Biz rakamlar hazırlanmasında emekleri için bu yazının hazırlanması ile ona yardım için Amy Thomasson ve Fredrik Skarstedt ve Ryan Christy kabul.

Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, elektronik laboratuvar veritabanı arama gastrointestinal (CMV) enfeksiyonu vakalarının histopatolojik tanı (GI) biyopsiler (hematoksilen temsil eden (FFPE) bloklar ve gömülü formalin fikse, parafin belirlemek için yapıldı eozin (H &amp; E) ve / veya immünohistokimya (IHC)). FFPE GI Biyopsi Doku 1. Doku İşleme <ol><li> Sitomegalovirüs (CMV) için FFPE GI biyopsi doku blokları toplayın kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR). Bu bloklar, oda sıcaklığında saklanır. </li><li> Bloğun benzersiz kimlik numarası ile Pre-etiket 1.7 ml mikrofuj tüpler. </li><li> Mikrotom çarkını kilitleyin. </li><li> Kaset kıskaç içine doku blok koltuk. </li><li> Taze, kullanılmamış bir bıçak kullanarak, mikrotom üzerinde bıçak açısına blok hizalayın. </li><li> 10 mikron kalınlığında bölümleri kesmek için mikrotomu ayarlayın. </li><li> Th kilidinie çarkı ve avans bıçağın doğru bloğu. </li><li> Her kesim bir doku kaydırma içine rulo sağlayan, 10 mikron kalınlığında aralıklarla bloğunun 5 bölümleri kesmek. Her kaydırma istenen biyopsi dokularının yeterli gösterimini içeren emin olun. </li><li> Mikrotom çarkını kilitleyin. </li><li> Forseps ile, sadece çapraz kirlenme riskini azaltmak amacıyla, parafin ile kaydırma işlemek için dikkatli olmak, önceden etiketlenmiş bir santrifüj tüpü içine doku tüm 5 kayar yerleştirin. Tüp kapağı ek ve rafa geri yerleştirin. </li><li> Mikrotom gelen doku bloğu çıkarın. </li><li> Çıkarın ve bıçak atın. </li><li> Önceki doku ile temas etmiş olabilecek yüzeyleri veya araçları dekontamine. </li><li> Bıçak tutucu içine taze, kullanılmamış bıçağı yerleştirin. </li><li> Tekrar işlenecek her bir ek blok için 1,4-1,14 adımları tekrarlayın. Doku kayar ihtiva mikrofüj tüpler tim kadar oda sıcaklığında saklanabilirDNA ekstraksiyon e. </li></ol> FFPE GI Biyopsi Doku Scrolls 2. DNA Ekstraksiyon NOT: Bu protokol FFPE doku DNA ekstraksiyon kiti (: Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) bakın DİKKAT) ve prospektüste uyarlanmıştır. <ol><li> Her bir numune, bir mikrofüj tüpüne 1 ml ksilen (MGVS&#39;de Bakınız DİKKAT) ekleyin. Kuvvetli bir şekilde 10 saniye için kapak ve girdap kapatın. </li><li> Spesifik olarak şu değişiklikler ile üreticinin ürün ekin özetlenen DNA ekstraksiyonu ile devam edin. </li><li> İlk olarak, her bir mikrofüj tüpüne, dahili kontrol (IC) 6 ul ekleyin. <ol><li> 1 saat boyunca 56 ° C&#39;de ATL / proteinaz K liziz inkübasyondan sonra, 1 saat süre ile, 30 dakika boyunca 99 ° C &#39;de yerine, 90 ° C inkübe edin. </li><li> Nihai DNA elüsyon adımı sırasında dikkatli bir DNA saflaştırma kolonunun kapağı açın ve oldukça Buffe göre, zarın merkezi 50 ul damıtılmış DNAse / RNAse içermeyen su uygulamakr ATE. NOT: Uygun depolama ve reaktiflerin hazırlanması için paket içeriğine bakınız. DNA Tüm 5 FFPE verilirse elde edilmelidir. Oda sıcaklığında (15-25 ° C) tüm santrifüj adımları uygulayın. </li></ol></li></ol> CMV 3. QPCR <ol><li> Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Prosedür <ol><li> CMV tahlil çalıştırmak için bir Excel çalışma sayfası PCR oluşturun. Bu Excel çalışma sayfası Mg ile ana karışımı telafi etmek için gerekli her reaktif toplam miktarını hesaplar. Bu örnek başına ihtiyaç