Reconhecemos Amy Thomasson por sua assistência com a preparação deste manuscrito, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy por seus esforços na preparação das figuras.

Com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional, foi realizada uma pesquisa no banco de dados do laboratório de eletrônica para identificar fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) blocos que representam casos de infecção pelo citomegalovírus (CMV) em gastrintestinal (GI) biópsias diagnosticados por histopatologia (hematoxilina e eosina (H &amp; E) e / ou imuno-histoquímica (IHQ)). 1. Processamento de tecidos de biopsia de tecido FFPE GI <ol><li> Colete FFPE GI blocos de tecido para biópsia citomegalovírus (CMV) polimerase quantitativa reação em cadeia (qPCR). Estes blocos são armazenados à temperatura ambiente. </li><li> Tubos pré-label 1,7 ml de microcentrífuga com número de identificação único do bloco. </li><li> Trave o volante micrótomo. </li><li> Assente o bloco de tecido para o prendedor de cassete. </li><li> Usando uma lâmina utilizada fresca, alinhar o bloco para o ângulo de faca no micrótomo. </li><li> Ajuste o micrótomo para cortar 10 mm de espessura. </li><li> Desbloquear ªe volante e avanço do bloco na direção da lâmina. </li><li> Corte 5 seções do bloco em 10 mM intervalos de espessura, permitindo que cada corte para rolar em um rolo de tecido. Certifique-se de que cada um pergaminho contém uma representação adequada dos tecidos de biópsia desejados. </li><li> Trave o volante micrótomo. </li><li> Com uma pinça, coloque todos os 5 pergaminhos de tecido para dentro do tubo de centrífuga de pré-rotulados, tendo o cuidado de apenas manipular a rolagem pela parafina, a fim de reduzir o potencial de contaminação cruzada. Encaixe a tampa no tubo e colocá-lo de volta na prateleira. </li><li> Retire o bloco de tecido a partir do micrótomo. </li><li> Retire e deite fora a lâmina. </li><li> Descontaminar todas as superfícies ou instrumentos que possam ter entrado em contato com o tecido anterior. </li><li> Coloque uma lâmina não utilizado fresco no suporte da faca. </li><li> Repita os passos 1,4-1,14 para cada bloco adicional para ser processado. Os tubos de microcentrífuga contendo os rolos de tecido podem ser armazenadas à temperatura ambiente até que o time da extração de DNA. </li></ol> 2. Extração de DNA a partir de Scrolls de FFPE GI biópsia de tecido NOTA: Este protocolo é uma adaptação da bula do tecido kit FFPE DNA extração (ATENÇÃO: consulte a Ficha de Segurança (MSDS)). <ol><li> Adicione 1 ml de xileno (ATENÇÃO: Consulte o MSDS) para cada tubo de microcentrífuga amostra. Fechar a tampa e vortex vigorosamente durante 10 sec. </li><li> Prossiga com a extração de DNA como descrito especificamente na inserção do produto do fabricante com as seguintes modificações. </li><li> Primeiro adicione 6 mL do controle interno (CI) para cada tubo de microcentrífuga. <ol><li> Seguindo o ATL / proteinase K incubação de lise a 56 ° C durante 1 hora, incubar a 99 ° C durante 30 minutos, em vez de 90 ° C durante 1 hora. </li><li> Durante o passo final de eluição de ADN, aberto com cuidado a tampa da coluna de purificação de ADN e aplicar 50 ul de ADNase / água livre de ARNase destilada no centro da membrana, em vez de da-manhãr ATE. NOTA: Consulte a bula para o armazenamento e preparação de reagentes adequados. ADN deve ser extraído a partir de todos os cinco rolos de FFPE. Executar todos os passos de centrifugação à temperatura ambiente (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR para CMV <ol><li> Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedimento <ol><li> Gerar uma planilha do Excel PCR para o CMV ensaio prazo. Esta planilha Excel calcula a quantidade total de cada reagente