This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

1. Doku Delme <ol><li> mikroskop lamı gözden geçirin ve ince nokta kalıcı bir kalem kullanarak ilgi bölge (ler) özetlemektedir. mikroskop lamı üzerine ilgi bölgeyi kaplayacak kadar büyük parafin filmin bir bölümünü kesip. sıkıca slayt filmi yerleştirin ve kaymasını filmi tutmak için kenarları boyunca filmi sarın. ama dışında - - bölge (ler) ince nokta kalıcı bir kalem kullanarak, anahat dokunma tutarak, tüm doku ve doku içinde ilgi bölgesi (ler) özetlemektedir. </li><li> filmi çıkarın ve ilgili doku bloğuna transfer. (Şekil 1) saygısız veya tüm doku anahat bloğunda doku gözlenen şeklini eşleşecek şekilde çevirerek filmi yönlendirin. sıkıca kaymayı önlemek için blok yüzeyine film bölümüne basın. </li><li> kalıcı bir kalem ucunu kullanarak, bölge (ler) arasında anahat boyunca (~ 0.2 mm) sığ fakat görünür girintileri yapmakmenfaati arasında fark, daha sonra filmi çıkarın. Yük, ayrı 1.5 veya 2.0 ml mikrosantrifüj tüpleri içine ağartıcı,% 70 etanol ve 1 ml su. </li><li> ucu tüp içeren ağartıcı batırılan ise yukarı ve aşağı birkaç kez yumruk kaydırarak tarafından belirlenen 0.6 mm zımba gelen reseptörü (kırmızı) yumruk temizleyin. % 70 etanol ve su ile yukarıda yineleyin (yani ağartıcı sağlamak için kritik bir kaldırılır). </li><li> 3 mm derinliğe kadar ilgi bölge içinde, doku içine yumruk basın ve yumruk çekme. kalemle yumruk dışarı iterek 1.5 ya da 2 ml&#39;lik tüp bağlama düşük içine çekirdek bırakın. -20 ° C (uzun süreli) veya kısa süreli kullanım için 4 ° C&#39;de çekirdekleri saklayın. </li><li> 1.4 adıma ve sonraki bölgeler veya numune ile devam etmek için uygun yumruk temizleyin. </li></ol> 2. FFPE doku çekirdekleri Deparaffinize <ol><li> Doku iç 1 ml ksilen ilave edilmesi ve 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın 1.5 ya da 2 ml&#39;lik tüplerde Carryout Parafinden arındırma lamların. Hea50 ° C&#39;de 3 dakika boyunca t. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) ve 5 dakika boyunca buz üzerinde, maksimum hıza (21.130 x g) ve yeri tüp 2 dakika süreyle santrifüj (mumsu artık madde üzerine katılaşmaya sağlar). </li><li> Dikkatle ksilen tedavi bir pipet kullanarak süpernatant ile menisküs etrafında biriken parafin kaldırmak ve tekrar (2.1-2.2 adımlar). </li><li> 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde, etanol (% 100) ve girdap 1 ml ilave edilir. RT (maksimum hız) 2 dakika süreyle santrifüj ve dikkatli bir şekilde etanol atın. bir zamanlar yukarıdaki adımı tekrarlayın. </li></ol> Deparafinize Damar 3. Homojenizasyon <ol><li> Homojenizasyondan önce etanol (% 100), 700 | il çekirdekleri yeniden süspanse edin. Motorlu bir doku homojenleştirici kullanılarak ince bir doku parçacıklar halinde çekirdek öğütmek (~ orta ayara, 1 dakika). carry-over kontaminasyon en aza indirmek için her bir numune arasındaki homojenleştirici probu temizleyin. <ol><li> ~ Ağartıcı RNaz nötrleştirme çözeltisi ve% 70 10 ml etanol ile 15 ml tüpler doldurun. Örnek homo sonragenization, yukarıda belirtildiği üzere temizleme çözeltilerinin her homojenizer probu yıkayın. yıkama aşamasında en yüksek hızda homojenleştirici çalıştırın. </li><li> doku ile prob silin ve sonda bir sonraki numune homojenize önce tamamen kurumasını bekleyin. Görme kalan doku parçaları için prob bıçakları inceleyin. Eğer bulunursa, tekrar probu temizleyin. Günlük temizlik çözümleri (çamaşır suyu, etanol ve RNaz nötralize çözeltisi) değiştirin. </li></ol></li><li> Homojenizasyondan sonra, daha fazla% 100 etanol (~ 300 ul) eklenmesi ile 1 ml numune hacmi getirmek. 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj dikkatlice RNA ekstraksiyonu ile devam etmeden önce yaklaşık 15-20 dakika süreyle etanol ve hava kuru pelet aspire. </li></ol> Proteinaz K ile 4. Sindirim <ol><li> pelet gevşetmek için 150 ul Proteinaz K sindirimi Tampon pelet ve fiske tüp tekrar süspansiyon. ısıya dayanıklı proteinaz K 10 ul ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın (yok) Tüp vorteks. hafif bir sallama ile 15 dakika boyunca 56 ° C&#39;de tüp içinde içeriği inkübe edin. </li><li> boru 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe izin verin. Tam soğutma takip eden aşamada etkin çökeltme için çok önemlidir. en yüksek hızda 15 dakika süreyle santrifüj. </li></ol> DNA 5. Ayrı RNA <ol><li> Dikkatle RNA saflaştırılması için yeni bir 1.5 ml, pelet bozmadan, süpernatant aktarın. </li><li> DNA saflaştırma için pelet (topak -20 ° C&#39;de 1 gün öncesine kadar 2-8 ° C&#39;de veya uzun süreler için için, oda sıcaklığında 2 saat süre ile muhafaza edilebilir) tutun. </li></ol> 6. RNA saflaştırma <ol><li> 15 dakika boyunca 80 ° C&#39;de RNA içeren süpernatant inkübe (bu kez fazla değil). Sonraki kısaca kapağın içinden damla toplamak için tüp santrifüj. </li><li> bağlama koşulları ayarlamak ve pipetleme karıştırın 