We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Herstellung der Zellen und Reagenzien <ol><li> Der Tag vor dem Test, Platte geeignete Wirtszellen für das Virus in Frage (Tabelle 1 und 2) bei 90 bis 100% Konfluenz. </li><li> Vorbereitung Fixierlösung von 10% Formaldehyd in dH 2 O. In Beispiel mischen 5,56 ml 36% stock Formaldehyd mit 14,44 ml destilliertem H 2 O (dH 2 O). HINWEIS: Verwenden Sie geeignete sicheren Handhabung zu und Lüftung bei der Verwendung von Formaldehyd. </li><li> Vorbereitung Kristallviolett-Färbung: 1% Kristallviolett (CV) in 20% Ethanol und dH 2 O. </li><li> Bereiten 2x Plaque Medien (Zelltyp abhängig zu 2x Konzentration; siehe Tabelle 2). Filter mit einem 0,2 um Filter, wenn irgendwelche Reagenzien sind nicht steril. </li><li> Vorbereitung der Immobilisierung Overlays (Tabelle 3) <ol><li> Für flüssige Overlays, machen Sie eine sterile 2,4% ige Lösung von Avicel in dH 2 O. Um ein Verklumpen zu verhindern, fügen Sie das Pulver in einen Kolben Wasser mit thbei rasch Mischen mit einem Rührstab, gießen Avicel langsam und rühren schnell bei Raumtemperatur (RT). Wenn die Lösung als zu viskos für ein Rührstab zu homogenisieren, zu einem Kolbenschüttler für&gt; 30 min wechseln mit schweren Agitation sogar Homogenisierung zu gewährleisten. HINWEIS: Die Stammlösungen kann bei geringeren Konzentrationen hergestellt werden, aber die Lösungen getrennt und müssen wieder gemischt, um die Homogenisierung zu gewährleisten. Arbeitslösungen Avicel kann reichen von 0,6 bis 3% werden. </li><li> Nach der Homogenisierung Autoklaven die Lösung und lagern bei RT versiegelt. </li><li> Für Agarose und Carboxymethylcellulose (CMC) Overlays, bereiten eine Stammlösung in dH 2 O 2% CMC oder 0,6% Agarose. Mischen Sie mit einem Rührstab und Autoklaven oder Mikrowelle, um in Lösung zu bringen. </li></ol></li></ol> 2. Verdünnungen und Infektionen <ol><li> Am Tag nach der Beschichtung, Sichtprüfung der Konfluenz und Lebensfähigkeit der Zellen vor dem Start des Assays. Stellen Sie sicher, Standardzellmorphologie einnd a ~ 90% konfluenten Monolayer vorhanden. </li><li> Führen Sie eine Verzehnfachung serielle Verdünnung der infektiösen Proben. Verwenden der zellulären Wachstumsmedien für die Virusvermehrung als Verdünnungsmittel (Tabelle 2). Variieren Sie die Anzahl der Verdünnungen auf Basis der erwarteten Titer des Virus in Frage erforderlich, und immer eine nicht-infizierten Kontrollprobe zu verwenden, um unabhängig zu gewährleisten zelluläre Lebensfähigkeit und Hilfe bei der Plaque-Identifikation. </li><li> Aus den seriellen Verdünnungen, infizieren die Zellen für 45 min bis 1 h (Tabelle 1). Verwenden ein ausreichendes Volumen des Inokulums, die Zellen abdecken, während das Volumen so gering wie möglich, um virale Kontakt mit der Monoschicht (Tabelle 4) zu maximieren. Sanft Felsplatten alle 20 min, um sicherzustellen, gleichmäßige Abdeckung und verhindern, dass die zelluläre Monoschicht vor dem Austrocknen. </li><li> Nach der Infektion überlagern eines geeigneten Volumens der Immobilisierung Medium direkt auf die Inokula in der Vertiefung (Tabelle 2) unter Verwendung eines 1: 1-Mischung von 2 x Medium und dem Plaque immobilizing-Overlay der Wahl (CMC, Agarose oder Avicel). Schaukeln zu mischen. <ol><li> Für flüssige Overlays, mischen Sie 1: 1 mit erwärmt 2x Plaque Medien und 1,2-2,4% RT stock Avicel um eine Arbeitslösung von 0,6-1,2% Avicel Overlay Medium zu erhalten. </li><li> Für eine Agarose-Overlay, verwenden