necessário para tornar-se o mix principal com Mg. Multiplica-se a quantidade de cada reagente necessária por amostra (listados abaixo) vezes o número de amostras e controlos mais um (para compensar as perdas devido a pipetagem). <ol><li> Incluir os seguintes reagentes em cada reação de PCR, no montante indicado: Reagente0; Quantidade por Amostra Master mix CMV LC frasco de 12,5 mL Mg solução amarelo frasco de 2,5 mL O volume total de 15,0 uL </li></ol></li><li> Incluir em cada ensaio, execute uma água ou nenhum controle de destino (NTC), controle negativo, controle positivo baixo, um controle positivo alto, e quer QS3 ou QS4, e todas as amostras dos pacientes. Os capilares devem ser criados por esta ordem. </li><li> Obter o bloco específico de arrefecimento para o equipamento de PCR em tempo real que está guardado a 4 ° C. Colocar os tubos capilares apropriadas do bloco de arrefecimento. Não toque na superfície dos tubos capilares. Sempre use luvas ao manusear os capilares. </li><li> Configure todas as reações em cadeia da polimerase em uma capa limpa não contaminada com amplificação produçãots. <ol><li> Remover o número correto de frascos mestre do kit de PCR para testar todas as amostras dos pacientes, mais 5 controles. Deixe os frascos mestre, solução Mg e PCR degelo água grau no bloco de resfriamento. Cada frasco mestre contém reagentes suficientes para 12 ensaios. </li><li> Suavemente vortex os frascos de mestrado e rápida spin-los na centrífuga à velocidade máxima. </li><li> Combinar o conteúdo de cada recipiente principal para um frasco, e suavemente vortex novamente. </li><li> Combine a mistura principal e solução de Mg nas quantidades indicadas na planilha de PCR em um único tubo de microcentrífuga estéril. </li><li> Misturar suavemente e alíquota de 15 ul de mistura principal com Mg em cada tubo capilar, com excepção do capilar na posição 5, que é o padrão para a quantificação (QS). </li></ol></li><li> Mova o bloco de arrefecimento, contendo os tubos capilares e master mix com Mg da capa limpa para um capuz processamento. </li><li> Adicione 2 mL de controlo interno (CI) para os restantes 30 mL de mestremisturar com Mg. Misture delicadamente e alíquota de 15 mL para o capilar na posição 5 (posição para o QS). </li><li> Pipetar 10 ml de água, controle de ADN, ou o ADN da amostra no tubo capilar apropriado. Tapar os tubos capilares usando a ferramenta de nivelamento. </li><li> Tome arrefecimento do bloco / amostras para o tempo real instrumento de PCR. </li></ol></li><li> Programar o tempo real do instrumento de PCR (ver Tabela 1) </li><li> Amplificação e Detecção executada em tempo real o instrumento de PCR <ol><li> Efetue logon no computador </li><li> Dê um duplo clique sobre o ícone do instrumento e fazer login no software. </li><li> Ligue o tempo real instrumento de PCR </li><li> Clique em &quot;CMV / EBV&quot; a partir da tela da frente. </li><li> Siga as instruções do assistente de macro. </li><li> Marque a caixa para executar um auto-teste, quando solicitado pelo software. Um auto-teste deve ser realizado uma vez a cada dia o instrumento estiver em uso. </li><li> Nomeie o prazo. </li><li> Ajuste a contagem de amostra localizada na ABL superiort canto da página para a soma de controles e pacientes incluídos no Executar e digite o número de cada amostra de identificação. </li><li> Clique na aba &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> Em &quot;Tipo de amostra&quot;, atribuir o tipo de amostra adequado para o padrão. </li><li> Digite as concentrações esperadas para o padrão de quantificação (QS). </li><li> Retire os tubos capilares a partir do bloco de arrefecimento e colocá-los na posição correspondente no carrossel (arrefecimento do bloco de amostra # 1 deve ser