320 ul Tampon RLT ekleyin. Daha sonra, 720 | il etanol (% 100), ve vorteks ekleyin. </li><li> transferi 62 ml toplama tüpüne yerleştirilmiş (kitinde) RNA döndürme kolonuna kurdu ve kalan içeriği kenara olabileceğiniz çökelti dahil numune 00 ul. ≥8,000 xg&#39;de 15 sn santrifüj, flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. </li><li> Aktarım ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için borunun kapak içinde birikebilen damlacıklar santrifüj içeren bir kolona numunenin geri kalan ve akış-through atın. </li><li> , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 350 ul Tampon FRN ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. </li><li> Yavaşça, 70 ul tampon RDD 10 ul DNaz I stok solüsyonu karışımı spin kolon zarına doğrudan ekleyin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için, döndürme kolonuna santrifüj 500 ul Tampon FRN ekleyin ve bir sonraki aşamada kullanım için akış-through kaydedin. Bir spin kolon yerleştirin küçük RNA&#39;ların kurtarma geliştirmek içinYeni 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü ve döndürme kolonuna önceki adımda elde edilen akış oranı uygulanır. </li><li> ≥8,000 xg&#39;de 15 sn santrifüj, flow-through atın ve bir sonraki adımda toplama tüpü yeniden. , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 500 ul Tampon RPE ekle flow-through atın ve bir sonraki adımda toplama tüpü yeniden. </li><li> ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 500 ul Tampon RPE ekleyin ve flow-through ile toplama tüpü atın. </li><li> Yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin 5 dakika boyunca maksimum hızda kapağı ve santrifüj açın. flow-through ile toplama tüpü atın. </li><li> Yeni bir 1.5 ml&#39;lik spin sütunu yerleştirin doğrudan spin kolon zar üzerine RNaz içermeyen su 20 ul, ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca tüp inkübe edin. 1 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüje RNA elute edin. -80 ° C&#39;de elüt RNA numunesi saklayın. </li></ol><ol><li> Proteinaz K tamponu 45 ul adım adım ilavesiyle RNA ekstraksiyonu sırasında elde edilen pelletini (400 mM Tris 7.5, 400 mM NaCI, 3 mM MgCI2,% 4 SDS); 45 ul H2O; ve yüksek gücü proteinaz K, 400 ug </li><li> 24 saat boyunca 56 ° C&#39;de yukarıda belirtilen çözelti inkübe (tavsiye edilen) ya da gece boyunca karıştırılmıştır. Kısaca 2 çalkalama olmaksızın sıcak ve 90 ° C &#39;de Performincubation kapağın içerisinden damla toplama mikrosantrifüj tüpü santrifüjlenir. </li><li> Örnek, oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve daha sonra 4 ul RNaz A (100 mg / ml) ekleyin izin verin. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> örnek 200 ul Tampon AL ekleyin ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır. Daha sonra,% 100 etanol içinde 200 ul ekle ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır. ≥8,000 x g&#39;de 1 dakika için sağlanan spin kolon, bir yerde bir 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde, ve santrifüj Numunenin tamamı aktarın. </li><li> ile toplama tüpü atın-Akmasına ve yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin. , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn, spin kolona santrifüj 700 ul Tampon Aw1 ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. </li><li> , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn, spin kolona santrifüj 700 ul Tampon Aw2 ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. Daha sonra, ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon, santrifüj% 100 etanol 700 ul ve akış yoluyla sahip toplama tüpü atın. </li><li> Yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin 5 dakika boyunca tam hızda spin kolon kapağını ve santrifüj açın. flow-through ile toplama tüpü atın. </li><li> yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde spin kolon yerleştirin ve ısıtılmış nükleaz içermeyen su (50 ° C) 25 ul ekle. 10 dakika boyunca 50 ° C&#39;de sütun ve tüp inkübe edin. maksimum hızda 1 dakika için santrifüj, kolona nükleaz içermeyen su (RT) 25 ul ekle ve boyunca inkübeOda sıcaklığında 1 dakika. </li><li> maksimum hıza (21.130 x g) ve genomik DNA (toplam DNA, yaklaşık 50 ul) ihtiva eden hasat akış yoluyla 1 dakika için santrifüjleyin. -20 ° C&#39;de sütun Mağaza (durumda başka bir elüsyon sonra gereklidir). </li></ol>

<ol>