Sie eine 1: 1-Mischung aus erwärmt 2x Plaque Medien und eine Stammlösung von beheizten 0,6% Agarose, in einem 56 ° C Wasserbad für 30 min, um die Temperatur Erhalt einer endgültigen Agarose / Overlay Konzentration von 0,3 ins Gleichgewicht %. </li><li> Für CMC, bereiten eine 2% ige Stammlösung und Behandlung wie für die Agarose-Overlay beschrieben. </li><li> Bei der Anwendung der Überlagerung zum Monoschicht immer äquilibrieren heißen Agarose oder CMC in einem 56 ° C Wasserbad, um Schäden an der Monoschicht zu verhindern. Stellen Sie sicher, die Lösung ist warm, aber nicht zu heiß zum Anfassen, Zelltod und geringere virale Titer verhindern. Die meisten Agarose Overlays beginnt unter 42 ° C erstarren, arbeiten schnell und / oder bereiten kleinen Chargen, um eine Verfestigung zu verhindern, während der Handhabung. </li></ol></li><li> Nach Zugabe des Overlay, Inkubation Platten deutliche Plaques, die eindeutig zählbare zu produzieren. Plaquebildung kann dauern 2-14 Tage, je nach Virus analysiert, Tabelle 1. HINWEIS: Sobald Flüssigkeit übereinandergelegten Platten werden in den Inkubator gestellt, nicht bewegen. Bewegung der Flüssigkeit Overlays während der Inkubationszeit wird in geschmiertem Plaques führen. Agarose und CMC Overlays sind halbfeste und können verschoben oder periodisch unter einem Lichtmikroskop überprüft, um Plaqueentwicklung zu überwachen. </li></ol> 3. Fixierung und Färbung Cells <ol><li> Um die Zellen zu fixieren, abgießen oder absaugen Avicel-Overlay, und fixieren Zellen unter Verwendung des 10% Formaldehydlösung für 30 min über Nacht (&lt;1 ml pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte). <ol><li> Für Agarose oder CMC, direkt fügen Sie die Formaldehyd-Lösung, um die Überlagerung für 1 h bis über Nacht. HINWEIS: Die Proben können für längere Zeiträume in dem Fixiermittel gehalten werden, sofern sie dannnicht verdunsten und austrocknen, da dies die Monolage verzerren. </li></ol></li><li> Vor der Färbung und nach der Fixierung, entsorgen Sie die Formaldehyd und entfernen Sie die halbfesten Stecker für die Agarose und CMC entweder mit fließendem Wasser oder manuell mit einem Spatel. Spülen Avicel Plaques mit Wasser auf Rest Overlay / Fixiermittel vor der Färbung zu entfernen. </li><li> Zum Färben, decken die Zellen mit einer minimalen Menge an Kristallviolett-Lösung für ca. 15 min. Felsplatten, wenn notwendig, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten. </li><li> Vorsichtig waschen den Kristallviolett-Färbung mit Wasser. Einmal fixiert, gefärbt und getrocknet, speichern Plaques auf unbestimmte Zeit für eine spätere Analyse. </li></ol> 4. Bestimmung Virustiter <ol><li> Zählen Sie die Plaques in jeder Vertiefung, wobei die durchschnittliche für technische Wiederholungen des gleichen Verdünnung. Für große Plattenformate, Discount Brunnen mit weniger als 5 oder mehr als 100 Tafeln. Beachten Plaquegröße und Morphologie. Die Negativkontrolle sollte eine einheitliche Mono haben undals Referenzkontrolle verwendet werden. </li><li> Bestimmen Sie die virale Titer des Aktien Probe, indem die durchschnittliche Anzahl der Plaques für eine Verdünnung und dem Kehrwert der Gesamtverdünnungsfaktor. </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> HINWEIS: Als ein Beispiel, 30 und 32 Plaketten für Wiederholungen der 1 x 10 -7 Verdünnung [31 (Durchschnitt) / 10 -7 (Verdünnung) x 0,4 ml (Inokulum)] würde einen Titer von 7,75 erhalten x 10 8 pfu gezählt / ml.

