The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

NOT: Aşağıdaki protokol için biyogüvenlik düzeyi (BSL) potansiyel pandemik influenza virüs mevsimsel grip virüsleri ve BSL 3+ BSL 2 &#39;dir. Viral titrasyon, kontrol (VC) viral konsantrasyona karar vermek için bir nötralizasyon deneyi önceden gereklidir. 1. Virüs titrasyonu NOT: (1) viral seyreltme satırların veya sütunların (Şekil 1) ya birlikte düzenlenebilir: virüslerin sayısı ve çiftleri sayısına bağlı olarak, bir kuyu plaka aşağıdaki esneklikleri ile kurulabilir. Her virüs ayrı bir satır / sütun işgal etmelidir. (2) viral seyreltme artış esnektir, ancak sol üst köşedeki en yüksek viral konsantrasyona ile başlamalıdır. (3) çiftleri sayısında herhangi bir sınırlama yoktur. NOT: Madin Darby köpek böbrek (MDCK) ve MDCK-SIAT1 (SIAT) hücreleri nazikçe M. Matrosovich, Marburg, Ger tarafından sağlanmıştır10 çok. SIAT hücreleri kararlı bir şekilde insan CMP-N-acetylneuraminate ile transfekte MDCK hücreleri: sialik asit (SA) geliştirilmiş ekspresyon için olan B-galaktosid α-2,6-sialil-transferazı geni α2-6Gal terminasyonlu oligosakaritler. <ol><li> Kısım yeterli MDCK hücreleri veya MDCK SIAT hücreler 8 96 oyuklu plakalara (200 | al / ul). Izdiham ulaşmak için 2 ya da 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de inkübe hücreleri. % 10 ısıyla inaktive edilmiş cenin dana serumu (FCS) ve antibiyotik (100 U / ml penisilin ve / ml streptomisin, 100 ug) ile desteklenmiş DMEM içerisinde hücrelerin yayar. % 5 CO2 ve 1 mg / ml G418 sülfat ile 37 ° C &#39;de SIAT hücreleri inkübe edin. NOT: seyreltme faktörü deneyim ve kullanılan hücre hattı bağlıdır. Hücre tek tabaka birleştirilebilmeli gerekir (yani, hiçbir hücre duvarı ya da MDCK hücreleri ve MDCK-SIAT1 hücreleri için sıkıca paketlenmiş düzeni görebilir anahat) virüs aşılama sırasında. dilüsyonları örnekleri dayalıMDCK veya MDCK SIAT1 hücrelerinin konfluent şişe alt kültür Tablo 1 &#39;de verilmiştir. </li><li> oyuk başına virüs büyüme ortamında (BYM) 200 ul hücreleri 3 kez yıkayın. 30 dakika boyunca% 70 EtOH ile çok katlı levha yıkayıcı sterilize ve yıkamadan önce steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ya da VGM durulayınız. </li><li> VGM aspire ve hemen her kuyuya VGM 50 ul ekleyin. </li><li> (Test virüs ve çiftleri sayısına bağlı olarak, ya da daha az) 6 steril tüplere her birine VGM 900 ul ekleyin. Her bir seyreltme ile uçlarının değiştirilmesi, seyreltik seri birinci tüp içine virüsün 100 ul pipet karıştırın ve. her bir virüs için tekrar titre edilmesi. NOT: Bu 10 -6 10 -1 virüs dilüsyonları verecektir. </li><li> En yüksek dilüsyon başlayarak her bir virüs, seyreltme 50 ul ekle 9 çoğaltılmış oyuklara (Şekil 1 &#39;de Sütun 9 ve 10) ile (Şekil 1&#39; de 1 x 10 -5),6-çukurlu plaka. </li><li> Virüs hücreleri enfekte izin 2-3 saat boyunca 37 ° C&#39;de plaka koyun. NOT: 2 ila 3 saat inkübasyon inokulum virüsler tek tabaka ulaşmak için yeterli zamana sahip olmasını sağlamak için gereklidir. </li><li> kaplamayı hazırlayın (10 ml / plaka) NOT: Kaplama 2x DMEM, Tripsin (2 ug / ml nihai konsantrasyon), 20, 1 mg / ml stok ul, ve selüloz, pamuk linterleri, 5 ml (Malzeme Listesi bakınız), 5 ml oluşur. </li><li> inokulum çıkarın. </li><li> bindirme (her bir kuyunun 200 ul) ekleyin. Bozulmamış, 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. NOT: Virüs tomurcuklanan sonra yaklaşık 4 saat gerçekleşir, bu nedenle plaka bu saatten sonra rahatsız değil önemlidir. </li><li> Kuyulardan kaplamayı aspire. </li><li> PBS A buz soğukluğunda% 4 paraformaldehid ekleyin (200 ul / oyuk). 