colocado na posição # 1 no carrossel, etc.) </li><li> Coloque o carrossel em centrífuga e começar a pressionar o instrumento. </li><li> Abra centrífuga e remover o carrossel. </li><li> Coloque o carrossel para o instrumento em tempo real, PCR. Feche a tampa. </li><li> Pressione o botão &quot;Start Run&quot;. </li><li> A real-time PCR instrumento irá verificar cada posição para uma amostra. Não se afaste do instrumento até que essa verificação tenha sido concluída, especialmente se um dos capilares não é no carrossel. O instrumento vai notar isso e perguntar se a corrida é para ser continuada. Responda sim antes de sair. </li><li> Uma vez que a corrida é completa, feche o relatório que foi gerado. </li><li> Clique em &quot;Absolute quantificação&quot;. </li><li> Clique na seta ao lado de Cor de Compensação. </li><li> Clique em &quot;Selecionar cor de Compensação&quot; a partir da caixa drop-down. </li><li> Escolha o arquivo de compensação de cor mais atual para aplicar a fuga. </li><li> Clique em OK quando a caixa aparece. </li><li> Clique na seta por curva padrão. </li><li> Selecione &quot;uso externo&quot; a partir do menu drop-down. </li><li> Selecione o arquivo de curva padrão externo mais atual e clique em OK. </li><li> Olhe para cada curva no menu Absolute Quantificação para garantir que as curvas estão presentes e não linha reta, se uma concentração é atribuída. A quantificação absoluta para o 705/Back 530 é analisado automaticamente. </li></ol></li><li> Qucontrole ality <ol><li> Gerar uma nova curva padrão sempre que um número novo lote de reagentes é recebido, ou a cada seis meses, o que é mais freqüente. </li><li> Adicionar 10 ml de cada uma das normas para a mistura principal com Mg. Considere as normas incluídas no kit de DNA previamente extraído. </li><li> Adicionar 1 ml de controlo interno para cada padrão para a mistura principal com Mg utilizados em gerar a curva padrão, a fim de assegurar uma quantificação precisa. Não adicione IC para a mistura principal com Mg para o modelo de controle n º (NTC). </li><li> Prepare um NTC e três repetições de quantificação Normas QS 4, 3, 2, 1, e uma diluição de 1:10 de QS4 para a corrida para gerar a curva padrão, totalizando em 16 pontos de dados. </li><li> Selecione &quot;idêntico&quot; no menu drop-down para os padrões repetidos </li><li> Escolha canal 530/back nenhum e ligar compensação de cor quando se analisa o prazo, </li><li> Em &quot;Curva padrão (In Run)&quot;, selecione &quot;salvar como exexterno &quot;eo nome da curva. Digite o comentário &quot;aplicado como curva padrão&quot; ao salvar. </li><li> Gráfico dos resultados. O coeficiente de linearidade resultante deve ser ≥ 0,81. </li><li> Para corridas diárias, incluir uma cópia do QS3 ou QS4 como um controle na corrida. A curva padrão externa atual podem ser importados para a corrida durante a fase de análise. </li><li> Executar controles: sem controle de DNA, controle negativo, os baixos e os controles positivos altos. Carga viral esperada é determinada e ajustada para cada fornecedor e número de lote. </li><li> Adicionar um IC para cada amostra e controle durante a extração de DNA. </li><li> Se qualquer um dos controles cair fora da faixa, registrar os resultados inaceitáveis ​​e remeter o ensaio para a solução de problemas. </li></ol></li><li> Frequência dos controlos <ol><li> Inclua em cada corrida: a NTC, baixo, alto positivo e padrão de controle positivo negativo. </li></ol></li></ol> Nota: os limites aceitáveis ​​para controles. Sem picos deve ser observard para a nenhum modelo (NTC) e controles negativos. Picos deve estar presente no canal 530 e cargas virais esperados são determinadas e ajustadas para cada vendedor e número de lote para os controlos positivos de baixa e alta.