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The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche Plaque-Assay liegt in der Optimierung des Protokolls für die bestimmte Viruskultur in Frage Bedingungen erheblich variieren kann. Wichtige Punkte zu berücksichtigen sind: Gastgeber zelluläre Verträglichkeit mit dem Virus in Frage, geeigneten viralen Wachstumsbedingungen, ausreichende Verdünnung reicht, um genau zu differenzieren Plaketten und korrekte Überlagerung Auswahl und Färbung für die Zellen und Viren im Frage. Während VEEV und RVFV sowohl unter sehr ähnlichen Bedingungen unter Verwendung von vielen der gleichen Wirtszellarten wachsen, Unterschiede in der Plaque-Morphologie und Wachstumskinetik erheblich variieren. Bei der Verwendung von Vero-Zellen für die Plaque-Assays, die traditionell als die Ausbreitung und die Indikator-Zelllinie für hämorrhagische Fieberviren und Alphaviren verwendet wurden, wächst VEEV typischerweise zu höheren Titern als RVFV und zeigt erhöhte Replikationskinetik, Entwicklung großer Uniform Plaques bei 48 hpi 4, 10-12. Im Gegensatz zu VEEV, RVFV erfordert 72 hpi und zeigt Plaques, die in der Regel wesentlich kleiner sind und in der Größe variabel. Im Gegensatz zu RVFV und VEEV ist das Influenza-Virus hochWirtsZelle spezifisch und können schwer durch Gewebekultur fortpflanzen. Für das Influenza-Virus, Viruseintritt und Fusion normalerweise durch die Bindung von Zelloberflächenrezeptors mit dem viralen Glycoprotein hamagglutinin (HA), die den Eintritt in die Zielzelle durch Bindung mit der Wirtszelle α-Sialinsäure-Oberflächenrezeptor vermittelt eingeleitet. HA ist ein Glykoprotein, das trimere im Membranhülle aller Influenza-Viren vorhanden ist und erfordert Spaltung in die Untereinheiten HA1 und HA2 durch eine spezifische Wirtszelle Protease. Um das Problem weiter zu komplizieren, können diese Schnittstellen oft schwanken zwischen Virusstämmen 13. Da die Expression von Proteasen spalten kann HA ist auf bestimmte Gewebe beschränkt, Proteasen are häufig Zellkulturmedien, um die viralen Fusion und den Eintritt in die ausgewählte Wirtszelle 13 zu erleichtern zugegeben. TPCK-Trypsin ist ein Beispiel eines üblicherweise verwendeten Protease, die in der Zellkultur sowohl mit MDCK und Vero-Zellen verwendet wird: Erleichtern Multizyklus-Replikation (in Ermangelung einer Trypsin zu inaktivieren Serum) durch die proteolytische Aktivierung der viralen HA 14,15. Wie in dieser Studie und andere zeigten, können Unterschiede in der viralen Lebenszyklen Overlay Selektionen, Plattenformate und Abholzeiten, mit erheblichen Abweichungen zwischen den unterschiedlichen Klassen und Arten von Viren beeinflussen. In unserer Studie zeigte Agarose Overlays klarer Plaques bei höheren Titern als entweder CMC oder flüssigen Overlays für beide RVFV und Influenza-B-Virus, Verstärkungs ihre Nutzbarkeit unter einer breiten Palette von Viren und Zelltypen. Mit einem niedrigen Endkonzentration von Agarose stark bei der Beseitigung der festen Stecker und vereinfachte Färbung unterstützt. CMC Gesamt demonstrierte die poorest Wirksamkeit als Overlay für alle drei getesteten Viren und produziert sehr klein und undeutlich Plaques für Influenza-B-Virus. Obwohl insgesamt CMC zeigten die am wenigsten wünschenswerte Eigenschaften, die Nutzung im schnell wachsenden und vorteil extrem virulenten Viren nachweisen konnten, wie es tat scheinen Plaquegröße mit nur einem minimalen Rückgang der Titer zu reduzieren. Die Flüssigkeit erwies sich als Überlagerung der vielseitigste daß sein war es extrem einfach herzustellen, erhöhte Leichtigkeit der Verwendung und war vergleichbar mit der in allen ausgewählten Viren Agarose. In einem höheren Durchsatz 96-Well-Platte-Format, Anlegen und Entfernen nicht aufgrund der Verfestigung wie bei herkömmlichen Überlagerungen verhindert wird, und sofern genaue und konsistente Ergebnisse. Eine Überlegung bei der Verwendung von flüssigen Überlagerungen liegt in der undurchsichtigen Färbung und die Unfähigkeit, die Plaquebildung zu überwachen, wenn die Platten nicht bis zum Sammelpunkt bewegt werden, begrenzen diese Anpassung an Viren mit bereits charakterisierten Replikationskinetik. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Kleinere Änderungen in der Plaque Assay-Bedingungen können die Ergebnisse erheblich verändern, und die Auswertung und Leistungsfähigkeit jedes neue System oder Technik ist immer gewährleistet. Während eine optimierte und standardisierte Plaque-Assay-Protokoll nicht für jede Situation gibt, unserem Bericht zeigen die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit in der traditionellen als auch neuen flüssigen Overlays für Plaque-Assays, während eine ausreichende Basis für weitere Benutzer Modifikationen.