30 dakika ya da 20 dakika süre ile, oda sıcaklığında, 4 ° C&#39;de yerleştirin. Not: PBS 10 hareket doğal pH fosfat tamponlu serum fizyolojikF NaCl, KCl 0.25 g, Na 2 HPO 4 1.437 gr KH 2 PO 4 0.25 g, ve distile su 1 L (Malzeme listesine bakınız). NOT: Solunduğunda ve yutulduğunda yanıklara neden olabilir zaman Paraformaldehyde zararlıdır. Orada Kanserojen etki sınırlı kanıt da, ve cilt temasından sonra hassasiyete neden olabilir. </li><li> paraformaldehit aspire ve PBS A ile iki kez plakaları yıkaması (200 ul / oyuk). </li><li> ileride kullanım için 4 ° C&#39;de, PBS A plakaları mağaza ya da aşağıdaki adımlarla devam et. </li><li> permeabilizasyon tamponu ekleyin (100 ul / oyuk). 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> PBS A ile iki kez plaka yıkaması (200 ul / oyuk). </li><li> oyuk başına: (ELISA tamponu 1.000 1) birinci antikor, 50 ul, influenza A karşı fare mAb ekleyin. çalkalanarak 1 saat (ya da 4 ° C sıcaklıkta gece), oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponu (% 0.05 Tween 80, PBS, A, hacim / hacim olarak) p 100 ul 3 kez yıkayıniyi er. Yıkamalar arasında 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, kuyu başına 300 ul kullanarak inkübasyon olmadan o 3 kere yıkayın. </li><li> ikinci antikor, 50 ul ekle • Keçi anti-fare IgG (H + L) HRP konjügatı (1: ELISA tamponu 1000) ile sabitleştirilir. çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Adım 1.17 açıklandığı gibi o 3 kere yıkayın. </li><li> alt-tabakanın (50 ul / oyuk) ilave edin. 30 dakika süre ile ya da mavi bir renk gelişimi görülene kadar oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yıkamalar arasında 2 -3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, reaksiyonu durdurmak oyuk başına damıtılmış su, 200 ul iki kez plakayı yıkayın için. </li><li> Plaka Hava kurutun ve karanlık bir yerde (örneğin, alüminyum folyoya sarın) saklayın. </li></ol> 2. Titrasyon miktar tayini <ol><li> Şekil 2a&#39;da gösterildiği gibi, düz yataklı bir tarayıcının tarama alanında iyi olarak plaka koyun. L-şekil pozisyon limiti kullanoptimum ve tekrarlanabilir görüntüleme konumunu sağlamak. Not: Bu, bir tarama görüntü iki gözlü plakalara mümkündür. </li><li> bir görüntüyü taramak. NOT: Ayarlar Tablo 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> Gerekli virüs konsantrasyonu (Şekil 3) hesaplamak için &quot;well plate Reader&quot; yazılımını çalıştırın. <ol><li> Bir resim yüklemek için &quot;Load görüntü&quot; butonuna tıklayın. Örnekleme eşiğini ayarlamak için &quot;Küresel Eşik&quot; sekmesinin histogram kırmızı çubuk kaydırın. görüntü üzerindeki etkisini incelemek için &quot;Güncelle&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusunu işaretleyin. ICP ölçmek için &quot;Örnekleme&quot; düğmesine tıklayın. istendiğinde örnekleme sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesine tıklayın. NOT: &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusu işaretli ise örnekleme sürecinin ardından, &quot;Nötralizasyon &amp; Titrasyon Hesaplama&quot; olarak adlandırılan yeni bir pencere otomatik olarak belirir. </li><li>Yük veya giriş iyi plaka tanımlama haritası. &quot;: Optimal Virüs Nüfus (%) Titrasyon&quot; in eşiğine (örneğin,% 30) belirtiniz. titrasyon sonuçları hesaplamak için &quot;Titrasyon Süreci&quot; sekmesini seçin. titrasyon sonuçlarını kontrol edin. titrasyon sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet &amp; Kapat&quot; düğmesine tıklayın. NOT: Yazılımın ilgili daha ayrıntılı talimatlar için Ek S1 bakın. ısmarlama yazılımının bir kopyası istek üzerine mevcuttur. NOT: Genellikle, her bir kuyunun 11 içinde% 50 (20-85%) toplam hücre ICP etrafında plak azaltma tahlil getirileri için en iyi virüs seyreltme. </li></ol></li></ol> 3. Virüs Nötralizasyon Not: nötralizasyon tayini için gereken levha sayısını hesaplayın. Her plaka bir virüs ve antiserumlar bir dizi barındırabilir. Not: antiserumlar sayısı ve çiftleri sayısına bağlı olarak, bir yuvalı plaka th ayarlanabilirE, aşağıdaki esneklikleri: (1) serum seyreltisi, ya arka arkaya ya da bir sütun (Şekil 4) boyunca ayarlanabilmektedir. Her serum ayrı bir satır veya sütun işgal gerekir. (2) serum seyreltme