duyulan her reaktif miktarını (aşağıda listelenen) kez örneklerin ve kontrollerin sayısı artı çarpar biri (nedeniyle pipetle için kaybını telafi etmek için). <ol><li> Miktarında, her PCR reaksiyonunda aşağıdaki reaktifler belirtilen şunlardır: Reaktif0; Örnek başına miktar CMV LC usta karışımı flakon 12.5 ul Mg Çözüm sarı flakon 2.5 ul Toplam hacmi 15.0 ul </li></ol></li><li> , Bir su ya da hedefsiz kontrol (NTC), negatif kontrol, düşük bir pozitif kontrol, yüksek bir pozitif kontrol ve QS3 veya QS4 ya da, ve hasta numuneleri, her deneyde dahil çalıştırın. Kapilerler bu sırayla kurmak olmalıdır. </li><li> 4 ° C&#39;de saklanan gerçek zamanlı PCR alet için soğutma bloğu spesifik elde edilir Soğutma bloğu içinde uygun kılcal tüpler yerleştirin. Kılcal tüplerin yüzeyine dokunmayın. Kılcal damarları tutarken daima eldiven kullanın. </li><li> Amplifikasyon üretimi ile kontamine olmayan temiz bir başlık tüm polimeraz zincir reaksiyonları kurmakts. <ol><li> Tüm hasta örnekleri, artı 5 kontrolleri test etmek için PCR kiti usta şişeleri doğru sayısını çıkarın. Let ana flakon, Mg çözüm ve soğutma bloğuna PCR sınıf su çözülme. Her bir ana şişe 12 testler için yeterince reaktif madde içerir. </li><li> Yavaşça ana şişeleri vorteks ve hızlı maksimum hızda santrifüj bunları dönerler. </li><li> Bir şişenin içine her ana flakon içeriğini birleştirin ve yavaşça tekrar vorteks. </li><li> Tek bir steril mikrofüj tüpü içine PCR çalışma sayfasına belirtilen miktarlarda ana karışımı ve Mg solüsyonu birleştirin. </li><li> Kantitasyonu standart (QS) için olan konum 5 kılcal dışında, her bir kılcal tüp içine yavaşça ve kısım Mg ile ana karışımı 15 ul karıştırın. </li></ol></li><li> Temiz başlık bir işleme kaput Mg ile kılcal boru ve ana karışımı içeren soğutma bloğunu taşımak. </li><li> Master kalan 30 ul iç kontrolün 2 ul (IC) EkleMg ile karıştırın. 5. pozisyondaki kılcal (QS için konum) içine yavaşça ve 15 ul alikot karıştırın. </li><li> Su pipetle 10 ul, uygun bir kılcal tüp içine DNA, ya da örnek DNA kontrol eder. Kapatma aracını kullanarak kılcal tüpler Cap. </li><li> Real-time PCR enstrüman blok / örnekleri soğutma atın. </li></ol></li><li> Real-time PCR enstrüman programı (bkz. Tablo 1) </li><li> Amplifikasyonu ve saptanması, gerçek zamanlı PCR cihazı üzerinde gerçekleştirilen <ol><li> Bilgisayarda oturum </li><li> Çift alet simgesine tıklayın ve yazılımı içine giriş. </li><li> Real-time PCR aleti açın </li><li> Ön ekrandan &quot;CMV / EBV&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Makro Sihirbazın istemleri izleyin. </li><li> Yazılımı tarafından istendiğinde bir self-test çalıştırmak için kutusunu seçin. A self-test Cihaz kullanımdayken her gün bir defa yapılmalıdır. </li><li> Run Ad. </li><li> Üst LEF bulunan örnek sayısını ayarlayınkontrol ve hasta toplamına sayfanın t köşe vadede dahildir ve her hasta numunesi kimlik numarasını girin. </li><li> &quot;Abs Quant&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Numune türü&quot; altında, standart için uygun örnek türü atayabilirsiniz. </li><li> Sayımıdır standart (QS) için beklenen konsantrasyonlarda yazın. </li><li> Soğutucu bloğundan kılcal tüpleri çıkarın ve (blok örnek # 1 soğutma, vb atlıkarınca pozisyon # 1 yerleştirilmelidir) atlıkarınca karşılık gelen konuma yerleştirin. </li><li> Cihazın santrifüj ve basın başlangıç ​​içine atlıkarınca yerleştirin. </li><li> Santrifüj açın ve