Die genaue Trennung und Quantifizierung von lebensfähigen viralen Proben war stets eine laufende Forschungsziel in der Virologie. Es war nicht bis zum Aufkommen des Plaque-Test im Jahr 1952, die ein Mittel, um quantitativ und qualitativ zu berechnen Tier virale Titer wurde zuerst entwickelt, 1,2. Diese Technik wurde erstmals angepasst und aus Phagen-Assays, die zuvor verwendet worden war, um die Titer von Aktien Bakteriophagen in Pflanzenbiologie 1,2 berechnen modifiziert. Während alternative Mittel für virale Quantifizierung seit entwickelt und angepasst worden ist, wie Immunoassays, Fluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie, abstimmbaren resistive Erfassungsimpuls (TRPS), Durchflusszytometrie, rekombinante Reportersysteme und quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Diese Methoden versagen zu identifizieren und zu quantifizieren replikationskompetentem Vironen 1,3. Während Fortschritte in Technologien und Techniken weiter zu verfeinern und verändern die Landschaft; PLATEe-Assays weiterhin den Goldstandard bei der Bestimmung viralen Konzentrationen für Infektions lytische Vironen 1,4 darstellen. Während eines Plaque-Assays wird eine konfluente Monoschicht von Wirtszellen mit einem lytischen Virus unbekannter Konzentration, die in Reihe mit einem zählbaren Bereich zwischen 5-100 Virionen verdünnt wurde, typischerweise infiziert. Infizierten Monoschichten werden dann mit einem Immobilisierungsmittel Deckungsmedium bedeckt, um eine virale Infektion von wahllos Ausbreitung durch entweder die mechanische oder konvektiven Strömung des flüssigen Mediums während der Virusvermehrung verhindern. Während feste oder halbfeste Overlays wie Agarose, Methylcellulose oder Carboxymethylcellulose (CMC) haben traditionell verwendet worden, haben Flüssigkeitsüberlagerungen eine zunehmend attraktive Alternative mit der Entwicklung von neuartigen flüssigen Overlays werden wie Avicel 5- 7. Plaque Assays Flüssigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Overlays haben mehrere Vorteile, wie das Overlay kann applbei Raumtemperatur und Auftragen und Entfernen IED erheblich. Als flüssige Overlays nicht Erwärmung erfordern, kann zart und hitzelabilen Viren auch beweisen, leichter Plaque. Nach der Erstinfektion und Anwendung der immobilisierenden Overlay einzelnen Plaques oder Zonen der Zelltod wird, beginnen sich zu entwickeln, wie virale Infektion und Replikation in die Umgebung Monoschicht eingeschränkt. Infizierte Zellen wird die Replikation-Lyse-Infektionszyklus fortzusetzen, weitere Vermehrung der Infektion, was zu immer deutliche und diskrete Plaques. Je nach Virus Wachstumskinetik und Wirtszelle verwendet wird, eine sichtbare Plaques bilden normalerweise innerhalb von 2-14 Tagen. Cellular Monoschichten können dann mit einem Standard-Hellfeld-Mikroskop, um ohne weiteres zu identifizieren Plaques mit dem bloßen Auge gezählt werden, oder typischer fixiert und durch Neutralrot oder Kristall gewaltsamen gegengefärbt. Es gibt eine Vielzahl von Plaque Gegen Flecken vorhanden, die jeweils thEIR spezifische Vor- und Nachteile. Kristallviolett ist üblicherweise am Ort der Sammlung und nach der Fixierung / Entfernen der Auflage aufgenommen, wodurch eine rasche und ausgeprägte Gegenfärbung, die für die Identifizierung von sehr kleinen Plaques können, wenn gemischte Morphologie vorliegt. Neutral Rot hat den Vorteil der frühen Anwendung und ständigem Kontakt mit dem Overlay, so dass für die Live-Überwachung der Entwicklung von Plaque-Bildung, was besonders nützlich ist, wenn die Arbeit mit einem unbekannten Virus oder Replikationskinetik. Wir haben jedoch festgestellt, dass Färbung ist in der Regel nicht so deutlich bei der Verwendung von Neutralrot. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid (MTT) bietet einige Vorteile, da die gelben Farbstoff Flecken lebende Zellen dunkelblau und viralen Plaques können ohne Entfernen der Auflage angerechnet werden mit Neutralrot. Der hohe Kontrast zwischen lebenden und toten Zellen durch MTT ergab ermöglicht auch die Erkennung von kleinen Plaketten zu einem früheren Zeitpunkt nach der InfektionObwohl Speicher würde immer noch die Entfernung des Overlay-8 erforderlich. Als Kristallviolett können einfach in einer Lösung aus Wasser und Alkohol hergestellt werden und bietet ein hohes Maß an Sensibilität für gemischten Plaquemorphologie, haben wir es als eine bevorzugte und vereinfachte Gegenfärbung ausgewählt für das Protokoll gezeigt, wie wir nutzen mehrere Familien gut dadurch Viren. Nach Fixierung und Färbung der infizierten Zellmonolayer werden Plaketten um Virusstammproben im Hinblick auf die Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter titrieren gezählt. Eine Protokollabfall sollte zwischen serielle Verdünnungen angemerkt werden, und je nach Plattengröße zwischen 5-100 Plaques gezählt, mit einer Negativkontrolle als Referenz verwendet. Statistisch Proben um 10% auf 100 Plaques gezählt beim Vergleich Probe repliziert 3 variieren. Der Vorteil der Verwendung von Plaque-Assays auf Virus-Titer zu bestimmen, liegt in ihrer Fähigkeit, die tatsächliche Anzahl der infektiösen Viruspartikel w quantifizierennnerhalb der Probe. Als mehrere Virionen könnte eine einzelne Zelle zu infizieren, ist die Terminologie der Einheiten über Virionen während der Plaque-Titration 1,2 verwendet. Plaquemorphologie können dramatisch unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und zwischen Virusspezies variieren. Plaquegröße, Klarheit, Grenz Definition und Verteilung sollten alle beachten, da sie wertvolle Informationen über die Wachstums- und Virulenzfaktoren des Virus in Frage stellen werden. Grundprinzipien Plaque-Assay kann auch angepasst und in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, wie beispielsweise bei der Verwendung der Schwerpunkt bildet Assays (FFAs) modifiziert werden. FFS nicht auf Zell-Lyse und Gegenfärbung verlassen, um die Plaquebildung zu erfassen, sondern beschäftigen Immuntechniken, um intrazelluläre virale Proteine ​​direkt zu erfassen durch getaggt Antikörper. Erhöhte Sensitivität, verringerte Inkubationszeiten nach Infektion und vor allem die Möglichkeit, zu quantifizieren nichtlytischen Viren sind alle verschiedenVorteile beim Einsatz von FFS. Während weit verbreitet, die kritischen begrenzenden Faktoren in FFAs gegenüber einem herkömmlichen Plaque-Assays besteht in der Notwendigkeit, geeignete Antikörper und die Fähigkeit, nur Sonde für die virale Proteinuntereinheiten und tatsächliche infektiösen Virionen 4. Für die Zwecke dieser Studie werden wir unsere Diskussion auf klassische Plaque-Assays zu begrenzen und die Verwendung von traditionellen festen und halbfesten Overlays (Agarose und CMC), zusammen mit neuen flüssigen mikrokristalline Cellulose-Overlays.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Plaque-Assays bleibt eines der genauesten Methoden zur direkten Quantifizierung von infektiösen Virionen und antivirale Substanzen durch die Zählung der einzelnen Platten (infektiöse Einheiten und zellulären Totzonen) in Zellkultur. Hier zeigen wir, wie man eine Grund Plaque-Test durchzuführen, und wie unterschiedliche Overlays und Techniken können die Plaquebildung und die Produktion auswirken. Regel feste oder halbfeste Overlay-Substrate, wie Agarose oder Carboxymethylcellulose, verwendet worden, um die Virusausbreitung zu begrenzen, verhindern, unterschiedslose Infektion durch das flüssige Wachstumsmedium. Immobilisiert Overlays beschränken Zellinfektion mit dem unmittelbar umgebenden Monoschicht, welche die Bildung von diskreten zählbaren Foci und die anschließende Bildung von Plaque. Um die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit traditionellen Overlays zu überwinden, ein neuartiges Flüssigkeitslagerung Verwendung mikrokristalliner Cellulose und Carboxymethylcellulose Natrium wurde zunehmend als Ersatz in der Standard verwendetPlaque-Test. Flüssig-Overlay Plaque-Assays können leicht in Standard 6 oder 12-Well-Platte Formate nach traditionellen Techniken durchgeführt werden und erfordern keine spezielle Ausrüstung. Aufgrund seiner flüssigen Zustand und die anschließende einfache Anwendung und Entfernung kann Mikrokulturplattenformate alternativ als schnelle, präzise und mit hohem Durchsatz Alternative zu größeren Maßstab viralen Titrationen verwendet werden. Verwendung eines nicht beheizten viskose Flüssigkeit Polymer bietet die Möglichkeit, die Arbeit zu rationalisieren, schont Reagenzien, Inkubator Raum und erhöht die Betriebssicherheit, wenn in traditionellen oder High-Containment-Labors wie kein Reagenz Heizung oder Glaswaren verwendet benötigt werden. Flüssige Overlays kann sich auch als empfindlicher als traditionelle Overlays für bestimmte hitzelabilen Viren.