artış esnektir, ama bir plakanın sol üst köşesinde en yüksek serum konsantrasyonu ile başlamalıdır. (3) çiftleri sayısı antiserumlar sayısını dengeler. Daha çiftleri deneysel varyasyonları düzeltmek için yardımcı olabilir. (4) VC sayısı ve hücre kontrolü (CC) çoğaltır esnek, ama onlar da ayrı satır veya sütun olmalıdır sayısı. VC çiftleri sayısının antiserumlar önemli ölçüde daha yüksek olduğunu tahmin edilmektedir. <ol><li> önceden 1.1-1.3, 2 ya da 3 gün adım olarak, hücre tekli tabakası hazırlayın. </li><li> plakanın her oyuğuna VGM 50 ul ekle. </li><li> sırasıyla, VC ve CC Sütunlar 11 ve 12 kullanın. Colum ilk satırında (A) ila 1:20 reseptör imha edici enzim (RDE) ile tedavi edilen, serum 50 ul alikotları eklemens 1-10. Not: her bir virüs, ve serum kombinasyonu için, deney iki kopya halinde gerçekleştirilir, bu nedenle bir levha, örneğin, bir virüs, beş antisera karşı test içerebilir. </li><li> Satır H. 50 ul (Şekil 4&#39;te Sütunlar 1-10) H Satır Satır A 50 ul aktarılması ve atarak seri seyreltiler 2 kat gerçekleştirin </li><li> CC kolonu (Şekil 4&#39;te Sütun 12) her bir kuyu için seyreltici 50 ul ekle. </li><li> CC sütun hariç plakanın her oyuğuna virüsün 50 ul ekle (sütun 1-11, Şekil 4&#39;te satır H.). </li><li> 2-3 saat boyunca 37 ° C &#39;de inkübe edin. inokulum çıkarın. her kuyuya kaplamayı (200 ul) ekleyin. Bozulmamış, 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe. Fix ve virüs titrasyon (1.11-1.22 adımlar) gibi plakaları leke. </li></ol> 4. Nötralizasyon Niceleme <ol><li> Figu gösterildiği gibi, düz yataklı bir tarayıcının tarama alanında iyi olarak plakasını2a yeniden. optimum ve tekrarlanabilir görüntüleme konumunu sağlamak için L-şekil pozisyon limiti kullanın. Not: Bu, bir tarama görüntü iki gözlü plakalara mümkündür. </li><li> aşama 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, levha tarama. </li><li> Gerekli viral titreleri (Şekil 3, adım 2.3) hesaplamak için &quot;well plate Reader&quot; yazılımını çalıştırın. <ol><li> Bir resim yüklemek için &quot;Load görüntü&quot; butonuna tıklayın. Örnekleme eşiğini ayarlamak için &quot;Küresel Eşik&quot; kırmızı çubuğu kaydırın. etkisini incelemek için &quot;Güncelle&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusunu işaretleyin. ICP ölçmek için &quot;Örnekleme&quot; düğmesine tıklayın. istendiğinde örnekleme sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesine tıklayın. NOT: &quot;Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon&quot; kutusu işaretli ise örnekleme sürecinin ardından, &quot;Nötralizasyon &amp; Titrasyon Hesaplama&quot; olarak adlandırılan yeni bir pencere otomatik olarak belirir. </li><li> İyi p yükü veya girişGeç haritası. Barajı (örneğin,% 50) işaret eder &quot;Nötralizasyon. Enfeksiyon azaltılmıştır (%)&quot; </li><li> titreleri hesaplamak için &quot;Nötralizasyon Süreci&quot; seçeneğini seçin. titreleri kontrol edin ve nötralizasyon sonuçlarını kaydetmek için &quot;Kaydet &amp; Kapat&quot; düğmesine tıklayın. Not: Nötralizasyon VC karşı önceden belirlenmiş bir ICP azalma (örneğin,% 50 ya da% 80 gibi) (Şekil 4&#39;te Sütun 11 ortalaması) ile en yüksek serum seyreltisi karşılığı olarak rapor edilir. % 50 ICP azalma Temsilcisi Sonuçlar kullanılmıştır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li>
<li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A%28H3N2%29+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A%28H3N2%29+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site%3A+a+role+in+virus+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li>
<li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+%28egg-derived%29+vaccine+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li>
<li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+%28H5N1%29+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol.37%22%5BJournal%5D)">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li>