<ol>
	<li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).</li><li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+(CMV)+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers.">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li><li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers.">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li><li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection.">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li><li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded,+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies.">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li><li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li><li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world.">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li><li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection.">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li><li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections.">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li><li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection:+prognostic+implications+for+pregnancy.">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li><li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease.">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Muitos métodos laboratoriais estão disponíveis para o diagnóstico da infecção pelo citomegalovírus (CMV), incluindo sorologia, cultura viral, ensaios moleculares de viremia, histologia do material da biópsia e, como demonstrado recentemente, ensaios moleculares de, a biópsia fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE) 5,6 tecido. Sorologia, uma vez que um dos pilares do diagnóstico, identifica apenas confiável exposição e não se correlaciona bem com a infecção por CMV aguda 7. A cultura viral, tanto convencional e cedo antigénio concha frasco, é dificultada por longos tempos de ensaio, na melhor das hipóteses de 2-3 dias, no caso do último 8. Os ensaios moleculares de viremia foram desenvolvidos, a maioria tem a vantagem de ser quantitativa com o potencial para a eficácia do tratamento de monitorização 9-11. Infelizmente, quando há uma preocupação clínica de envolvimento local do gastrointestinal (GI), ensaios de viremia refletir envolvimento sistêmico e não identificam especificamente infecção localizada. Portanto, histology tem sido o padrão ouro para a identificação de infecção por CMV do trato GI. É fundamental identificar infecções ativas CMV trato GI em pacientes imunodeprimidos, como os portadores de HIV / AIDS, em quimioterapia, ou órgão / transplantes de células estaminais, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Foi relatado polimerase quantitativa de reacção em cadeia (qPCR) é um método altamente sensível e específico para a detecção de CMV em biópsias IG 5. Resultados semelhantes têm sido apoiados por outros estudos 6. Apesar de todas as etapas ao longo do processo são importantes, há algumas etapas críticas principais que merecem consideração especial. Durante o processamento do tecido sobre o micrótomo, é imprescindível que a lâmina ser comutada entre cada amostra para reduzir a possibilidade de contaminação cruzada entre as amostras. Da mesma forma, a descontaminação de áreas no micrótomo o tecido pode ter entrado em contacto com o uso de um limpador adequado recrecomendada pela fabricante micrótomo também irá reduzir esse risco. Um passo chave adicional durante o protocolo é a adição de um controlo interno IC (passo 2.3) para a amostra durante a extracção do ADN, o qual actua como um controlo para o processo de extracção e de amplificação. A amplificação e a detecção da IC não interfere com a amplificação de CMV, porque a detecção do vírus CMV ocorre no canal 530, ao passo que a detecção do IC ocorre no canal 705. Cada laboratório deve estabelecer uma gama aceitável para o CI. Após a extração, a qualidade do DNA não precisa ser avaliada. Em outras palavras, a determinação espectrofotométrica da concentração de ADN não é rotineiramente realizado a seguir ao isolamento do ADN. Se adicionado antes da extracção do ADN, o IC actua como um controlo para o processo de extracção. Alternativamente, um pi de IC podem ser adicionados a cada mistura principal com Mg frasco. Se adicionado à mistura principal com Mg, o IC actua apenas como uma amplificação control. É também imperativo que durante o set-up de todas as reações de qPCR que um capuz limpo (incluindo pipetas e pontas) ser usados ​​para reagente configurar. Esta capa não deve ter quaisquer produtos de amplificação, ou seja, pós-tempo real ou PCR convencional, manipulado dentro dele. Estes produtos de amplificação pode se tornar em aerossol e contaminar as reações de qPCR posteriormente preparados levando a falsos resultados positivos. Muitos laboratórios até mesmo ir tão longe como designando exaustores e equipamentos para pipetagem de reagentes ácidos nucléicos e não uma segunda capa e equipamentos para a adição de amostra e controlar ácido nucleico. Laboratórios