Die Fähigkeit von Plaque-Assays, genau zu beurteilen Virustiter beruht auf zahlreichen Faktoren: geeignete Wirtszelle Auswahl geeigneten Medien und Wachstumsbedingungen für die zelluläre und virale Lebensfähigkeit immobilisierten Virusausbreitung und eine genaue Bestimmung des viralen Inkubationszeit, um eine angemessene Zeit für verschiedene ermöglichen und zählbare Plaquebildung. Für diese Studie wurden Viren aus drei repräsentativen Familien gewählt, um Unterschiede in der zeigen: Overlay-Auswahl, Inkubationszeiten und Plaquemorphologie in unterschiedlichen Probenarten. Venezolanischen Pferde-Enzephalitis (VEEV) wurde als (+) ssRNA Virusmodell, das bedeutende Krankheit bei Equiden und Menschen verursachen und stellt die Familie Togaviridae ausgewählt. Influenza B Taiwan Stamm, einem segmentierten (-) ssRNA-Virus vor allem Menschen infizieren, stellt die Familie Orthomyxoviridae. Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV), ein (-) ssRNA Arthropoden geboren Virus primär infizieren Arthropoden,Wiederkäuer und Menschen wurde als Vertreter der Familie Bunyaviridae ausgewählt. Für RVFV (Figur 1), wurden die Titer aus einer Stammlösung eines rekombinanten lebenden attenuierten Stamm von MP12 RVFV in einer 12-Well-Plattenformat unter Verwendung CMC, Agarose oder Avicel Overlays, die Seite-an-Seite für 72 Stunden nach der Infektion inkubiert wurden bestimmt (hpi). Ein Vertreter Schild mit Verdünnungen im Bereich von 10 -4 bis 10 -7 in Feld A. Plaques mit CMC zu sehen und Agarose Overlays zeigten kleine, klare und deutliche Plaques mit einem gut definierten Kreisgrenze. Plaques mit einer Flüssigkeit Overlay waren etwas reichlicher und im Vergleich zu Agarose und CMC Plaques größer, und lieferte eine weniger deutliche Grenze. Virustiter wurden in Tafel B mit allen Überlagerungen vergleichsweise Führen verglichen. Um eine klarere visuelle Vergleich zwischen Overlays für MP12 zusammen mit einer größeren Stichprobenumfang zu bestimmen Reproduk erhaltenbilität wurde eine 6-Well-Platte auch in dreifacher Ausführung (Abbildung 2) erprobt. In der 6-Well-Plattenformat, die Verwendung eines CMC-Overlay zeigten kleinere Plaques als entweder Agarose oder Flüssigkeitsüberlagerungen, die in der Größe miteinander vergleichbar waren. Während virale Titer waren ähnlich zwischen allen drei Überlagerungen (Tafel D), erwies sich Plaques in Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen gebildet leichter zu zählen wegen ihrer erhöhten Größe. Im Gegensatz RVFV, VEEV Titer und Plaquemorphologie zwischen den unterschiedlichen Überlagerungen stark variiert (3A). Plaques in CMC Overlays gebildet zeigte eine klare und deutliche Morphologie bei Verwendung einer 12-Well-Plattenformat, auf Kosten der Plaquegröße und Empfindlichkeit (Feld B). Im Gegensatz zu CMC, die Verwendung von Agarose und flüssigen Überlagerungen zu einer signifikant größeren Plaques, was geringere Virushemmung und erhöhte Empfindlichkeit gegen VEEV Replikation. Dieser wurde zuvor bestätigt, als allein zu vergleichen Agarose gegen CMC in apaper veröffentlicht von Juarez et al. 4. Während Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen erzeugt größere Plaques als CMC hatten die Plaques schlecht definierten Grenzen und waren schwierig, in einem 12-Well-Format zählen, mit flüssigem Overlays Erbringen der größten Grenzdiffusion. Wenn Plaques wurden in 6-Well-Platten (Abbildung 4) erprobt, negiert die größeren 6-Well-Format das Thema offenkundig großen Plaques, die schwer in der 12-Well-Format zu unterscheiden waren, mit Agarose und flüssigen Overlays beweisen besser als die CMC-Overlays in Bezug