	<li>Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+your+new+cancer+biomarker+may+never+work:+recurrent+patterns+and+remarkable+diversity+in+biomarker+failures.">Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures.</a> Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Next-generation+Sequencing+of+Advanced+Prostate+Cancer+Identifies+Potential+Therapeutic+Targets+and+Disease+Heterogeneity.">Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity.</a> Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).</li><li>Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+selection+bias+with+tumor+tissue+retrieval+in+molecular+epidemiology+studies.">Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies.</a> Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).</li><li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples.">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li><li>Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin+embedded+material+for+genetic+and+epigenetic+analyses.">DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Turashvili, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+quantity+and+quality+from+paraffin+blocks:+defining+optimal+fixation,+processing+and+DNA/RNA+extraction+techniques.">Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques.</a> Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+laser+capture+microdissection+for+analysis+of+retinal+mRNA/miRNA+expression+and+DNA+methylation.">Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation.</a> Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).</li><li>Bonin, S., Stanta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+extraction+methods+from+fixed+and+paraffin-embedded+tissues+in+cancer+diagnostics.">Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).</li><li>Bonin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicentre+validation+study+of+nucleic+acids+extraction+from+FFPE+tissues.">Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues.</a> Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).</li><li>Montaser-Kouhsari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+Coring+for+Large-scale+Studies+in+Molecular+Pathology.">Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).</li><li>van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+a+fully+automated+high-throughput+DNA+extraction+method+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+for+KRAS,+and+BRAF+somatic+mutation+analysis.">Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).</li><li>Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coextraction+and+PCR+Based+Analysis+of+Nucleic+Acids+From+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Specimens.">Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens.</a> J. Clin. Lab. Anal. , (2014).</li><li>Hennig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+extraction+of+DNA+and+RNA+from+a+single+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+section+for+analysis+of+both+single-nucleotide+polymorphisms+and+mRNA+expression.">Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression.</a> Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).</li><li>Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+method+of+DNA+extraction+from+small+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+molecular+oncologic+testing.">A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing.</a> BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).</li><li>Torrente, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+formalin-fixed+laryngeal+biopsies:+Comparison+of+techniques.">DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques.</a> Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).</li><li>Okello, J. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+in+the+recovery+of+nucleic+acids+from+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+autopsy+tissues.">Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues.</a> Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).</li><li>Abramovitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+RNA+extraction+from+FFPE+tissues+for+expression+profiling+in+the+DASL+assay.">Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay.</a> BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).</li><li>. Methods of RNA Quality Assessment Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment">https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment</a> (2012)</li><li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-specific+PCR:+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands.">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li><li>Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+repetitive+element+DNA+methylation+by+MethyLight.">Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight.</a> Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).</li><li>Yegnasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+CpG+Islands+in+Primary+and+Metastatic+Human+Prostate+Cancer.">Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer.</a> Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