atlıkarınca çıkarın. </li><li> Real-time PCR aracı haline atlıkarınca yerleştirin. Kapağı kapatın. </li><li> Basın &quot;Başlat Çalıştır&quot;. </li><li> Gerçek-zamanlı PCR cihazı, bir numune için her pozisyonunu kontrol eder. Bu onay tamamlanana kadar uzak cihazdan değil yürümek, ESPEkılcalların bir atlıkarınca değilse likle. Cihaz, bu not ve çalışma devam edecek olup olmadığını soracaktır. Ayrılmadan önce evet cevabı. </li><li> Çalışma tamamlandıktan sonra, oluşturulan raporu kapatın. </li><li> &quot;Mutlak Nicel&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Sonraki Color Tazminat için oka tıklayın. </li><li> Açılan kutudan &quot;Renk Seç Tazminat&quot; tıklayın. </li><li> Vadede uygulamak için en güncel renk telafisi dosyayı seçin. </li><li> Kutusu açılır, Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Standart Eğrisi tarafından oka tıklayın. </li><li> Açılan menüden &quot;dış kullanın&quot; seçeneğini seçin. </li><li> En güncel dış standart eğri dosyayı seçin, ardından Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Bir konsantrasyon atanırsa eğrileri, mevcut ve düz değil çizgi emin olmak için mutlak miktarının menüsü altında her eğri bak. 705/Back 530 Mutlak miktarının otomatik olarak analiz edilir. </li></ol></li><li> Quality kontrolü <ol><li> Daha sık hangisi belirteçlerin yeni bir lot numarası alındığında, yeni bir standart eğri, ya da her altı ayda bir, üretir. </li><li> Mg ile ana karıştırmak için her bir standart 10 ul ekleyin. Daha önce çıkarılan DNA gibi kiti ile birlikte standartları düşünün. </li><li> Mg doğru sayılmasını sağlamak için standart bir eğri oluşturmak için kullanılan ile ana karışımı, her bir standart için iç kontrol 1 ul ekle. Hayır Şablon Kontrolü (NTC) için Mg ile ana karışımı IC katmayın. </li><li> 16 veri noktası olarak toplam bir NTC ve kantitasyonu Standartlar QS 4, 3, 2, 1 ve standart eğri oluşturmak üzere çalıştırmak için QS4 bir 1:10 seyreltme üç suret hazırlayın. </li><li> Tekrarlanan standartları için açılır menüden of &quot;tekerrür&quot; seçiniz </li><li> Kanal 530/back hiçbiri seçin ve çalıştırmak analiz ederken renk tazminat açmak, </li><li> &quot;(Run) Standart Eğri&quot; altında &quot;seçeneğini ex olarak kaydetmekdahili &quot;ve eğri isim. Kaydederken &quot;standart eğri olarak uygulanır&quot; açıklama girin. </li><li> Sonuçlarını grafik. Elde edilen doğrusallık katsayısı 0,81 ≥ gerekir. </li><li> Günlük ishal için, vadede bir kontrol olarak QS3 veya QS4 bir kopyasını içerir. Mevcut dış standart eğri analiz aşamasında vadede ithal edilebilir. </li><li> Run Kontroller: hayır DNA kontrol, negatif kontrol, düşük ve yüksek pozitif kontroller. Beklenen viral yük belirlenir ve her satıcı ve çok sayıda ayarlanır. </li><li> Her bir örnek için bir IC ekleyin ve DNA ekstraksiyon sırasında kontrol eder. </li><li> Denetimlerden herhangi aralığının dışında düşersen, kabul edilemez sonuçları kaydetmek ve sorun giderme için tahlil bakın. </li></ol></li><li> Kontrol sıklığı <ol><li> Bir NTC, negatif, düşük pozitif, pozitif, yüksek ve standart kontrol: Her vadede içerir. </li></ol></li></ol> NOT: kontroller için kabul edilebilir sınırlar. Resim tepe noktaları dikkat edilmelidirherhangi bir şablon (NTC) ve negatif kontroller için d. Peaks 530 kanalda bulunması gereken ve beklenen viral yükler belirlenir ve düşük ve yüksek pozitif kontroller için her satıcı ve çok sayıda ayarlanır.