<li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li>
<li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%3A+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li>
<li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents%2Fprobes+and+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+World+Summer+2005%22%5BJournal%5D)">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+alpha-2%2C+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li>
<li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada, biz virüsler arasındaki gerçek antijenik ilişkileri ölçmek için bir görüntüleme bazlı MN deneyi nitelendirdi. diğer plak azaltma deneyleri ile karşılaştırıldığında, yöntem enfektif nüfusun tam kapsama sağlanması tüm kuyunun ICP ölçüm vurgulayan. plak oluşumunun bağımsızlığı da çoğunlukla görünmez küçük plaklar oluşturabilir ya da sadece tek hücreli enfeksiyonu yönetebilir virüslere karşı testinin uygulanmasını genişletmektedir. Bu nedenle, tahlil daha fazla virüs ve HI daha antikorların daha geniş etkilerini inceleyen yeteneğine sahiptir ve daha kapsamlı antijenik benzerlik ya da virüsler 12 arasındaki farklılıkları yansıtmak için yardımcı olur. Örneğin, oseltamivir karboksilat dahil edildiğinde, MN tahlil az daha doğru antijenik farklılıkları yansıtan, bağlayıcı NA-bağımlı etkilenir. Testin geliştirilmesi sırasında, büyük çabalar deney tutarlılık, hız ve algılama geliştirmek için yapılmıştırduyarlılık, bir masaüstü tarayıcı ile yüksek verimlilik olarak quantitated titrasyon, görüntüleme yoluyla giriş virüsleri kontrol ederek de dahil olmak üzere, ve kullanıcı dostu bir veri işleme platformu uygulanması. Sonuçlar genellikle ile tutarlı ve HI olanlar doğruladı. Özellikle, sonuçlar aynı zamanda belirli A (H1N1) pdm09 virüslerin HA1 içinde G155E ikamesi olarak kültür-seçilmiş veya sporadik değişikliklerin neden olduğu son tip A ve B aşı virüslerinin antijenik sürüklenme varyantları arasında antijenik farklılıklar yanı sıra antijenik değişiklikler, ortaya 12. protokol büyük ölçüde görüntüleme sinyali gelişmiş güçlü enfeksiyon verdi hücre hatları seçimi ile virüs türü veya alt türü eşleşti. Deneysel varyasyon test antiserumlar sayısı ile dengeli çiftleri tasarımı ile düzeltti. Belirsizlikler de ağırlıklı görüntüleme cihazı etkilenir görüntü kalitesi, gelebilir. İyi bir renk flatbed tarayıcı signi olabilirficantly görüntü kontrastı artırmak ve gürültüyü azaltmak. virüsler hala benzer bir durumunu korumak ise nötralizasyon giriş virüs miktarı kantitatif ilgili titrasyon peşin tespit edilmelidir. Nötralizasyon sırasında bir enfeksiyona antiserum yanıt referans virüsü (VC) ve arka plan seviyesinin (CC) arasındaki farkın karşı normalize. VC ve CC hassas ölçümler bir nötralizasyon deneyinde için gereklidir. Daha çiftleri (sekiz çiftleri Temsilcisi Sonuçlar kullanılmıştır) tavsiye edilir. Son olarak, yazılım anlamak bir denemenin başarısı için hayati önem taşımaktadır. Yazılım iki yıldan fazla DSÖ İnfluenza Merkezi, İngiltere&#39;de rutin virüs karakterizasyonu için test edilmiştir. Çeşitli durumlarla başa çıkmak için ayrıntılı talimatlar Ek S1 sağlanır. Bu MN deney örnekleri bir dahili kapak uygulamalar için uygundurremely büyük görüş alanı ama sadece orta görüntüleme çözünürlüğü gerektirir. düşük maliyetli ve basit kurulum en viroloji laboratuvarlarında sistem hazır olun. Aynı numunenin ölçümleri varyasyon yaklaşık tarama sırasında 11 kişiye belirsizliği tanımlayan en az% 3 olmuştur. Bu tekrarlanabilirlik birçok viral çalışmalarında yeterli olduğu ve daha çok taramaları görüntü ortalama azaltılabilir. Sonuç olarak, bu çalışma rutin antijenik çalışmada kullanılabilir ve özellikle, insan influenza aşıları dahil virüslerin iki yılda bir seçimi için, influenza virüs şu anda dolaşan detaylı analizler HI verileri desteklemek için sağlam bir MN deneyi gösterir.