ilgi doku bölgeleri arasında DNA ve RNA, başarılı bir çıkartma için doğru karot kritiktir. Bu protokol, 0.6 mm çapında çekirdek izole edilmesi için, bir doku zımbanın kullanımını tarif ve mikroskop notasyonları aktarma işlemini FFPET blokları, ilgili kayar özetlenmektedir. üreticinin protokolüne değişiklikler etkin yaklaşık protokolü amaçlanmıştır olan mikrotom bölümleri 50 kat daha kalın olan çekirdeklerden nükleik asitleri, elde etmek için gerekli oldu. çekirdek doku kesitlerinde daha fazla parafin akrabası, tekrarlanan ksilen ve etanol tedavi adımlarda çekirdek etkili parafinden arındırma içerebilir beri istendi. Post-Parafinden arındırma lamların adımların başarısı, uygun mekanik doku çekirdekleri homojenizasyon ve verimli proteinaz K sindirimi bağlıydı. proteinaz K sindirimi daha da iyileştirme yapılabilir. Bu kayda değer olduğunu bu yöntem tanımladıhistopatoloji slaytlar mukabil tanımlandığı gibi bloğun yüzeyi üzerinde ilgili fies alanları. 3 ya da 4 mm derinliğinde olabilir çekirdek hasat dokusu gibi, bu protokol, kullanıcıların hücreleri veya dokular blok yüzeyinin altında yatıyordu ne endişe olabilir. Bu geçerli bir endişe olmasına rağmen, (referans 27 gözden) birden fazla çalışmalar doku çekirdekleri sadakatle yinelenen veya üç çekirdek ilgi alanından örneklenir, özellikle patolojik doku blokları histolojik ve moleküler özellikleri temsil ettiğini göstermiştir. Bu protokolde kabul edilen modifiye ticari çıkarma seti aynı doku hem DNA ve RNA eş zamanlı çıkarma olanak olarak, protokol değerli biyolojik malzeme tasarrufu sağlar ve aynı örnekten iki sonuçlanan nükleik asitler arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. RNA ve DNA eşzamanlı çıkarma yarıya emek ve doku tükenmesi keser ve gen İfade kesin entegre analiz sağlarsalgılamanın yanı sıra DNA&#39;da bulunan epigenetik ve genetik özellikler. bu temsili doku çekirdeklerinden hem RNA ve DNA verimleri beri tipik sırasıyla 600 ve 300 ng aşan ve en güncel PCR ve yeni nesil dizileme uygulamaları genellikle 10-100 ng gerektirdiğinden, bu protokol ile saflaştırılmış örneklerin çoğu yeterli vermelidir birkaç alt analizler için malzeme. Bu protokol bağımsız laboratuarlarda arasında tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir (Selvarajah ve diğ., Prep olarak.). Bu protokol ile ilgili RNA RT-PCR veya popüler bir birden fazla analit platformu kullanılarak gen ekspresyon analizi için yeterli kalitede ve DNA metilasyon spesifik PCR deneylerinde iyi performans göstermiştir. Yeni nesil dizileme kurtarılmış nükleik asitlerin programı değerlendirmeyi amaçlayan ileri çalışmalara gereksinim duyulmaktadır. Bu nedenle, çok sayıda modifikasyonlar uygun fo render ince FFPET bölümleri için tasarlanmış ticari olarak temin protokolü için yapılmıştır0.6 mm FFPET çekirdeklerinden RNA ve DNA r eş çıkarma. protokol prostat kanseri örneklerinin büyük bir kohort ve meme, beyin ve mesane kanserleri alınan örneklerin sınırlı sayıda sürekli yüksek verim gösterdi. Genel olarak, protokol büyük iyi açıklamalı doku koleksiyonları hedeflenen gen bazlı analizler yürütmek için olanak sağlamak gerekir. Önemlisi, protokol çoğu downstream uygulamalar için FFPET ilgi bölgelerin verimli odaklı örnekleme nispeten küçük eller zamanında ve yeterince yüksek verim sağlar.

Genomik biyomarker araştırma doğru ve güvenilir hastalık durumunu yansıtmak ve klinik olarak yararlı bir şekilde bunu. 1 Biyomarker gelişme iyi açıklamalı doku örneklerinin retrospektif analizi güvenen moleküler korelasyonun tespit etmeyi amaçlamaktadır. Hastalıklı ve normal doku örnekleri olarak taze donmuş doku uzman biyobankalar ya da klinik arşivlerinde formalin-sabit parafine gömülü doku (FFPET) blok olarak ya depolanır. Taze dondurulmuş doku, yüksek kaliteli nükleik asitlerin ekstre sağlar ve yaygın olarak genomik biyomarker bulma çalışmalarında kullanılmıştır. 2,3 Bununla birlikte, daha az doku örnekleri biyobankalar mevcuttur ve bu doku okuyan büyük örnekleri, sıradışı kategoriye doğru bir eğilimi getirmektedir banka dokuya daha fazla yetenekleri ile özel merkezlerde görülen hastalık ve hastaların. 4 FFPET, aksine, hastalıklı insan ve hayvan dokuları için varsayılan depolama yöntemidir. FFPET blokları hücresel m sürdürürkenorphology, sabitleme işlemi, çapraz bağlantılar nükleik asitlere diğer hücre bileşenleri olarak kullanılabilirler. Çapraz bağlı, RNA ve DNA geri kazanılabilir, fakat sadece bozulmuş, çok parçalı bir formları. 5,6 Bununla birlikte, bu, DNA ve RNA fragmanları mRNA ekspresyonu, DNA hipermetilasyonu ve hedef sıralama dahil tahlillerin genişleyen tadını analizine uygundurlar. 7,8 büyük miktarda ve araştırma için kullanılabilir FFPET çeşitliliği Bu fırsattan yararlanmak için, verimli ve güvenilir bir çıkarma protokolü için bir ihtiyaç vardır. dokuda biyobelirteç araştırmaları büyük bir kısmı kanser üzerinde duruluyor. hastalıklı dokunun diğer türleri gibi, kanser, doku, genellikle hücre korunması ve hücre türü önemli bölgesel heterojen gösterir. biyobelirtecin araştırma moleküler özellikleri ile hastalıklı dokunun bileşenleri ilişkilendirmek için yeteneği bağlı olduğundan, bu sürecin önemli bir adımdır iyi d korunmuş ve zenginleştirilmiş doku kesin hasat olduğunuçalışılan hastalığı bulunanlarda. FFPET iki zenginleştirme teknikleri sıklıkla kullanılmaktadır: lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), ve mikrotom kesit. LCM yüksek doku hasadı odaklı sağlayan ve heterojen dokularda spesifik, iyi korunmuş hücre tipleri izole etmek için kullanılabilir. 