<ol>
	<li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).</li><li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+(CMV)+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers.">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li><li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers.">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li><li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection.">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li><li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded,+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies.">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li><li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li><li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world.">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li><li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection.">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li><li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections.">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li><li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection:+prognostic+implications+for+pregnancy.">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li><li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease.">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Pek çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü, moleküler viremi deneyleri, biyopsi histolojisi ve, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi son gösterildiği gibi, moleküler deneyleri de dahil olmak üzere sitomegalovirüs tanısında (CMV) enfeksiyonu için kullanılabilir doku 5,6. Seroloji, tanı bir dayanak kez, sadece güvenilir bir pozlama belirler ve akut CMV enfeksiyonu 7 ile iyi bir korelasyon yoktur. Geleneksel ve erken antijene kabuk şişe hem de Viral kültür, ikinci 8 durumunda en iyi 2-3 gün sonra, uzun deney kat tarafından engellenmektedir. Moleküler Viremi tahliller çoğu izleme, tedavi etkinliği 9-11 için potansiyeli ile kantitatif olmanın avantajı olan, geliştirilmiştir. Gastrointestinal (Gİ) sistem yerel katılımı için klinik endişe var, ne yazık ki, viremi deneyleri sistemik ilişkisini yansıtır ve özellikle lokalize enfeksiyon tespit yok. Bu nedenle, histology gastrointestinal CMV enfeksiyonu tanımlamak için altın standart olmuştur. Bu şiddetli enfeksiyon geliştirmek için onların daha fazla risk verilen, hücre nakli kök / aktif Gİ CMV kemoterapi, HIV / AIDS ile olanlar gibi bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda enfeksiyon, organ ya da tanımlamak için çok önemlidir. Bu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) GI biyopsi 5 CMV algılamak için son derece duyarlı ve özgül bir yöntemdir bildirildi. Benzer sonuçlar diğer çalışmalarla 6 tarafından desteklenmiştir. Prosedür boyunca tüm adımlar önemli olmasına rağmen, özel bir ilgiye hak birkaç önemli kritik adımlar vardır. Mikrotomu doku işleme sırasında, bıçak örneklerin arasında çapraz-bulaşma olasılığını azaltmak için her numune arasında geçiş yapılabilir şarttır. Benzer şekilde, mikrotom alanlarda dekontaminasyon doku uygun bir temizleyici rec kullanarak temas olabilirmikrotom üretici tarafından ommended de bu riski azaltacaktır. Protokolü esnasında bir diğer önemli bir adım ekstraksiyon işlemi ve hem de amplifikasyonu için bir kontrol olarak görev yapar DNA ekstraksiyonu sırasında, numune için iç kontrol IC (adım 2.3) eklenmesidir. IC algılama kanalı 705 oluşur ise CMV virüsünün tespiti, kanal 530 içinde meydana gelir, çünkü IC amplifikasyon ve saptama, CMV amplifikasyonu ile karışmaz. Her laboratuvar IC için kabul edilebilir bir aralık kurmak gerekir. Ekstre etmeden sonra, DNA kalitesinin değerlendirilmesi için gerek yoktur. Diğer bir deyişle, DNA konsantrasyonunun spektrofotometrik belirleme rutin DNA izolasyonu takip