representa a família Orthomyxoviridae. Rift Valley vírus da febre (RVFV), a (-) ssRNA artrópode nascido vírus infectando principalmente artrópodes,ruminantes e humanos, foi escolhido como representante da família Bunyaviridae. Para RVFV (Figura 1), os títulos foram determinados a partir de uma solução de estoque de uma estirpe viva atenuada recombinante MP12 de RVFV em um formato de placa de 12 poços utilizando CMC, de agarose, ou sobreposições Avicel que foram incubadas lado-a-lado para a infecção de 72 h pós (IPH). Uma placa representativa mostrando diluições que variam de 10 -4 a 10 -7 pode ser visto no Painel A. As placas utilizando a CMC e camadas de agarose mostrou placas pequenas, claras e distintas com uma borda circular bem definido. As placas com uma sobreposição de líquido eram ligeiramente mais abundante e maior em comparação a agarose e as placas de CMC, e proporcionada uma fronteira menos distintas. Os títulos virais foram comparados no Painel B com todas as sobreposições de realização comparavelmente. A fim de obter uma comparação visual mais clara entre sobreposições para MP12, juntamente com uma amostra maior para determinar reproduçõeslidade, uma placa de 6 poços foi também testadas em triplicado (Figura 2). No formato de placa de 6 poços, a utilização de uma sobreposição de placas CMC apresentaram menores do que quer camadas de agarose ou líquidos, que eram comparáveis ​​em tamanho para o outro. Apesar de os títulos virais foram semelhantes entre todos os três sobreposições (Painel D), placas formadas em camadas de agarose e liquidas mostrou mais fáceis de contar, devido ao seu tamanho aumentado. Em contraste com RVFV, os títulos de VEEV e morfologia da placa entre as diferentes sobreposições variaram significativamente (Figura 3A). As placas formadas nas sobreposições CMC demonstraram uma morfologia clara e distinta quando se utiliza um formato de placa de 12, à custa do tamanho da placa e sensibilidade (Painel B). Em contraste com a CMC, a utilização de líquidos de agarose e sobreposições resultou em placas significativamente maiores, indicando menor inibição viral e aumento da sensibilidade à replicação VEEV. Isto foi confirmado anteriormente, quando apenas comparando agarose contra CMC em apaper publicado por Juarez et al. 4. Enquanto agarose e líquidos produzidos sobreposições placas maiores do CMC, as placas tinham fronteiras mal definidas e eram difíceis de contar em um formato bem 12, com sobreposições de líquidos que fornecem a maior difusão fronteira. Quando as placas foram testadas em placas de 6 poços (Figura 4), ​​o maior 6 formato bem negada a emissão de placas abertamente grandes que eram difíceis de diferenciar, no formato de 12 poços, com agarose e sobreposições líquidos provando superior às sobreposições CMC em termos de definição de placa bacteriana e sensibilidade (Figura 4D). Em comparação com RVFV ou VEEV, influenza oferece vários desafios quando da formação das placas, como a exigência de uma protease externa. A sensibilidade do vírus da gripe de diferentes selecções de sobreposição, também tem sido bem documentada no passado como alterações significativas foram notadas quando as modificações como menores, tal como as marcas de agarose ser diferentes têmen usado 9. Curiosamente para a estirpe de gripe B Taiwan, a utilização de CMC como uma sobreposição resultou em placas marcadamente menores que eram difíceis de contar e provou difícil de marcar de forma fiável (Figura 5A). A utilização de uma sobrecamada de agarose que proporcionaram os melhores placas (Painel C), e resultou em uma mancha mais escura do fundo (provavelmente devido ao aumento da viabilidade monocamada), e mostrou placas mais claras e nítidas em comparação directa com a utilização do líquido de sobreposição (Painel B ). Uma vantagem distinta de polímeros líquidos e sólidos mais de sobreposições semi-sólidas, tais como agarose e CMC, reside na facilidade de remoção e de aplicação. Sobreposições de semi-sólidos requerem aquecimento e solidificação pode revelar-se problemática quando o manuseio e remoção. A fim de aproveitar essas vantagens e para determinar a viabilidade de utilizar Avicel de uma forma de alto rendimento para RVFV, um formato de placa de 96 poços foi julgado em diferentes concentrati sobreposiçãoons (Figura 6). Para RVFV MP-12, diluições foram realizadas em quadruplicado em ambos os 0,6 e 1,2% concentrações finais de Avicel. Recobrimento e remoção provou simples, sem diferenças aparentes entre as repetições ou entre as concentrações observadas, demonstrando um alto grau de reprodutibilidade. Quando conseguir, as placas eram distintos e contáveis ​​a olho nu, o que demonstra a viabilidade de utilização de sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento para RVFV. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 12 poços Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 5 células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC (c definitivaoncentrations), foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Três ml de sobreposições de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A, B, e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para painéis de AC, com as placas foram contadas e titulam-se no Painel D (N = 3). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;fortes&gt; VEEV placa comparações de sobreposição utilizando placas de 12 poços. Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 5 células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir da estirpe de vacina VEEV TC-83. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4:. V EEV comparações de sobreposição de placa, utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de VEEV TC-83. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou uma CMC de 1%, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstradoem Painéis A, B e C. experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para os Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: Influenza comparações de placas de sobreposição células MDCK foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de Influenza B Taiwan.. Nenhum soro fetal bovino (FBS) foi utilizado no meio de crescimento ou sobreposições, como FBS pode inibir a propagação da gripe por meio da inibição de determinadas proteases que são necessários para a fusão viral. TPCK-tripsina foi adicionada a todas as folhas de prova antes da aplicação, a fim de facilitar a fusão e a entrada viral com as células hospedeiras. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC foram aplicados a fim de comparar directamenteas sobreposições, tal como demonstrado no Painel A, B e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita no Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3). Enquanto a média foi levado para placas CMC eles provaram difícil contar confiável como eles demonstraram fronteiras difusas e tamanhos de placas muito pequenas. <img alt="A Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Sobreposições de placas High Throughput Uma placa de 96 poços de Veros colocadas em placas a 3 x 10 4 culas por po, foram infectados com 50 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de RVFV MP12 durante 1 hora, em quadruplicado. Para as sobreposições, 0,6 e 1,2% de Avicel concentrações finais foram testadas a fim de determinar a viabilidade de utilização de reprodutibilidade e sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento, Painéis A e B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infecção </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> O tempo de incubação </td><td> 3 dias </td><td> 2 dias </td><td> 3 dias </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Placa condições do ensaio de inoculação e Celulares Tipos <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo de Crescimento</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Placa de mídia </td><td> A 2xEMEM </td><td> A 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina. 2. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina, 0,2% Albumina de Soro Bovino, 0,025% de HEPES, DEAE-dextrano com 50 ug / ml. A. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com FBS a 5% (25 ml), 1% Mínimo essenciais Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato de sódio (5 ml), 1% de L-Glutamina (5 ml), 2% de Pen / Strep (10 ml). B. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), com 50 ug / ml, 0,025% de HEPES, DEAE-Dextrano, Tripsina-TPCK * * Pouco antes da preparação, adicione 1 ml por cada 25ml de 2 mg / ml de TPCK-tripsina à alíquota que será utilizado para misturar com agarose para placas. Tabela 2: Placa e Viral / Cellular Crescimento Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infecção </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> O tempo de incubação </td><td> 3 dias </td><td> 2 dias </td><td> 3 dias </td></tr></tbody></table> Soluções de sobreposição não irá expirar quando feito desde que a esterilidade seja mantida. Tabela 3: Sobreposições da <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 bem </td><td> 12 bem </td><td> 96 bem </td></tr><tr><td> N ° de células / poço </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volume de inóculo (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volume de sobreposição (ml) </td><td> 3 </td><td> 1,5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Formatos de Placa

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.4K visualizações.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Imunologia e Infecção

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biologia

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Plaquing de Vírus Herpes Simplex

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

Propagação de vírus e quantificação colorimétrica baseada em células

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Ensaio de placa: um método para determinar o título viral como unidades formadoras de placa (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

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Analyzing the Antigenic Relationship between Viruses using an Image-Based Microneutralization Assay

Source: Lin, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54897">Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relations between influenza A and B viruses. It provides a quantitative and visual way to assess the effectiveness of antibodies or other treatments in preventing viral infection.

Analisando a relação antigênica entre vírus usando um ensaio de microneutralização baseado em imagem

1. Virus Titration
NOTE: Depending on the number of viruses and the number of duplicates, a well plate can be set up with the following flexibilities: (1) ...

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Imaging and Visualization Techniques

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Determinando a eficácia antiviral de drogas experimentais por meio de um ensaio de placa

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

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