9,10 Ancak LCM örneklerin büyük sayılar için alıcı engelleyici zaman pahalı ekipman gerektirir ve. Mikroskobik kesit ince kesitler FFPET bloklardan kesilen bir daha yaygın kullanılan bir süreçtir. 11,12 Mikroskobik kesilmiş bölümleri genellikle hücre korunması heterojen doku içerir (örneğin, nekrotik vs iyi korunmuş) ve kompozisyon (örn, kanser genel dolayısıyla huylu parankimi) ve ayrı olarak incelenmiştir iyi moleküler özelliklerinin homojenizasyon neden olabilir. Böylece, ilgi konusu hücreler için zenginleştiren yüksek verimli bir yöntem için bir ihtiyaç vardır. Üçüncü bir yöntem, FFPET çekirdeklerinden nükleik asitlerin izolasyonu, bu zenginleşme sağlayan yüksek throug için uygundurprotokolleri hput ve ayrı doku çekirdeklerinden RNA ya da DNA izole etmek için başkaları tarafından kullanılmaya başlanmıştır. 7,13,14 Yayınlanmış protokollere bir dizi FFPET (Tablo 1) nükleik asitlerin çıkarılma yöntemlerinin belirtir. Ancak, RNA ve DNA aynı dokudan çıkarılan protokolleri değil doku çekirdekleri için, mikrotom doku bölümleri için optimize edilmiştir. Doku özgüllük arttı teklif 15,16 Benzer şekilde, yayınlanan protokolleri, ya doku çekirdek veya slayt microdissections yoluyla, prosedürleri belirtmek DNA ekstre ancak burada değil RNA. 7,17, aynı doku iç hem DNA ve RNA, çift çıkarılması için optimize edilmiş bir protokol için gösterilmiştir. Doku çekirdekleri FFPET blok eşleştirilmektedir çıkar bölgelerine dokusu mikrodizisi (TMA) zımbalar sokulmasıyla hasat edilir. haritalama bir marker kalem ile bir mikroskop lamı açıklama ve ilgili FFPE yüzeyine ek açıklama aktarılması ile gerçekleştirilirT bloğu (Şekil 1). Bu protokolün gelişmesine yol açmıştır Önceki çalışma çeşitli ticari olarak temin edilebilen nükleik asit emiş sistemleri bir mukayesesini de içerdi. Bu karşılaştırmada, ticari protokollere modifikasyonlar, aşağıda tarif edildiği gibi, en yüksek DNA ve RNA verimi ve kaliteyi (Selvarajah et al., Prep olarak) temin etmiştir. Doku çekirdekleri genellikle FFPET ekstraksiyon protokolleri 11,12,14,18 kullanılan 5-10 um mikronluk kesitler daha kalındır - 20 ve parafin daha değişken miktarlarda içerebilir. Bunu dengelemek için, Parafinden arındırma lamların ksilen ve etanol tedavileri tekrarlayarak ve motorlu homojenizasyon adımı (Şekil 1) tanıtarak tarafından geliştirilmiştir. Ayrıca, proteinaz K sindirimi süreleri DNA verimini artırmak için uzadığı tespit edildi. Genel olarak, bu protokol maliyet-etkin ve la hastalığın moleküler ve histopatolojik arasındaki bağlantıların kurulmasını sağlarrge, iyi karakterize popülasyonları. bütünüyle protokol özel ve pahalı ekipman için çok az ihtiyacı olan eller zaman 3 saat olmak üzere, 2 gün içinde güvenilir gerçekleştirilebilir. Adım-adım protokol üreticinin protokol değiştirilmiş bir versiyonu olarak bundan olduğunu. 21 özel reaktifler, ekipman ve üreticileri için Malzemeleri / Ekipman Tablosuna bakınız.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Plastic paraffin film, &#34;Parafilm &#39;M&#39;&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Bemis&#160;</td>
			<td style="width:119px;">RK-06720-40</td>
			<td style="width:167px;">Any generic paraffin film will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Hypochlorite, &#34;Ultra Bleach&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Likewise</td>
			<td style="width:119px;">53-2879-2</td>
			<td>Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Molecular biology grade absolute ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-500</td>
			<td>Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Grade H2O</td>
			<td style="width:217px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-293</td>
			<td>Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">0.6mm Punch Set for Beecher Instruments&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Estigen</td>
			<td style="width:119px;">MPO6[Yellow]</td>
			<td>Make sure to use the red receiver punch from the set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fine point permanent marker</td>
			<td style="width:217px;">Sharpie</td>
			<td style="width:119px;">10365796S</td>
			<td>Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FFPE tissue block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Stained tissue slide corresponding to FFPE block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">05-408-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Histology Xylene</td>