individuais devem decidir o que funciona melhor dadas as suas limitações de espaço individuais. Solução de problemas resultados inesperados podem ser necessários durante o procedimento. Se não há nenhuma evidência de amplificação do IC (isto é, linha plana) de uma amostra, é recomendado que a primeira repetição da reacção qPCR do extracti DNA originalpara garantir um erro de pipetagem não ocorreu durante a preparação de reacção da amostra. Se o IC permanece em uma linha reta sobre a reação da repetição e há tecido biópsia suficiente restante, uma segunda extração de DNA podem realizada, lembrando de acrescentar o IC durante o processo de extração. Se esta amostra re-extraiu-se também demonstra uma linha plana IC, é provável que seja um inibidor da reacção presentes nas amostras originais. Neste caso, o resultado do teste seria indeterminado para a detecção de CMV uma vez que o controlo da reacção de qPCR não realizar de forma adequada. Se a água, sem controle de destino (NTC) demonstra a amplificação do alvo, é aconselhável primeiro a analisar a taxa de positividade do prazo. Se a corrida tem um maior do que o índice de positividade normal, seria recomendável a realização de testes de furto de áreas onde qualquer manipulação de reagentes é realizada para identificar qualquer potencial contaminação do ambiente. Se a poluição ambiental seja descartada, usar umcontrole da água recém-inaugurado junto com os controles positivos habituais. Se o controlo de água recentemente aberta não mostram um produto de amplificação, é provável que o controlo de água anterior foi contaminada com a sequência alvo. No entanto, se este novo controle da água é novamente contaminado, levanta a possibilidade de qualquer ou de todos os reagentes ou capuzes sendo contaminados com seqüência alvo. Neste caso, seria melhor para descontaminar todos os capuzes utilizados durante o processo e, em seguida, usar todos os novos reagentes na execução de um novo conjunto de controles (positivo e água). Se o problema persistir, uma reavaliação do fluxo de trabalho nas áreas de processamento e capuzes, bem como entrar em contato com os fabricantes do produto deve ser feito. Se os padrões de qualidade (QS) incluído no prazo não demonstram o número de cópia adequada durante a amplificação, é aconselhável que primeiro executar todo o QS (4, 3, 2, 1, e uma diluição de QS4 1:10). Se esses padrões estão dentro dos intervalos adequados, em seguida, repitaas amostras como anteriormente especificados com os controlos apropriados. Se os QS não caem dentro dos intervalos adequados, em seguida, gerar uma nova curva padrão, tal como descrito na secção do protocolo (3.4) de controlo de qualidade. Se o problema persistir, pode ser tentada a geração de uma curva padrão novo com QS recém-inaugurado da atual ou um número novo lote. Se estes passos não forem bem sucedidos, entrar em contato com o fabricante seria justificado. Embora a sensibilidade e especificidade de qPCR para detecção de CMV em biópsias IG com base em cálculos usando métodos convencionais (H &amp; E e IHC) como padrão-ouro não demonstram imediatamente uma vantagem de diagnóstico, utilizando o método de qPCR analiticamente mais sensíveis como o padrão ouro melhora muito a estes Cálculos 5. Além disso, 14 (78%) das 18 biópsias ambíguos testado positivo para CMV por qPCR no presente estudo. Considera-se estes pontos de apoio da noção de que qPCR é muito mais sensível do que qualquer um de H &amp;E sozinho, ou em conjunto com IHC na detecção de CMV em material de biópsia do GI. Além disso, em casos duvidosos com padrões de coloração IHQ, a obtenção de níveis adicionais é improvável que seja de qualquer benefício adicional em relação aos métodos convencionais atuais. Tomados em conjunto, qPCR é altamente sensível e específico para detectar a infecção por CMV em tecido biópsia FFPE GI. Particularmente útil é o desempenho da qPCR em biópsias GI com padrões ambíguos coloração CMV IHC ou clinicamente altamente suspeito para CMV. Em comparação com a histologia tradicional, o teste qPCR de material de biópsia GI pode facilitar um diagnóstico preciso em um curto período de tempo, levando assim a mais cedo e uma gestão mais eficaz ao paciente.

Interpretação da infecção por citomegalovírus (CMV) em amostras clínicas é criticamente importante. O CMV é um membro da subfamília Betaherpesvirinae de herpesvírus. Semelhante a outros vírus de herpes, CMV tem a capacidade de estabelecer infecção persistente ou latente caracterizada por uma falta de replicação viral activa 1. A reativação do vírus pode ocorrer durante momentos de estresse ou outra imunossupressão, levando a replicação viral activa caracterizada pela liberação virion, que pode ser acompanhada de manifestações da doença 2-4. Gastrointestinal (GI) os sintomas da doença CMV freqüentemente incluem dor abdominal e / ou fezes com sangue um. O diagnóstico de CMV gastroenterite por histologia utiliza hematoxilina e eosina (H &amp; E) para identificar CMV inclusões virais. Nos casos em que a suspeita clínica é alta ainda são