auf Plaque Definition und sensibel (4D). Im Vergleich zu RVFV oder VEEV bietet einige einzigartige Herausforderungen Influenza bei Plaquebildungs, wie das Erfordernis einer externen Protease. Die Empfindlichkeit des Influenza-Virus zu unterschiedlichen Overlay Auswahl wurde auch in der Vergangenheit gut dokumentiert als signifikante Veränderungen festgestellt wurden, wenn Änderungen so gering wie unterschiedliche Marken aus Agarose habenen verwendet 9. Interessant für das Influenza-B-Stamm Taiwan, die Verwendung von CMC als Overlay Folge deutlich kleinere Plaques, die schwer zu zählen sind, und erwies sich als schwierig, zuverlässig Note (5A). Die Verwendung eines Agarose-Overlay versehen die besten Plaques (Feld C) und ergab einen dunkleren Hintergrund-Färbung (wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Mono Lebensfähigkeit) und zeigte deutlicher und schärfer Plaques im direkten Vergleich zu der Verwendung des Flüssigkeitsüberlagerung (Feld B ). Ein deutlicher Vorteil von flüssigen Polymeren auf festen und halbfesten Overlays, wie Agarose und CMC, liegt in der Leichtigkeit der Entfernung und Anwendung. Halbfesten Overlays erfordern Heizung und Verfestigung kann problematisch erweisen bei der Handhabung und Beseitigung. Um diese Vorteile zu nutzen und die Praktikabilität der Verwendung von Avicel in einem Hochdurchsatz Weise RVFV zu bestimmen, wurde eine 96-Well-Platte-Format bei unterschiedlichen Lagerungs concentrati trialedons (Abbildung 6). Für RVFV MP-12 wurden in vierfacher Verdünnungen an beiden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel geführt. Overlay Anwendung und Entfernung erwies sich als einfach, ohne erkennbare Unterschiede zwischen den Wiederholungen oder zwischen Konzentrationen festgestellt, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit. Beim Vertonen waren Plaques deutliche und zählbaren mit dem bloßen Auge, die Machbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurch Weise RVFV. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Fig. 1: RVFV Plaque Overlay Vergleiche unter Verwendung 12-Well-Platten wurden bei Veros 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC (c endgültigenoncentrations) wurden um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Fig. 2: RVFV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Drei ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie in Panel A gezeigt, wurden B und C. Separate Experimente identisch durchgeführt wie für Panels AC beschrieben mit Plaques gezählt und in Feld D (N = 3) titriert. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figur 3: &lt;strong&gt; VEEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 12 Vertiefungen. Veros wurden bei 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe des VEEV TC-83-Impfstoff-Stamm infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Fig. 4: V EEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe VEEV TC-83 infiziert. Nach der Infektion 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder eine 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet als nachgewiesenin den Feldern A, B und C wurden Separate Experimente identisch durchgeführt wie bei den Feldern A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figur 5: Influenza Plaque Overlay Vergleiche MDCK-Zellen wurden mit 5 x 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von Influenza B Taiwan infiziert.. Kein fötales Rinderserum (FBS) wurde in das Wachstumsmedium oder Überlagerungen verwendet werden, wie FBS kann Influenza Ausbreitung durch Inhibition von bestimmten Proteasen, die für die Virusfusion erforderlich hemmen. TPCK-Trypsin, um virale Fusion und die Eingabe mit den Wirtszellen zu erleichtern, um alle Überlagerungen vor der Anwendung hinzugefügt. Nach der Infektion wurden 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC, um direkt zu vergleichen angewendetdie Symbole wie in Panel A, B und C. Getrennte Experimente zeigten, wurden identisch durchgeführt wie in Panel A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). Während ein durchschnittlicher wurde für CMC Plaques ergriffen sie erwies