gerçekleştirilmez. DNA önce ekstre eklenmiş, IC ekstraksiyon işlemi için bir kontrol olarak işlev görür. Seçenek olarak ise, IC 1 ul Mg şişe her ana karışıma ilave edilebilir. Mg ile birlikte ana karışımı eklenir, IC tek bir amplifikasyon c olarak hareket ederontrol. Aynı zamanda zorunlu olduğunu reaktif kurmak için (Pipet ve ipuçları dahil olmak üzere) temiz bir başlık kullanılması gerektiğini tüm QPCR reaksiyonların set-up sırasında. Bu başlık içindeki manipüle herhangi bir amplifikasyon ürünleri, yani sonrası gerçek zamanlı ya da geleneksel PCR, olmamalıdır. Bu amplifikasyon ürünleri aerosolleşebilir ve yanlış pozitif sonuçlara yol açan, daha sonra hazırlanan QPCR tepkiler kirletebilir. Birçok laboratuar bile olmayan nükleik asit reaktif ve numune eklemek için ikinci bir başlık ve ekipmanları pipetleme kadar tayin davlumbaz ve ekipman olarak gidin ve nükleik asit kontrol. Bireysel laboratuvarları en iyi bireysel alan kısıtlamaları verilen ne çalıştığını karar vermelisiniz. Beklenmeyen sonuçlar giderme işlemi sırasında gerekli olabilir. Bir numunenin IC (yani düz hat) amplifikasyonu hiçbir kanıt yoktur ise, ilk orijinal DNA extracti ikinci QPCR reaksiyon tekrar önerilirBir pipetleme hata sağlamak için numune hazırlama sırasında tepki meydana gelmedi. IC tekrar reaksiyon üzerinde düz bir çizgi kalır ve kalan yeterli biyopsi dokusu varsa, ikinci bir DNA ekstraksiyon ekstraksiyon işlemi sırasında IC eklemek için dikkatli olmak, gerçekleştirilebilir olabilir. Bu yeniden ekstre edilmiş numune, aynı zamanda, düz bir çizgi IC gösteriyor ise, orijinal numune içinde mevcut olan bir reaksiyon inhibitörü yok muhtemeldir. QPCR reaksiyon kontrol uygun gerçekleştirmek etmedi çünkü bu durumda, test sonucu CMV tespiti için belirsiz olacaktır. Su, hiçbir hedef kontrolü (NTC) hedef amplifikasyon gösteriyor, ilk koşmak pozitifliği oranını analiz etmek için tavsiye edilir. Run, normal pozitiflik oranı daha yüksek varsa, herhangi bir reaktif manipülasyon herhangi bir potansiyel çevresel kontaminasyonu belirlemek için yapılır alanların tokatlamak testlerini gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Çevresel kirlenme dışladı ise, kullanmakHer zamanki pozitif kontroller ile birlikte yeni açılan su kontrolü. Yeni açılan su kontrol bir amplifikasyon ürünü göstermezse, önceki su kontrol hedef sekans ile kirlenmiş muhtemeldir. Bu yeni su kontrol tekrar kirlenmiş Bununla birlikte, eğer, bu hedef sekans ile kirlenmiş olan reaktifler veya davlumbaz herhangi bir veya tüm olasılığını yükseltir. Bu durumda, bu süreçte kullanılan tüm davlumbaz arındırmak ve daha sonra (pozitif ve su) kontrol yeni bir dizi çalışan tüm yeni reaktifleri kullanmak için iyi olurdu. Sorun devam ederse, işleme alanları ve davlumbaz iş akışı, yanı sıra ürün üreticileri temas yeniden değerlendirilmesi yapılmalıdır. Kalite standartları (QS) amplifikasyon sırasında uygun kopya sayısını göstermek yok vadede dahil ederseniz, her şeyden önce QS (4, 3, 2, 1, ve QS4 bir 1:10 seyreltme) çalıştırmak için tavsiye edilir. Bu standartlar uygun aralıkları içinde düşerse, daha sonra tekrardaha önce uygun bir kontrol ile belirtilen örnekler. QS, uygun aralıklar içinde yer yoksa, o zaman protokolü (3.4), kalite kontrol bölümünde açıklandığı gibi yeni bir standart eğri oluşturmak. Sorun devam ederse, mevcut ya da yeni bir çok dizi yeni açılan QS ile yeni bir standart eğri üreten teşebbüs olabilir. Bu adımlar, başarısız ise, üreticisine başvurarak garanti olacaktır. Altın standart olarak (H &amp; E ve İHK), geleneksel yöntemleri kullanarak hesaplamalara dayalı GI biyopsi CMV&#39;nin tespit için duyarlılık ve QPCR özgüllüğü hemen altın standart olarak daha analitik hassas QPCR yöntemini kullanarak, bir tanı avantajı göstermek olmasa da büyük ölçüde bu artırır hesaplamaları 5.. Ayrıca, 18 şüpheli biyopsilerin 14 (% 78) bu çalışmada qPCR CMV için pozitif