Mikro-nötrleştirme (MN) tahlilleri nötralize edici antikor miktarının belirlenmesi için ve antiviral etkinlikleri viroloji kullanılır. Hemaglutinasyon engellenmesinin bir alternatif olarak (HI) deneyleri, MN deneyleri HI yorumlanması 1,2,3 sonuçları karmaşıklaştırabilir reseptör bağlanma influenza virüsleri içinde afinite değişiklikler, etkilenmiş antijenik olmayan etkileri üstesinden gelebilir. Yakın zamana kadar, en çok MN deneyleri sitopatik etkiler (CPE) veya enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) 4,5 dayandırılmıştır. Odak ve plak azalmasına dayalı MN deneyleri 1990 6,7,8 geliştirilmiştir. Plak redüksiyon deneyleri enfektiviteyi ölçmek için görünür plaket sayma güveniyor. Ancak, görsel sayıları sadece plakların çoğunluğu küçük ve birçok güncel dolaşan virüs görünmez olsa, insan gözü tarafından çözülebilir olan büyük plaklar kapsamaktadır. Bu eksik kapsama i lider, sınav arasında ve deneyler arasında önemli varyasyon neden olabilirncomparable sonuçlanır. Bazı virüsler tek hücre ya da çok küçük plaklar başarısız enfeksiyon gösterdiğinizde yöntemi kullanmak da mümkün değildir. fakir sayım çözünürlük, bir görüntüleme tabanlı protokol girişi ile geliştirilebilir. Teknoloji, optik mikroskop ve yüksek verimlilik gelişmeler ile iyi plaka okuyucu enfekte hücreleri 9 saymak doğru araç sağlayabilir. trans-aydınlatmalı mikroskobu altında belirli bir belirteç ile etiketlenmiş enfekte olmuş hücreler alt-hücresel çözünürlükte absorpsiyon veya floresan Buna karşılık görüntülenebilir. Bir numune, bir bilgisayar ekranı üzerinde analiz edilebilir. Ne yazık ki, görüş alanı içinde sınırlama, yüzden fazla kiremitli görüntüleri tek bir kuyu kapağı için gereklidir. 96 çukurlu bir plaka analiz yaklaşık on bin görüntülerin görüntüleme ve işlem gerektirir. Bu zahmetli bir proses zaman alıcı ve pahalıdır ve elde edilen çözünürlük Cinslerviral enfeksiyonların rutin karakterizasyonu için gereksiz l. sınırlı bir bütçe ile laboratuvarlar bir masaüstü tarayıcı etrafında inşa yaklaşım maliyetli, yüksek hacimli bir alternatif sunuyor bulabilirsiniz. Bu yazıda, virüs büyük bir sayıda antijenik karakterizasyonu için ve nicel olarak, antiviral aktiviteleri ve nötralizasyon antikorları ölçmek için uygun olan bir gelişmiş diştaşı azaltma MN deneyi tarif eder. Deney çeşitli avantajları vardır: ilk olarak, ne olursa olsun, plak boyutu, hücresel seviyede virüs enfeksiyonları ölçebilir bir görüntüleme bazlı deneyidir. iyi içinde toplam enfekte hücre popülasyonu (ICP) Sayma büyük ölçüde mümkün düşük enfeksiyon ile virüsleri karakterize etmek için yapım, algılama hassasiyetini artırır. İkinci olarak, daha kesin bir niceliksel titrasyonu, giriş virüsünün miktarını belirlemek için nötrleştirme öncesi ilave edilir. Kantitatif giriş virüsü anlamlı değişkenden azaltırFarklı deneyler arasındaki laboratuarlarında arasındaki sonuçlar daha karşılaştırılabilir hale getirir. Üçüncüsü, nötralizasyon titreleri, görüntüleri analiz hızlı kantitatif yapma ve kullanıcı dostu doğrudan belirlenebilir. Son olarak, protokol gerekli çözünürlük ve doğruluk ile düşük maliyetli ve yüksek verimli bir alternatif sunuyor. kantitatif bir flatbed tarayıcıya ve ücretsiz veri işleme yazılımı dayanmaktadır. Tüm kurulum küçük bir ayak izi vardır ve çoğu laboratuvarlarda konuşlandırılabilir. Bu çalışmada sunulan protokol virüs titrasyon, titrasyon kantitatif, virüs nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört ana adımlardan oluşur. Virüs titrasyonu girişi virüs miktarı nötrleştirme kullanılacak belirleyen bir preparat denemedir. Bir titrasyon sırasında viral konsantrasyonları bir dizi 96 oyuklu bir plaka içerisinde, hücre mono tabakaları uygulanır. Enfekte hücreler daha sonra bölüm 2. Viral Dilu olarak nicelendirilir% 20-% 85 üretir tion ICP da karşılık gelen nötralizasyon giriş virüs olarak uygulanır bölüm 3. nötralizasyon protokolü titreleri bölüm yukarıdaki protokoller Temsilcisi Sonuçlar sunulmuştur ardından 4. Deneyleri kullanılarak ölçülür. Tahlil gibi A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri gibi güncel dolaşan influenza virüsleri, çoğu ile son iki yılda iyice test edilmiştir. İnfluenza virüsü karakterizasyonu sonuçları 2016 yılında Güney Yarımküre ve 2016-2017 yılında Kuzey Yarımküre&#39;de kullanılmak üzere influenza aşılarının önerileri verdi DSÖ istişare toplantısı için raporlara dahil edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strep&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl 10&amp;nbsp;g, KCl 