			<td style="width:217px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">CA 95057-822</td>
			<td>Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Biology Grade 2-Propanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:283px;">AllPrep FFPE DNA/RNA Kit&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature stable proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">High potency proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-049</td>
			<td>Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)</td>
			<td style="width:217px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">RNaseA 100mg/mL</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9001271</td>
			<td>Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">-20&#176;C and -80&#176;C Laboratory Freezer &#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Digital Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pipettes and filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Heating blocks or water baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Anhydrous Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane</td>
			<td style="width:217px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL</td>
			<td style="width:217px;">BD Integra</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:217px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">3026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Multianalyte gene expression platfrom (nCounter &#174; CAE codeset and Nanostring nCounter platform)</td>
			<td style="width:217px;">Nanostring nCounter platform, Nanostring</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit&#174; RNA BR Assay Kit)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

Bu protokol, doku çekirdekleri arasında DNA ve RNA geri kazanılması doku bölümleri için tasarlanmış ticari bir ekstraksiyon sisteminin modifikasyonlar için optimize edilmiş bir yöntemle temsil eder. Optimizasyon doku homojenizasyon giriş, DNA ekstraksiyonu için daha güçlü proteinaz K kullanımını ve doku sindirim süresi uzatma dahil. Grafikler ve istatistiksel analizler 2-yönlü ANOVA, lineer regresyon ve korelasyon dahil. Proteinaz Sindirim Optimizasyonları Ticari kit yüksek DNA verimi (Şekil 2A) ile sonuçlanan, daha kuvvetli bir proteinaz K ile ikame edilmiş bir oda sıcaklığı istikrarlı bir proteinaz K solüsyonu içermektedir. , DNA verimini artırmak için, sindirim, 2 den 24 saat kadar uzatıldı. Anlamlı bir fark iki zaman noktası arasında görüldü, ancak 24 saat sindirim sa daha tutarlı verim sağlamak için ortaya çıktıörnek olarak şunlar verilebilir. Ancak, daha fazla inkübasyon 48 saat daha DNA kurtarma geliştirmek vermedi (Şekil 2B; p = 0.74). FFPE Prostat Kanseri Doku Örnekleri tipik DNA Kurtarma Optimize edilmiş protokolü kullanarak, RNA ve DNA eş çıkarılan 3 ila 14 yaşındaki örnek yaş arasında değişen 333 prostat kanseri FFPET örneklerinden idi. Her örnekten, 3 doku çekirdekleri (± 0.13 mm 3 0.95&#39;lik ortalama toplam doku hacmi) girdi olarak kullanılmıştır. nükleik asitler moleküllerin boyut dağılımının değerlendirmelerini konsantrasyonlarını tahmin ve sağlayabilir diğer mikroakışkan bazlı jel-elektroforez yöntemleri bulunmakla birlikte, bu tür yöntemleri tekrarlanabilir nükleik asitler kantifikasyonunu vermeyin gibi flourometrically bazlı deneyler yapmak RNA ve DNA arasındaki farkı ayırt edemez. 22 Ve mikroakışkan bazlı jel-elektroforez sonuçları parçalanmış için güvenilir değildir, çünküFFPET türetilen nükleik asitler, 23 nükleik asit verimi (detaylar için reaktif listesine bakınız) florometrik ölçüldü. Ortalama verim RNA 2.270 ng DNA (Şekil 3A) 820 ng. Bu çalışmada incelenen tüm FFPET örneklerinin yaklaşık% 90 DNA ≥100 ng RNA&#39;nın ≥ 500 ng elde edildi. İlginçtir, FFPET numune ve nükleik asit kurtarma (Şekil 3B) yaş arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı. (R 2 = 0.39; p &lt;0.0001) Genel olarak, RNA ve DNA verimi örnekleri arasında korelasyon DNA&#39;dan daha fazlası gibi iki kat daha fazla bir RNA her bir örnek (Şekil 3C) geri kazanıldı, ancak. Pilot ve optimizasyon çalışmaları prostat dokuları üzerinde yapılan gibi, bir sonraki adım arşiv doku birkaç ek türleri bu protokolün performansını araştırmaktır. ile başlayan ameliyatla çıkarıldı ve otopsi FFPET örnekleri olmak temsilBu enfeksiyonlar iyi karaciğer (1 örnek vaka 1), beyin (1 kasasından 8 örnek), mesane (2 vakada 2 örnek), ve meme (3 olgudan 3 örnek) kanserleri, protokol DNA&gt; 100 ng vermiştir ve RNA% 90 numune (Şekil 3D). nükleik asit verimleri cerrahi dokularda daha otopsi dokularda düşük iken, temsilcisi sonuçları protokol farklı sitelerden kaynaklı kanserler arasında benzer verim ürettiğini göstermektedir. RNA değerlendirilmesi ve DNA bütünlüğü ve Mansap Analizi onların