test. Bu noktalar QPCR H &amp; ya da çok daha fazla duyarlı olduğunu görüşünü desteklemektedir hissedilirTek başına E, ya da GI biyopsi materyalinde CMV tespit de İHK ile birlikte. Ayrıca, şüpheli İHK boyanma vakalarda, ek seviyeleri elde mevcut standart yöntemlerle karşılaştırıldığında herhangi bir yararı olması pek mümkün değildir. Birlikte ele alındığında, qPCR FFPE GI biyopsi dokusunda CMV enfeksiyonu tespit etmek son derece hassas ve özeldir. Özellikle kullanışlı belirsiz CMV İHK boyanma veya CMV için klinik son derece şüpheli ile GI biyopsiler üzerinde QPCR performansı olduğunu. Geleneksel histoloji ile karşılaştırıldığında, GI biyopsi materyalinin QPCR test böylece daha erken ve daha etkili hasta yönetimi lider, kısa sürede doğru tanı kolaylaştırabilir.

Klinik örneklerde sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu yorumlanması önem taşımaktadır. CMV herpesvirüslerinin betaherpesvirinae alt familyasının bir üyesidir. Diğer herpes virüsleri benzer şekilde, CMV, aktif viral replikasyon 1 eksikliği ile karakterize edilen bir biçimde ya da latent enfeksiyon kurma yeteneğine sahiptir. Virüsün reaktivasyonu hastalık belirtileri 2-4 eşlik edilebilir virionu salınımıyla karakterize aktif viral replikasyon, yol, stres veya diğer immünosupresyonun dönemlerinde oluşabilir. Gastrointestinal (GI) CMV hastalığı belirtileri sık sık karın ağrısı ve / veya kanlı dışkı 1 içerir. Histoloji CMV gastroenterit tanısı hematoksilen ve CMV viral kapanımlar tespit etmek eozin (H &amp; E) kullanır. Klinik şüphe yüksek henüz belirgin kalıntılar görülmektedir durumlarda, immünhistokimyasal (İHK) sık sık bir yardımcı bir test yöntemi olarak kullanılmaktadır. Ancak, İHKAyrıca yorumlanması zor (Şekil 2) 5 yapma, nadir klasik olmayan görünen hücresel boyanma (şüpheli) engel olabilir. Bu formalin fikse, parafine gömülü (FFPE) GI biyopsi dokusu ve GI biyopsi CMV&#39;nin algılamak için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) çıkarılan DNA kullanmak için aranan oldu. Bu teknik, GI biyopsilerinde CMV saptanmasında önemli olduğu gösterilmiştir ve şüpheli IHC boyama durumlarda 5,6 özellikle yararlıdır edilmiştir. Ayrıca, qPCR da 6 uygun olduğunda ek klinik CMV test verileri ile iyi bir korelasyon olduğu gösterilmiştir. CMV tespit QPCR kullanımı CMV için klinik şüphe yüksek olduğu durumlarda erken tanı ve tedaviye yol açabilir, fakat H &amp; E ve CMV İHK olumsuzdur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

Bu şiddetli enfeksiyon geliştirmek için onların daha fazla risk göz önüne alındığında, gastrointestinal (Gİ) bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda yolu sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu tespit etmek çok önemlidir. CMV enfeksiyonu tespiti için çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü ve moleküler yöntemler de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Genellikle, bu yöntemler CMV ile sistemik ilişkisini yansıtır ve özellikle lokal doku tutulumu tespit yok. Bu nedenle, GI bölgesindeki CMV enfeksiyonu tespiti sıklıkla biyopsi dokusu, geleneksel histoloji ile yapılır. Immünohistokimyasal (İHK) ile birlikte hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyama Bu biyopsilerin incelenmesi dayanaklarını kalmıştır. H &amp; E ve İHK bazen yorumlama zorlaştırır, atipik (şüpheli) boyanma sonuçlanabilir. Bu CMV kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) başarılı bir şekilde çok için formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi dokusu üzerinde gerçekleştirilebilir gösterilmiştiryüksek duyarlılık ve özgüllük. Bu protokolün amacı, bir klinik laboratuvar ortamında FFPE biyopsi dokusunda CMV tespiti için qPCR testleri gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. Bu yöntem, GI biyopsilerinde CMV için belirsiz boyanma durumlarda hastalar için büyük bir fayda olması muhtemeldir.