sich als schwierig, um zuverlässig zu zählen, wie sie diffuse Grenzen und sehr kleine Plakette Größen demonstriert. <img alt="Figur 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Fig. 6: Hochdurch Plaque Overlays Eine Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert der Veros bei 3 x 10 4 Zellen pro Well wurden mit 50 &amp; mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe RVFV MP12 für 1 Stunde infiziert, in vierfacher Ausfertigung. Für die Überlagerungen wurden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurchsatz-Weise Panels A und B zu bestimmen erprobt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zelltyp </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infektionsperiode </td><td> 1 Stunde </td><td> 1 Stunde </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Inkubationszeit </td><td> 3 Tage </td><td> 2 Tage </td><td> 3 Tage </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Plaque-Assay Inokulation Bedingungen und Zelltypen <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zellen-Art </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Wachstumstyp</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plaque Medien </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin ergänzt. 2. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml ergänzt. A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% Natriumpyruvat (5 ml), 1% L-Glutamin (5 ml) ergänzt, 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 0,2% Rinderserumalbumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK ergänzt * * Kurz vor der Zubereitung, fügen 1 ul pro 25ml 2 ug / ml Bestand TPCK-Trypsin zu dem aliquoten Sie verwenden werden, um mit Agarose für Plaques mischen. Tabelle 2: Plaque und Viral / Zellwachstum Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zelltyp </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infektionsperiode </td><td> 1 Stunde </td><td> 1 Stunde </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Inkubationszeit </td><td> 3 Tage </td><td> 2 Tage </td><td> 3 Tage </td></tr></tbody></table> Overlay-Lösungen wird nicht erlöschen, wenn gemacht, so lange, wie die Sterilität erhalten bleibt. Tabelle 3: Overlays Lizenz <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 gut </td><td> 12 gut </td><td> 96 gut </td></tr><tr><td> Anzahl der Zellen / Vertiefung </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volumen Innokulum (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Volumen von Overlay (ml) </td><td> 3 </td><td> 1,5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Plattenformate

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.4K Aufrufe.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Serie: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biologie

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

Virusvermehrung und zellbasierte kolorimetrische Quantifizierung

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Plaque-Assay: Eine Methode zur Bestimmung des Virustiters als Plaque bildende Einheiten (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Lehre

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Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Mikrobiologie

Analyzing the Antigenic Relationship between Viruses using an Image-Based Microneutralization Assay

Source: Lin, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54897">Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relations between influenza A and B viruses. It provides a quantitative and visual way to assess the effectiveness of antibodies or other treatments in preventing viral infection.

Analyse der antigenen Beziehung zwischen Viren mit Hilfe eines bildbasierten Mikroneutralisationsassays

1. Virus Titration
NOTE: Depending on the number of viruses and the number of duplicates, a well plate can be set up with the following flexibilities: (1) ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit experimenteller Arzneimittel durch einen Plaque-Assay

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

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