Temsilcisi Performans 47 8 seçilen FFPET prostat kanseri örneklerinde genler ve (bir pozitif kontrol olarak) taze PC-3 prostat kanseri hücre dizisi örneğin RNA ekspresyon analizi FFPET için optimize edilmiş ticari birden fazla analit gen ekspresyon platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. PC3&#39;de mRNA sayımları FFPET sa dan daha tipik yüksektiörnek olarak şunlar verilebilir (Şekil 4A). Bununla birlikte, tüm genlerinin göreceli ifade karşılaştırılması, FFPET prostat kanseri örnekleri RNA hem kaynakları RNA ekspresyon profili için uygun olduğunu gösteren, PC-3 RNA benzer sentezleme profilleri göstermektedir. Bu protokol ile ekstre edilmiş genomik DNA&#39;nın performansını göstermek için, FFPET örneklerinden bisülfitle dönüştürülmüş DNA ekstreleri metilasyonu ile çoğaltılmıştır spesifik PCR (MSP). 24 insan genomunda milyonlarca kopya içinde mevcut ALU tekrar eden kısımlar, çok fazla metilatlanmış bölgelerin MSP analizi, 25 genomik metilasyon kontrol olarak kullanılmıştır, ve numuneler arasında en az farklılıklar göstermektedir bekleniyordu. Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, ALU MSP metilasyon seviyelerinde, farklı numuneler arasında görülen herhangi bir varyasyona az oldu. Bundan başka, GSTP1, prostat kanserinde, ancak huylu örneklerde hipermetile bilinen bir gen göre MSP deneyleri, 26 herhangi bir bulgulanabilir Amplif gösterdihuylu örneklerden DNA ications. Beklendiği gibi, düşük qPCR döngüsü eşik değerleri metile GSTP1 kopya zenginleştirme gösteren kanserli dokularda DNA tespit edilmiştir. Bu protokol ile geri kazanılmış, nükleik asitlerin kullanımı ayrıca nükleik beyin (post-mortem) selim karaciğerden ve elde asitler ve iki cerrahi bir müdahale göğüs kanseri örneklerinden hazırlanan tipik alt deneylerde test edilmiştir. İkisi de, RT-qPCR bazlı ekspresyon MSP deneyleri, meme kanseri ve karaciğer FFPET iyi performans, ancak RT-PCR deneyi, RNA bozulmuştur düşündüren, ölüm sonrası beyin tümörü örnek yüksek ölçüde sentezlenmiş bir mRNA (Şekil 4C) yükseltmek için başarısız nedeniyle gecikmeli doku fiksasyonu muhtemeldir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig1.jpg" /> Şekil 1:. FFPET Örnekleri için Ekstraksiyon Usulü Genel Bakış rakam ilgi nasıl bir alanı göstermektedirdoku bloğu bir mikroskop lamı gelen histopatolojik seçimine dayalı eşleştirilir. Üç 0,6 mm doku çekirdekleri daha sonra bir araya homojenize ve daha sonra RNA ve DNA hem de çıkarma tabi biyopsi yumruk kullanarak her doku alanından elde edilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54299/54299fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig2.jpg" /> . Şekil 2: İki proteinaz K (Sıcaklık Kararlı ve Yüksek Etkili Enzimler) ve ikincisi için inkübasyon Times bir Aralığı boyunca test (A) Proteinaz K Performans gelen ng Nükleik Asitler (DNA ve RNA) verimleri / FFPET mm 3 farklı tedarikçilerden. DNA ekstraksiyon k ile birlikte sıcaklık kararlı enzimi kullanılarak temsili FFPET numunesi üzerinde gerçekleştirilmiştirBaşka bir üreticinin daha güçlü enzim karşı. DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için en uygun Proteinaz K inkübasyon süresi belirlenmesi (B). yüksek konsantrasyonda proteinaz K sindirimi performansı 3 FFPET numuneleri kullanılarak üç farklı inkübasyon süreleri değerlendirilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hata temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54299/54299fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54299/54299fig3.jpg" /> Şekil 3:. Nükleik Asitler (DNA ve RNA) Örnek Yıllara ve Temsilci Doku Türleri karşısında Toplam İçindeki FFPET Evi / mm 3 ng verimleri (A) Toplam formalin ile fikse parafine gömülü doku nükleik asitleri kurtarıldı. sunulmuştur nükleik asitler miktarları 333 FFPET örneklerinin ekstraksiyon dayanmaktadır Uoptimize protokol şarkı. Iyileşti toplam DNA ve RNA ve FFPET örneklerinin yaş arasında (B) Korelasyon arsa. Kullanılan ekstre FFPET örnekleri 333 prostat örneklerinde eşzamanlı ekstre DNA ve RNA verimi arasındaki 2012 (C) Korelasyon yaşındaki 2000 elde edildi. DNA ve RNA verimleri arasında pozitif bir korelasyon vardır. Ek arşiv doku türlerini kullanarak protokolü (D) Gösteri. Optimize edilmiş bir protokol 14 kanseri (meme, mesane, beyin) ve normal (karaciğer) örnekleri nükleik asitlerin ekstre edilmesi için kullanılmıştır. Hata çubukları SEM temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54299/54299fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54299/54299fig4.jpg" /> Şekil 4: RNA ve DNA performans Tissu&#39;dan Co-özümlendiAlt Uygulamalar e çekirdek. (A) mRNA FFPE prostat kanseri dokular için taze PC-3 hücre hattı, kontrol için de geçerlidir. Her bir nokta ayrı ayrı çıkarılan 3 teknik çoğaltır ortalamasını temsil eder. Taze PC-3 hücre çizgisi RNA değerler sarı bar ve FFPET dokusu değerleri ile gösterilmiştir