0.25&amp;nbsp;g, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.437 g, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 0.25 g, and Dist. Water 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2.4 g in 100 ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Overlay (10 ml/plate):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Trypsin 2&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml final concentration, Avicell 5&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>Triton X- 100&lt;sup&gt;e&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T8787</td><td>Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>Wash Buffer: 0.05% Tween 80 in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td></tr><tr><td>Mouse MAb against influenza type A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2&lt;sup&gt;nd&lt;/sup&gt; Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu peroxidase substrate</td><td>KPL&amp;nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>Substrate: True blue +0.03% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;g&lt;/sup&gt; (1:1,000 of 30% solution)</td></tr><tr><td>96-well flat-bottom microtitre plates</td><td>Costar&amp;nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>8 channel multiwall-plate washer and manifold</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Perfection Plate Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>The imaging software can be downloaded freely from &lt;a href=&quot;http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;amp;infoType=Downloads&quot;&gt;http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;amp;infoType=Downloads&lt;/a&gt;.</td></tr><tr><td>Software operational environment: LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>Window based with NI Vision builder</td><td>Version: LabVIEW2012 or above</td></tr></tbody></table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Yukarıdaki prosedürlerin ardından, son antijenik karakterizasyon deneyleri bazı sonuçlarını sunmak. titrasyon kurulumu her seyreltme için çift çiftleri ile, sekiz giriş virüsleri incelemek için tasarlanmıştır. Viral seyreltileri virüsler arasında varyasyonlar kapsayacak -6 1.0 x -1 10 x 1.0 ila 1.0 test edilmiştir. Test virüsleri A / Kamerun / 15V-3538/2015 dahil olmak üzere H3N2 alt tipi, olduğumuzu A / Vladivostok / / 2015 36 A / Moskova / A / Tomsk / 5/2015 / A / Moskova / 101/2015 103 / 2015, A / Moskova / / 2015 100 A / Moskova / / 2015 133 ve A / Bratislava / 437/2015. Titrasyon sonuçları Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. Şekil 5d, virüs seyreltme artarak KİPler azalmasını göstermektedir. Eğrileri bir kuyunun 12 dahilindeki tüm hücrelerde enfeksiyonları vermiştir aynı virüslerin KİPler karşı normalize edildi (ICP doygunluk olarak tanımlanır). ICP hi ile doygunluk ulaşmak olmadıysale en yüksek virüs yoğunluğu, ilgili kopyalardan ICP ortalama yerine kullanılmıştır (A / Moskova / / 2015 103 Şekil 5d). ICP doygunluk% 30 üretilen virüs seyreltmeleri nötralizasyon (Tablo 3), giriş virüsünün seyreltme seçilmiştir. Nötralizasyon her tabakta çift çiftleri ile beş antiserumlar karşı bir giriş virüs amaçlanmıştır. gösterilen referans virüsü H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Beş antiserumlar olan A / HK 4801/14 Yumurta F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Güney Afrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / İsviçre 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, ve A / Hollandalı 525/14 SIAT F23 / 15. Nötralizasyon sonuçları Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. Şekil 6d serum seyreltme artması ile enfeksiyon ilerlemesini gösterir. Dikey eksende normalize pozitif nüfus ortalama ICP karşı gelen antiserumlar yanıtı KİPler oranını temsilReferans virüsünün 12. enfekte olmamış hücre kontrolleri arka plan ICP normalleşme sırasında çıkarıldı. Nötralizasyon titreleri% 50 ICP azalma (Tablo 4) karşılık gelen antiserumu seyreltileri reciprocals olarak belirlenmiştir. Doğrusal interpolasyon iki komşu serum dilüsyon arasında düşen titreleri tahmin etmek için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Şekil 1: Bir virüs titrasyonu deneyde iyi bir plaka ortamında örneği. Test virüsleri ayrı satır (H A) atanır. Kolonlar, farklı viral seyreltilerde (12 1) için tasarlanmıştır. Iki sütun, her viral seyreltme için kopya olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2: Örnek tarama sisteminin Şemalar. (A) düz yataklı tarayıcı görüntüleme konumunda bir 96 oyuklu plaka (arasında basılmıştır Elsevier BV kuruluşunun izni) ile 11 referans, ve (b) &#39;de gösterilen L-şekil pozisyon limiti boyutları (a). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Şekil 3: &quot;well plate Reader&quot; kantitatif yazılımı Masaüstü diyagramı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </p&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Şekil 4: bir nötrleştirme deneyde iyi bir plaka ortamında örneği. Her bir serumdan çiftleri (10 1) ile iki sütun atanır. Sıralar farklı serum seyreltmeleri (H&#39;ye kadar) için tasarlanmıştır. virüs kontrolü sekiz çiftleri (H11 için A11) ile, Sütun 11 alır. hücre kontrolü sekiz çiftleri (H12 A12) ile, Sütun 12 olduğunu. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Şekil 5: bir titrasyon deneyinin sonuçları. (A) iyi plaka kurulum, (b) iyi plaka Taranan görüntüyü, (c) çizimRenk kodlu, niceliksel, virüs ile enfekte olmuş hücre popülasyonu ve virüs seyreltmeleri karşı (d) normalize virüs ile enfekte olmuş hücre popülasyonlarının. % 30 ICP eşik değeri olarak kullanılmıştır. (D) hata çubukları örnek duplications (± 1 SD) standart sapmalar (SD) vardır. (B) ve (c) &#39;de Ölçek çubukları 10 mm =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Şekil 6: Bir nötralizasyon deneyi sonuçları. (A) Her bir plaka ortamında, (b) de plaka görüntü hesaplanır, virüs ile enfekte olmuş bir hücre popülasyonu (C) Çizim ve serum seyreltme karşı (d) normalize virüsü ile enfekte olmuş hücre popülasyonu taranır. giriş virus (VC) A / Stockholm / 63/2015. % 50 ICP titrelerini hesaplamak için kullanıldı. (D) hata çubukları örnek duplications (± 1 SD) standart sapmalar (SD) vardır. (B) ve (c) &#39;de Ölçek çubukları 10 mm =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ek S1: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> Tipik seyreltme </td></tr><tr><td></td><td> MDCK hücreleri </td><td> MDCK hücreleri, SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 gün </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 oranında (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 gün </td&gt; <td> 1:10 oranında (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Ml başına hücre sayısı tipik </td></tr><tr><td></td><td> MDCK hücreleri </td><td> MDCK hücreleri, SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 gün </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 gün </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: MDCK veya MDCK-SIAT1 hücrelerinin Birleşik kaplardan bir altkültür üzerinde tipik dilüsyonları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> kip </td><td> profesyonel Mod </td></tr><tr><td> Belge Türü </td><td> Film (Film Alan Rehberi) </td></tr><tr><td> Otomatik Poz Türü </td><td> Fotoğraf </td></tr><tr><td> Benyaş Tipi </td><td> 24-bit Renkli </td></tr><tr><td> çözüm </td><td> 1200 dpi </td></tr><tr><td> Kaydedilen görüntü Biçimi </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tablo 2: bir masaüstü tarayıcı Tipik kurulum. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sıra </td><td> Virüs </td><td> Tavsiye edilen seyreltme </td></tr><tr><td> bir </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1.0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1.0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Moskova / 103/2015 </td><td> 1.1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Moskova / 101/2015 </td><td> 8.3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moskova / 100/2015 </td><td> 1.4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / Moskova / 133/2015 </td><td> 1.3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1.3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tablo 3:% 30 ICP nüfusu hesaplanan Viral dilüsyonlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sütun </td><td> antiserumlar </td><td> Önerilen titre </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / Güney Afrika / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7 - 8 </td><td> A / İsviçre / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9 - 10 </td><td> A / Hollanda / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: A / Stockholm% 50 ICP / antiserumlar karşı 63/2015 titreleri.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Bu çalışma, bir açıklar görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.1K Görüntüleme.  The Francis Crick Institute.  Bu çalışma, bir açıklar görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır. 