228 doku blok toplam şüpheli CMV İHK ile histoloji ve pozitif immünohistokimyasal (İHK), 18 dayanan 91 sitomegalovirüs (CMV) pozitif olgu oluşuyordu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ve 79 negatif kontroller ile test edildi. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, CMV pozitif vaka tipik viral CMV kusurları (A) ve / veya pozitif boyanma IHC (B) göstermiştir olacaktır. Negatif kontroller hiçbir şüpheli histoloji veya İHK lekeleme 5 göstermiştir olurdu oysa şüpheli durumlarda, nadir, klasik olmayan görünen boyama desenleri (C) göstermiştir olurdu. Histopatolojik olarak CMV için pozitif 91 biyopsi, 88 QPCR (Tablo 2) ile pozitif bulundu. Geleneksel histoloji dayalı bir gerçek pozitif tanımı ile, tipik CMV viral kapanım ve / veya tipik CMV IHC yani, bu veriler% 96.7 duyarlılık sonuçlandı. <pCMV İHK ile yani viral kapanım için olumsuz ve negatif 79 negatif kontrol biyopsi (35 normal kolon, 25 kolit ve 19 duodenit), Of class = &quot;jove_content&quot;&gt;, 78 negatif test edilmiş ve 1 spesifiklikte sonuçlanan, qPCR pozitif test % 98.7. Şüpheli CMV İHK boyama ile 18 (% 78) biyopsi Ondört qPCR 5 ile CMV için pozitif test. Bu 18 şüpheli durumlarda arasında onbiri ek biyopsiler histopatolojik tarafından CMV için pozitif aynı gün almıştı. Bu 14 QPCR olumlu örnekler arasında, 10 biyopsiler histopatolojiye CMV için pozitif aynı gün almıştı. Test edilen 18 şüpheli biyopsilerin, 11 biyopsi alındığı zaman 7 gün içinde veya sunulan diğer örneklerinde CMV testleri ile ilgili ek klinik bilgiler vardı. Bu 11 olgunun 8&#39;inde (% 73) qPCR CMV için pozitif test. Bu 11 biyopsi, 5 (% 45) ek pozitif örneklerin CMV ile qPCR pozitif test; 3 (% 27) varsaymak testhiçbir olumlu örneklerin CMV ile qPCR ive; 3 (% 27) ek bir negatif CMV numuneler ile qPCR negatif test. Yukarıda belirtilen çalışmalara ek olarak, elde ek hematoksilen ve eozin (H &amp; E) düzeyleri hiçbir viral inklüzyonlar başlangıçta H &amp; E görülen ve CMV İHK muğlak olduğu durumlarda yararlı olacağını belirlemek için ilgi oldu. Bu nedenle, belirsiz CMV IHC ile 18 blokların her biri için H &amp; E düzeyleri 5 kez gerçekleştirilmiştir. İki patolog dikkatle bu davaları incelediğini ve ek slaytlar (veriler gösterilmemiştir) herhangi farkedilebilir bir viral kapanım tespit olamazdı. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="805"><tbody><tr><td colspan="7"> Önerilen gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon parametreleri </td></tr><tr><td colspan="7"> Kurulum Okumalar: </td></tr><tr><td> Varsayılan Kanal </td><td> Sıcaklık Seek </td><td> Max Pos Seek </td&gt; <td> Enstrüman tipi </td><td> Kılcal Ebat </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 530 </td><td> 30 ° C </td><td> 12 </td><td> 6 kanal </td><td> 20 ul </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Program adı: enzim aktivasyonu </td></tr><tr><td colspan="7"> Döngülerinin sayısı: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> Analiz modu: Yok </td></tr><tr><td> Hedef ° C </td><td> Hh tutun: dd: ss </td><td> Rampa Oranı </td><td> Sec Hedef </td><td> Adım Boyutu </td><td> Adım Gecikme </td><td> Tedarik etme kipinde </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:10:00 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td colspan="7"> Program adı: adım aşağı dokunun </td></tr><tr><td colspan="7"> Döngüsü sayısı: 10 </td></tr><tr><td colspan="7"> Analiz modu: Yok </td></tr><tr><td> Hedef ° C </td><td> Hh tutun: dd: ss </td><td> Veri deposup Oranı </td><td> Sec Hedef </td><td> Adım Boyutu </td><td> Adım Gecikme </td><td> Tedarik etme kipinde </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td> 65 </td><td> 00:00:20 </td><td> 20 </td><td> 55 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 00:00:15 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td colspan="7"> Program adı: DNA amplifikasyonu </td></tr><tr><td colspan="7"> Döngülerinin sayısı: 40 </td></tr><tr><td colspan="7"> Analiz modu: Kantitasyon </td></tr><tr><td> Hedef ° C </td><td> Hh tutun: dd: ss </td><td> Rampa Oranı </td><td> Sec Hedef </td><td> Adım Boyutu </td><td> Adım Gecikme </td><td> Tedarik etme kipinde </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td> 55 </td><td> 00:00:20 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Tek </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 00:00:15 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td colspan="7"> Program adı: Soğutma </td></tr><tr><td colspan="7"> Döngülerinin sayısı: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> Analiz modu: Yok </td></tr><tr><td> Hedef ° C </td><td> Hh tutun: dd: ss </td><td> Rampa Oranı </td><td> Sec Hedef </td><td> Adım Boyutu </td><td> Adım Gecikme </td><td> Tedarik etme kipinde </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 00:00:30 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Hiçbiri </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sıralanan parametreler cytomegalovi tespit için gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu set-up hedef sıcaklıklar, çevrim sayılar, ve döngü uzunlukları için bir kılavuz olarak kullanılmalıdır<html> formalin fikse, parafine gömülü gastrointestinal biyopsilerinde rus. Bu parametreler enstrüman modeline ve üreticiye bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528"><tbody><tr><td> Histoloji Pozitif Kılıfları </td><td> PCR Pozitif Kılıfları </td><td> Duyarlılık </td><td> Histoloji Negatif Kılıfları </td><td> PCR Negatif Kılıfları </td><td> Specitivity </td></tr><tr><td> 91 </td><td> 88 </td><td> % 96.7 </td><td> 79 </td><td> 78 </td><td> % 98.7 </td></tr></tbody></table> Formalin fikse, parafine gömülü gastrointestinal biyopsilerinde sitomegalovirüs tespit gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) Tablo 2. Duyarlılık (% 96.7) ve özgüllük (% 98.7). Bu tablo ark 5 McCoy modifiye edilmiştir. es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 400 &quot;/&gt; Biyopsi doku, 10 mikron kalınlığında bir kısmı kesilir Şekil 1,. Kaset kelepçe A doğru oturan doku bloğu ile tipik bir mikrotom) olarak, bir mikrofüj tüpü C aktarılır kaydırma B)) rulo haline bırakılır. Biyopsi doku Beş motifler DNA ekstraksiyonu için tek bir mikrofüj tüpüne yerleştirilir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51570/51570fig2highres.jpg" width="400" /> Beklenen İHK boyama deseni (orijinal gösteren CMV karşı monoklonal antikor ile boyandı Şekil 2. A) Hematoksilen ve oklarla (orijinal büyütme 400X) tarafından belirtildiği gibi bol, tipik CMV kapanım gösteren bir kolon biyopsi eosin ile boyanan bölümünde. B) Bir kolon biyopsi 400X büyütme). <stRong&gt; C) ok (orijinal büyütme 400X) ile gösterilen bir tek, küçük zayıf lekeli hücre ile şüpheli İHK boyamayı gösteren bir kolon biyopsi. Bu rakam McCoy ve ark 5 izniyle ediliyor.

Watch this Scientific Journal Video about qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue at JoVE.com

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Görüntüleme.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Video: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Biyoloji

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...