renkli noktalar ile temsil edilmektedir. FFPET prostat kanseri örneklerinin DNA (B) metilasyon spesifik PCR. Döngü eşik değerleri 50 ng / bisülfitle dönüştürülmüş DNA reaksiyon kullanılarak, beklendiği gibi yapılan 10 numune için elde edilmiştir. Tüm FFPET örneklerinden ALU MSP deneyleri benzer döngü eşik değerleri (p&gt; 0.67) vardı. GSTP1 MSP tahlilleri yüksek metilasyon (düşük devir eşiği) iyi huylu prostat oranla prostat kanserinde düzeyleri gösterdi. (C) ilave doku tipleri DNA ve RNA kalitesinin değerlendirilmesi. HPRT1 gen ifadesi ve alu gen metilasyon analizleri elde nükleik asitler (sırasıyla RNA ve DNA) gerçekleştirildi veyamal karaciğer (otopsi) ve beyin (otopsi) ve meme kanserleri (bütün FFPET). prostat sonuçları karşılaştırma için gösterilmiştir. Not: Benzer sonuçlar otopsi numune başarısız mRNA amplifikasyonu hariç her bir doku tipinden gözlenmiştir. Her nokta veya çubuk bir örnek temsil eder ve hata çubukları SEM temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54299/54299fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="12"> doku Çekirdekler </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Doku Girdi (mm3) </td><td rowspan="2"> Ekstre Nükleik Asit </td><td colspan="2"> onaylama </td><td colspan="3"> Kalite kontrolü: DNA </td><td colspan="4"> Kalite kontrolü: RNA </td></tr><tr><td> (Örnekleri arasında) </td><td> Numune yaşı (yıl) </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><html><td> PCR </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> Pikor ve diğ. </td><td> 43-129 </td><td> DNA </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montaser-Kouhsari ve ark. </td><td> 18-29,5 </td><td> RNA </td><td> 763 </td><td> 0-25 </td><td></td><td></td><td></td><td> 843 </td><td> Veri yok </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bu kağıt </td><td> 1.71 </td><td> DNA ve RNA </td><td> &gt; 350 </td><td> 3-12 </td><td> 820 </td><td> 100-500 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 2270 </td><td> 100-500 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td>/ftp_upload/54299/check_mark.jpg &quot;/&gt; </td></tr><tr><td colspan="12"> Doku kesitleri </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> doku Girdi </td><td rowspan="2"> Ekstre Nükleik Asit </td><td colspan="2"> onaylama </td><td colspan="3"> Kalite kontrolü: DNA </td><td colspan="4"> Kalite kontrolü: RNA </td></tr><tr><td> (Örnekleri arasında) </td><td> Numune yaşı (yıl) </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> Heikal ve diğ. </td><td> 5 x 5 um </td><td> DNA </td><td> 12 </td><td> 7-22 </td><td> 88-300 </td><td> 103-351 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chung ve diğ. </td><td> 1 x 20 um </td><td> RNA </td><td> 9 </td><td> &gt; 5 </td><td></td><td></td><td></td><td> 16,000- 23,000 </td><td> 100-200 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Antica ve ark. </td><td> 2 x 4 mm </td><td> RNA </td><td> 18 </td><td> Veri yok </td><td></td><td></td><td></td><td> Bilinmeyen (621 ng / ul) </td><td> 80-202 + </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Ghatak ve diğ. </td><td> 5 x 5 um </td><td> DNA ve RNA </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 14 256 </td><td> &lt;1030 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 16 000 </td><td> 109-400 + </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Hennig ve diğ. </td><td> 1 x 10 um </td><td> DNA ve RNA </td><td> 210 </td><td> 1-25 </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td colspan="12"> Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Doku Girdi (mm2) </td><td rowspan="2"> Ekstre Nükleik Asit </td><td colspan="2"> onaylama </td><td colspan="3"> Kalite kontrolü: DNA </td><td colspan="4"> Kalite kontrolü: RNA </td></tr><tr><td> (Örnekleri arasında) </td><td> Numune yaşı (yıl) </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr&gt; <tr><td> Kar ve diğ. </td><td> 1-2 </td><td> DNA </td><td> 110 </td><td> 0-2 </td><td> 430 </td><td> Veri yok </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Doku çekirdekleri, bölme ve lazer yakalama microdissections için yayınlanmış olan DNA ve RNA ekstraksiyonu protokolleri karşılaştırması da içeren PCR ve Nanostring tahlilleri kullanarak bu yöntemlerin çeşitli molekül son nokta değerlendirme vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction at JoVE.com

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

preparation-formalin-fixed-paraffin-embedded-tissue-cores-for-both

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K Görüntüleme.  Queen's University.  Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır. 

Video: Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Bio-Rad Total RNA Kiti Kullanarak Neuroprecursor Hücreler RNA Ekstraksiyon

Biyoloji

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...