observados sem inclusões óbvias, imuno-histoquímica (IHQ) é freqüentemente usado como um método de ensaio adjunto. No entanto, IHCtambém pode ser prejudicada pela não-clássicas surgem padrões raros de coloração celular (duvidosos), tornando difícil interpretação (Figura 2) 5. Buscou-se utilizar DNA extraído de fixados em formalina e incluído em parafina (FFPE) tecidos de biópsia GI e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para detectar CMV em biópsias IG. Esta técnica tem mostrado ser útil na detecção de CMV em biópsias GI, e é particularmente útil em casos duvidosos IHC coloração 5,6. Além disso, qPCR também tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os dados de teste de CMV clínica adicional, quando ele está disponível 6. Uso de qPCR na detecção de CMV pode levar a um diagnóstico precoce e tratamento nos casos em que a suspeita clínica para CMV é alta, mas H &amp; E e CMV IHC são negativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

É crucial para identificar a infecção por citomegalovírus (CMV) no trato gastrointestinal (TGI) de pacientes imunossuprimidos, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Muitos métodos laboratoriais para a detecção de infecção por CMV têm sido desenvolvidos, incluindo sorologia, a cultura viral, e métodos moleculares. Muitas vezes, esses métodos refletem o acometimento sistêmico com CMV e não identificam especificamente o envolvimento do tecido local. Portanto, a detecção de infecção por CMV no tracto GI é frequentemente feito por histologia tradicional de tecidos de biopsia. Hematoxilina e eosina (H &amp; E) em conjunto com a coloração imuno-histoquímica (IHQ) mantiveram-se os principais pilares de examinar essas biópsias. H &amp; E e IHC, por vezes, resultar em atípicos (ambíguos) padrões de coloração, tornando difícil interpretação. Foi mostrado que a polimerase de reacção em cadeia quantitativa (qPCR) por CMV pode ser realizada com sucesso em, tecidos de biopsia (FFPE) em parafina e fixado em formalina para muitoalta sensibilidade e especificidade. O objetivo deste protocolo é para demonstrar como realizar testes de qPCR para a detecção de CMV no tecido biópsia FFPE em um ambiente de laboratório clínico. Este método é susceptível de ser de grande benefício para o paciente, em caso de coloração equívoca para CMV em biópsias GI.

Um total de 228 blocos de tecido foram testadas por reação de polimerase em cadeia quantitativa (qPCR), que foi composta por 91 citomegalovírus (CMV) casos positivos com base na histologia e imuno-histoquímica positiva (IHC), 18 com equívoco CMV IHC, e 79 controles negativos. Tal como ilustrado na Figura 2, os casos positivos que demonstraram CMV CMV inclusões típicas virais (A) e / ou coloração IHC positivo (B). Casos duvidosos teria demonstrado, não-clássicas surgem padrões de coloração raros (C), enquanto os controles negativos teria mostrado nenhuma histologia suspeita ou IHC coloração 5. De 91 biópsias positivas para CMV por histopatologia, 88 foram positivas por qPCR (Tabela 2). Com uma verdadeira definição positiva com a histologia tradicional, ou seja, inclusões virais típicas CMV e / ou típico CMV IHC, estes dados resultou em uma sensibilidade de 96,7%. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; de 79 biópsias de controlo negativo (35 de cólon normal, colite 25, 19 e duodenite), ou seja, negativos para inclusões virais e negativas por CMV IHC, 78 deram negativo e um resultado positivo por qPCR, resultando numa especificidade de 98,7%. Quatorze dos 18 (78%) biópsias com equívoco coloração CMV IHC testou positivo para CMV por qPCR 5. Entre esses 18 casos duvidosos, onze tiveram biópsias adicionais tomadas no mesmo dia em que foram positivos para CMV histopatológico. Entre essas 14 amostras positivas qPCR, 10 tiveram biópsias tomado o mesmo dia em que foram positivos para CMV em histopatologia. Das 18 biópsias duvidosos testados, 11 tiveram a informação clínica adicional em relação ao teste CMV em outras amostras apresentadas no ou nos 7 dias da época da biópsia foi tomada. Entre estes 11 casos, 8 (73%) deram positivo para CMV por qPCR. Destes 11 biópsias, 5 (45%) deram positivo por qPCR com amostras adicionais CMV positivas; 3 (27%) testaram positive por qPCR sem espécimes CMV positivas; 3 (27%) apresentaram resultados negativos por qPCR com amostras adicionais CMV negativos. Além desses estudos mencionados acima, era de interesse para determinar se a obtenção de níveis adicionais hematoxilina e eosina (H &amp; E) seria benéfica em casos onde não inclusões virais são vistos em H &amp; E, inicialmente, e CMV IHC é equívoca. Portanto, H &amp; E níveis 5 vezes para cada um dos 18 blocos com equívoco CMV IHC foram realizados. Dois patologistas cuidadosamente examinados e nestes casos não foi possível identificar inclusões virais discerníveis em qualquer uma das lâminas adicionais (dados não mostrados). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="805"><tbody><tr><td colspan="7"> Parâmetros de reação em cadeia da polimerase em tempo real sugeridas </td></tr><tr><td colspan="7"> Leituras de configuração: </td></tr><tr><td> Canal Padrão </td><td> Procure Temperatura </td><td> Max Procure Pos </td&gt; <td> Tipo de aparelho </td><td> Capilar Tamanho </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 530 </td><td> 30 ° C </td><td> 12 </td><td> 6 canais </td><td> 20 ul </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Nome do Programa: A ativação de enzima </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo Análise: Nenhum </td></tr><tr><td> Alvo ° C </td><td> Segure hh: mm: ss </td><td> Taxa de rampa </td><td> Sec-alvo </td><td> Tamanho do Passo </td><td> Passo Atraso </td><td> Modo de aquisição </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:10:00 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td colspan="7"> Nome do Programa: Toque para baixo passo </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 10 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo Análise: Nenhum </td></tr><tr><td> Alvo ° C </td><td> Segure hh: mm: ss </td><td> RAMTaxa de p </td><td> Sec-alvo </td><td> Tamanho do Passo </td><td> Passo Atraso </td><td> Modo de aquisição </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> 65 </td><td> 00:00:20 </td><td> 20 </td><td> 55 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 00:00:15 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td colspan="7"> Nome do Programa: Amplificação do DNA </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 40 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo Análise: Quantificação </td></tr><tr><td> Alvo ° C </td><td> Segure hh: mm: ss </td><td> Taxa de rampa </td><td> Sec-alvo </td><td> Tamanho do Passo </td><td> Passo Atraso </td><td> Modo de aquisição </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> 55 </td><td> 00:00:20 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Único </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 00:00:15 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td colspan="7"> Nome do Programa: Cooling </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo Análise: Nenhum </td></tr><tr><td> Alvo ° C </td><td> Segure hh: mm: ss </td><td> Taxa de rampa </td><td> Sec-alvo </td><td> Tamanho do Passo </td><td> Passo Atraso </td><td> Modo de aquisição </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 00:00:30 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Nenhum </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Os parâmetros listados deve ser usado como um guia para as temperaturas alvo, número de ciclos, e comprimentos de ciclo no set-up em tempo real de reação em cadeia da polimerase para a detecção cytomegalovi<html> rus em fixados em formalina, biópsias gastrointestinais embebidos em parafina. Estes parâmetros podem requerer otimização, dependendo do modelo do instrumento e fabricante. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528"><tbody><tr><td> Histologia casos positivos </td><td> Casos positivos de PCR </td><td> Sensibilidade </td><td> Histologia casos negativos </td><td> PCR casos negativos </td><td> Specitivity </td></tr><tr><td> 91 </td><td> 88 </td><td> 96,7% </td><td> 79 </td><td> 78 </td><td> 98,7% </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Sensibilidade (96,7%) e especificidade (98,7%) de tempo-real de reacção em cadeia da polimerase (qPCR) na detecção do citomegalovírus em fixados em formalina, biópsias gastrointestinais embebidos em parafina. Esta tabela foi modificado de McCoy et ai 5. &quot;width =&quot; 400 es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Uma microtome típico com o bloco de tecido encaixado corretamente no cassete braçadeira A) como uma seção de 10 mícrons de espessura de tecido da biópsia é cortado é permitido rolar em um rolo de papel B), que é transferida para um tubo de microcentrífuga C). Todos os cinco rolos de tecido da biópsia são colocados em um único tubo de microcentrífuga para extração de DNA. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51570/51570fig2highres.jpg" width="400" /> A) Hematoxilina e eosina, de uma biópsia de cólon mostrando abundantes, inclusões de CMV típicos conforme indicado pelas setas (400X ampliação original) Figura 2.. B) A biópsia de cólon corado com um anticorpo monoclonal contra CMV mostrando o esperado padrão de coloração IHC (original aumento de 400X). <stRong&gt; C) Uma biópsia do cólon mostrando coloração IHC equívoca, com uma única célula pequena, fracamente coradas indicado pela seta (400X ampliação original). Este valor está sendo reproduzido com permissão de McCoy et al 5.

Watch this Scientific Journal Video about qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue at JoVE.com

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K visualizações.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Vídeo: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Detecção de imunofluorescência de dois análogos da timidina (CldU e UDI), em tecido primário

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Biologia

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...