Video: Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Sentetik Oligonükleotidler Kullanılarak DNA Enzimleri için Deneyler

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Yazar Spotlight: DNA Onarımını ve Replikasyonunu Anlamak için Ekstremofillerden ve Yaygın Patojenlerden Yeni Enzimlerin Karakterize Edilmesi

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

Biyokimya

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The characterization of these anti-drug antibodies (ADA), especially those that may neutralize the biological activity of the drug, termed neutralizing antibodies (NAbs), is crucial in understanding the effects of these antibodies on the drug&#39;s pharmacological profile. This protocol describes a cell-based flow cytometry method to detect factors that neutralize the cellular uptake of a representative lysosomal ERT in human matrix. The protocol consists of three procedures: screening, a confirmatory step, and titer assays to detect, identify, and establish the relative level of neutralizing antibody titer in subject samples.
In this method, samples are first mixed with the fluorophore-conjugated ERT product, then incubated with cells [e.g., human T lymphocytes (Jurkat cells)] that express a cell-surface cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CI-M6PR), and finally, analyzed with a flow cytometer. A sample without NAbs will result in the uptake of the fluorophore-conjugated ERT product via CI-M6PR, whereas, the presence of NAbs will bind to the drug and interfere with the CI-M6PR binding and uptake. The amount of the fluorophore-conjugated ERT internalized by the Jurkat cells is measured by flow cytometry and evaluated as the percentage (%) signal inhibition compared to the response obtained in the presence of a representative drug-na&#239;ve matrix. In the confirmatory step, the samples are pre-incubated with ERT-conjugated magnetic beads to deplete drug-specific factors that bind to the drug (such as NAbs) prior to an incubation with cells. Samples that screen and confirm positive for drug-specific NAbs in the assay are then serially diluted to generate an antibody titer. Semi-quantitative antibody titers may be correlated with measurements of drug safety and efficacy.

Here we present a cell-based flow cytometry method to detect neutralizing antibodies or other factors that interfere with the cellular uptake of enzyme replacement therapies in a human matrix, such as cerebral spinal fluid (CSF) or human serum.

Enzim replasman terapileri ile hücre tabanlı tahlil hücresel alımını nötralize antikorların tespiti

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel pathogens, such as SARS-CoV-2. Multiplex serological testing can be particularly useful because it can simultaneously analyze antibodies to multiple antigens that optimizes pathogen coverage, and controls for variability in the organism and the individual host response. Here we describe a SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescent microsphere-based assay that can detect both IgM and IgG antibodies to three major SARS-CoV-2 antigens-the spike (S) protein, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD), and nucleocapsid (Nc). The assay was shown to have comparable performance to a SARS-CoV-2 reference assay for IgG in serum obtained at &#8805;21 days from symptom onset but had higher sensitivity with samples collected at &#8804;5 days from symptom onset. Further, using soluble ACE2 in a neutralization assay format, inhibition of antibody binding was demonstrated for S and RBD.

A flow analysis system for bead-based multiplexed assays which provides a two-reporter readout was used for the development of multiplex serological and antibody neutralization assays that can simultaneously measure neutralizing IgG and IgM antibodies for SARS-CoV-2.

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Biyoloji

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Yordam ve anahtar optimizasyon stratejileri için bir otomatik Kapiler elektroforetik tabanlı Immunoassay yöntemi

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

Enzim replasman terapileri ile hücre tabanlı tahlil hücresel alımını nötralize antikorların tespiti

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Yordam ve anahtar optimizasyon stratejileri için bir otomatik Kapiler elektroforetik tabanlı Immunoassay yöntemi

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem