Reconocemos Amy Thomasson por su ayuda en la preparación de este manuscrito, y Fredrik Skarstedt y Ryan Christy por sus esfuerzos en la preparación de las figuras.

Con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional, se realizó una búsqueda en la base de datos de laboratorio electrónico para identificar fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) bloques que representan los casos de infección por citomegalovirus (CMV) en gastrointestinal (GI) biopsias diagnosticadas por histopatología (hematoxilina y eosina (H &amp; E) y / o inmunohistoquímica (IHC)). 1. Procesamiento de tejido de FFPE GI biopsia de tejido <ol><li> Recoger FFPE GI bloques de tejido de biopsia para el citomegalovirus (CMV) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Estos bloques se almacenan a temperatura ambiente. </li><li> Tubos Pre-label 1,7 ml de microcentrífuga con número de identificación único de la cuadra. </li><li> Bloquee el volante microtomo. </li><li> Asiente el bloque de tejido en la abrazadera de cassette. </li><li> Utilizando una cuchilla nueva sin usar, alinee el bloque al ángulo cuchillo en el microtomo. </li><li> Ajuste el micrótomo para cortar 10 micras de espesor secciones. </li><li> Desbloquear ªe volante y avanzar el bloque hacia la hoja. </li><li> Cortar 5 secciones del bloque a intervalos de espesor 10 micras, permitiendo que cada corte a rodar en un rollo de tejido. Asegúrese de que cada rollo contiene una representación adecuada de los tejidos de biopsia deseados. </li><li> Bloquee el volante microtomo. </li><li> Con unas pinzas, colocar todos los 5 rollos de tejido en el tubo de centrífuga de pre-marcado, teniendo cuidado de sólo manipular el desplazamiento por la parafina con el fin de reducir el potencial de contaminación cruzada. Coloque la tapa en el tubo y colocarlo de nuevo en el estante. </li><li> Retire el bloque de tejido del microtomo. </li><li> Retire y deseche la hoja. </li><li> Descontaminar las superficies o utensilios que puedan haber estado en contacto con el tejido anterior. </li><li> Coloque una hoja nueva sin usar en el soporte de la cuchilla. </li><li> Repetir los pasos 1.4 a 1.14 para cada bloque adicional para ser procesado. Los tubos de microcentrífuga que contenían los rollos de tejido se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta que el time de la extracción de ADN. </li></ol> 2. Extracción de ADN de Rollos de FFPE GI biopsia de tejido NOTA: Este protocolo es una adaptación del prospecto del kit FFPE tejido de ADN de extracción (PRECAUCIÓN: consulte la Hoja de Seguridad (MSDS)). <ol><li> Añadir 1 ml de xileno (PRECAUCIÓN: Consulte la MSDS) para cada tubo de microcentrífuga muestra. Cierre la tapa y agitar vigorosamente durante 10 segundos. </li><li> Proceder a la extracción de ADN específicamente indicado en el prospecto del producto del fabricante con las siguientes modificaciones. </li><li> En primer lugar añadir 6 l de la de control interno (IC) a cada tubo de microcentrífuga. <ol><li> Después de la ATL / proteinasa K de incubación de lisis a 56 º C durante 1 h, se incuba a 99 ° C durante 30 min, en lugar de 90 ° C durante 1 hora. </li><li> Durante el paso final de elución de ADN, abrir con cuidado la tapa de la columna de purificación de ADN y aplicar 50 l de DNasa / RNasa libre de agua destilada en el centro de la membrana, en lugar de Buffer ATE. NOTA: Consulte el prospecto del envase para el almacenamiento y preparación de reactivos apropiada. ADN debe ser extraído de los 5 rollos FFPE. Realizar todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR para CMV <ol><li> Reacción en Cadena de la Polimerasa Procedimiento (PCR) <ol><li> Generar una hoja de cálculo Excel de PCR para el ensayo de ejecución CMV. Esta hoja de cálculo Excel calcula la cantidad total de cada reactivo necesario para constituir la mezcla principal con Mg. Se multiplica la cantidad de cada reactivo necesario por muestra (enumerados a continuación) veces el número de muestras y controles más uno (para compensar la pérdida debido a la pipeteo). <ol><li> Incluir los siguientes reactivos en cada reacción de PCR en la cantidad que se indican: Reactivo0; Cantidad por la muestra Mix master LC CMV viales 12,5 l Mg solución amarillo vial 2,5 l Volumen total 15,0 l </li></ol></li><li> Incluir en cada ensayo, ejecute un agua o ningún control de destino (NTC), control negativo, control positivo bajo, un alto control positivo, y, o bien QS3 o QS4, y todas las muestras de pacientes. Los capilares deben establecerse en este orden. </li><li> Obtener el bloque de enfriamiento específica para el instrumento de PCR en tiempo real que se almacena a 4 ° C. Colocar los tubos capilares apropiados en el bloque de refrigeración. No toque la superficie de los tubos capilares. Siempre use guantes al manipular los capilares. </li><li> Configure todas las reacciones en cadena de la polimerasa en una campana limpia no contaminada con la producción de amplificaciónts. <ol><li> Retire el número correcto de los viales principales del kit de PCR para probar todas las muestras de los pacientes, además de 5 controles. Deje los viales principales, solución de Mg y PCR grado descongelamiento en agua en el bloque de refrigeración. Cada vial principal contiene suficientes reactivos para 12 pruebas. </li><li> Agite suavemente los viales principales y rápido hacerlos girar en la centrífuga a la máxima velocidad. </li><li> Combine el contenido de cada vial principal en un vial y agite suavemente de nuevo. </li><li> Combine la mezcla maestra y la solución de Mg en las cantidades indicadas en la hoja de PCR en un tubo de microcentrífuga estéril individual. </li><li> Mezclar suavemente y alícuota de 15 l de mezcla maestra con Mg en cada tubo capilar, excepto el capilar en la posición 5, que es para el estándar de cuantificación (QS). </li></ol></li><li> Mueva el bloque de refrigeración que contienen los tubos capilares y maestro de la mezcla con Mg de la campana limpia a una campana de procesamiento. </li><li> Añadir 2 l de control interno (CI) a los restantes 30 l de mastermezclar con Mg. Mezclar suavemente y alícuota de 15 l en el capilar en la posición 5 (posición para el QS). </li><li> De pipeta 10 l de agua, control de ADN, o ADN de la muestra en el tubo capilar apropiado. Tape los tubos capilares utilizando la herramienta de nivelación. </li><li> Tome de refrigeración de bloque / muestras al instrumento de PCR en tiempo real. </li></ol></li><li> Programar el tiempo real de instrumentos PCR (véase la Tabla 1) </li><li> La amplificación y la detección realizada en el instrumento de PCR en tiempo real <ol><li> Inicie sesión en el ordenador </li><li> Doble clic en el icono de instrumento e iniciar sesión en el software. </li><li> Encienda el instrumento de PCR en tiempo real </li><li> Haga clic en &quot;CMV / EBV&quot; en la pantalla frontal. </li><li> Siga las instrucciones del asistente de macro. </li><li> Seleccione la casilla para ejecutar una auto-prueba cuando lo solicite el software. Un auto-prueba debe realizarse una vez al día el instrumento está en uso. </li><li> Nombre de la carrera. </li><li> Ajuste el recuento de muestras ubicado en el lef superiort esquina de la página a la suma de los controles y los pacientes incluidos en el período previo e introduzca el número de identificación de cada muestra. </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> En &quot;Tipo de muestra&quot;, asigne el tipo de muestra adecuado para el estándar. </li><li> Escriba las concentraciones esperadas para el estándar de cuantificación (QS). </li><li> Retire los tubos capilares del bloque refrigerador y colocarlos en la posición correspondiente en el carrusel (refrigeración del bloque de la muestra # 1 debe colocarse en la posición # 1 en el carrusel, etc.) </li><li> Coloque el carrusel en centrifugar y pulse inicio del instrumento. </li><li> Abra centrífuga y quitar el carrusel. </li><li> Coloque el carrusel en el instrumento de PCR en tiempo real. Cierre la tapa. </li><li> Pulse el botón &quot;Ejecutar&quot;. </li><li> El instrumento de PCR en tiempo real comprobará cada posición para una muestra. No te alejes del instrumento hasta que este control se ha completado, espetodo si uno de los capilares no es en el carrusel. El instrumento en cuenta esto y preguntar si la carrera se va a continuar. Conteste sí antes de salir. </li><li> Una vez que el plazo se haya completado, cierre el informe que se ha generado. </li><li> Haga clic en &quot;Absolute cuantificación&quot;. </li><li> Haga clic en la flecha situada junto a Color de Compensación. </li><li> Haga clic en &quot;Seleccionar color de Compensación&quot; en el cuadro desplegable. </li><li> Elija el archivo de compensación de color más actual para aplicar a la carrera. </li><li> Haga clic en Aceptar cuando la caja se abre. </li><li> Haga clic en la flecha de la curva estándar. </li><li> Seleccione &quot;uso externo&quot; en el menú desplegable. </li><li> Seleccione el archivo de curva estándar externa más reciente, haga clic en Aceptar. </li><li> Mire cada curva en el menú absoluta cuantificación para garantizar que las curvas están presentes y no la línea plana, si se asigna una concentración. La cuantificación absoluta para el 705/Back 530 se analiza de forma automática. </li></ol></li><li> QuControl alidad <ol><li> Generar una nueva curva estándar cada vez que se recibe un nuevo número de lote de reactivos, o cada seis meses, lo que es más frecuente. </li><li> Añadir 10 l de cada norma a la mezcla principal con Mg. Tenga en cuenta las normas que se incluyen con el kit como el ADN extraído previamente. </li><li> Añadir 1 l de control interno para cada estándar a la mezcla principal con Mg usado en la generación de la curva estándar con el fin de asegurar la cuantificación exacta. No agregue IC a la mezcla principal con Mg para el Control Template No (NTC). </li><li> Preparar una NTC y tres repeticiones de cuantificación Normas QS 4, 3, 2, 1, y una dilución 1:10 de QS4 para la ejecución para generar la curva estándar, con un total de 16 puntos de datos. </li><li> Seleccione &quot;reproduce las directrices&quot; en el menú desplegable para las normas repetidas </li><li> Elija el canal ninguno 530/back y encienda la compensación de color cuando se analiza la carrera, </li><li> En &quot;Curva Estándar (En ejecución)&quot;, seleccione &quot;guardar como exinterno &quot;y el nombre de la curva. Introduzca el comentario &quot;aplicado como curva estándar&quot; al guardar. </li><li> Representa gráficamente los resultados. El coeficiente de linealidad resultante debe ser ≥ 0,81. </li><li> Para tiradas diarias, incluya una copia de QS3 o QS4 como control en la carrera. La curva de corriente estándar externo se puede importar a la carrera durante la fase de análisis. </li><li> Ejecutar controles: sin control de ADN, control negativo, bajos, y controles positivos altos. Carga viral esperado se determina y se ajusta para cada proveedor y número de lote. </li><li> Añadir un IC a cada muestra y control durante la extracción de ADN. </li><li> Si cualquiera de los controles caen fuera de rango, registre los resultados inaceptables y referir el ensayo para la solución de problemas. </li></ol></li><li> Frecuencia de los controles <ol><li> Incluir en cada carrera: a NTC, positivo alto, y el nivel de control negativo, positivo bajo,. </li></ol></li></ol> NOTA: Los límites aceptables para los controles. Sin picos se deben observard para el sin plantilla (NTC) y controles negativos. Los picos deben estar presentes en el canal 530 y una carga viral esperados son determinados y ajustados para cada proveedor y el número de lote de los controles positivos bajos y altos.

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Muchos métodos de laboratorio están disponibles para el diagnóstico de la infección por citomegalovirus (CMV), incluyendo serología, el cultivo viral, los ensayos moleculares de viremia, la histología de las biopsias, y, como se ha demostrado recientemente, ensayos moleculares de fijado en formol (FFPE) biopsia incluido en parafina 5,6 tejido. Serología, una vez a la base del diagnóstico, sólo identifica fiablemente la exposición y no se correlaciona bien con la infección aguda por citomegalovirus 7. El cultivo viral, tanto convencional y principios de antígeno Shell Vial, se ve obstaculizada por largos tiempos de ensayo, en el mejor de 2-3 días en el caso de este último 8. Ensayos de viremia moleculares se han desarrollado, la mayoría tiene la ventaja de ser cuantitativa con el potencial de la eficacia del tratamiento de monitoreo 9-11. Por desgracia, cuando existe la preocupación clínica para la participación local del tracto gastrointestinal (GI), los ensayos de viremia reflejan afectación sistémica y no identifican específicamente la infección localizada. Por lo tanto, histology ha sido el estándar de oro para la identificación de la infección por CMV del tracto GI. Es crucial identificar infecciones activas CMV del tracto GI en pacientes inmunodeprimidos, como las personas con VIH / SIDA, en la quimioterapia, o de órganos / trasplantes de células madre, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Se informó de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) es un método altamente sensible y específico para detectar CMV en biopsias GI 5. Resultados similares han sido apoyados por otros estudios 6. Aunque todas las medidas a lo largo del procedimiento son importantes, hay algunos pasos críticos principales que merecen una consideración especial. Durante el procesamiento de tejido en el micrótomo, es imperativo la cuchilla puede cambiar entre cada muestra para reducir la posibilidad de contaminación cruzada entre las muestras. Del mismo modo, la descontaminación de áreas en el microtomo el tejido puede haber entrado en contacto con el uso de un REC limpiador adecuadoapruebe o recomiende el fabricante del micrótomo también reducirá este riesgo. Un paso clave adicional durante el protocolo es la adición del control interno IC (paso 2.3) a la muestra durante la extracción de ADN, que actúa como un control tanto para el proceso de extracción y amplificación. La amplificación y detección de la IC no interfieren con la amplificación del CMV, ya que la detección del virus de CMV se produce en el canal 530, mientras que la detección de la IC se produce en el canal 705. Cada laboratorio debe establecer un rango aceptable para el IC. Después de la extracción, no es necesario evaluar la calidad del ADN. En otras palabras, la determinación espectrofotométrica de la concentración de ADN no se realiza rutinariamente después del aislamiento de ADN. Si se añade antes de la extracción de ADN, la IC actúa como un control para el proceso de extracción. Alternativamente, 1 l de IC se pueden añadir a cada mezcla de reacción con Mg vial. Si se añade a la mezcla principal con Mg, el IC actúa sólo como una amplificación Control. También es imprescindible que durante la puesta a punto de todas las reacciones de qPCR que una campana limpia (incluyendo pipetas y puntas) se utiliza para el reactivo configurado. Esta campana no debe tener cualquiera de los productos de amplificación, es decir, puesto a tiempo real o PCR convencional, manipulados dentro de ella. Estos productos de amplificación podrían convertirse en aerosol y contaminar reacciones posteriormente preparados qPCR que conducen a resultados positivos falsos. Muchos laboratorios incluso van tan lejos como capuchas y equipos que designan para pipetear los reactivos que no son ácidos nucleicos y una segunda campana y equipos para la adición de muestras y el control de ácido nucleico. Cada laboratorio debe decidir lo que funciona mejor dadas sus limitaciones de espacio individuales. Solución de problemas de resultados inesperados, puede ser necesario durante el procedimiento. Si no hay pruebas de amplificación de la IC (es decir, la línea plana) de una muestra, se recomienda repetir primero la reacción de qPCR de la extracti ADN originalen para asegurar un error de pipeteado no ocurrió durante la preparación de la muestra de reacción. Si el CI se mantiene en una línea plana en la reacción de repetición y no hay suficiente tejido de la biopsia restante, una segunda extracción de ADN puede realizarse, siendo consciente para añadir el IC durante el proceso de extracción. Si este volvió a extraer la muestra también demuestra una línea plana IC, es probable que haya un inhibidor de la reacción presente en la muestra original. En este caso, el resultado de la prueba sería indeterminada para la detección de CMV desde el control de la reacción de qPCR no llevó a cabo apropiadamente. Si el agua, no hay control de destino (NTC) demuestra la amplificación de la diana, se recomienda primero analizar la tasa de positividad de la carrera. Si la carrera tiene una tasa superior a la positividad de lo normal, se recomienda realizar pruebas de frotis de las zonas donde se realiza cualquier manipulación de reactivos para identificar cualquier tipo de contaminación ambiental potencial. Si la contaminación ambiental se descarta, utilice uncontrol de agua recién inaugurado junto con los controles positivos habituales. Si el control del agua de reciente apertura no muestra un producto de amplificación, es probable que el control del agua anterior estaba contaminada con secuencia diana. Sin embargo, si este nuevo control de agua está contaminado de nuevo, se plantea la posibilidad de que alguno o todos los reactivos o capuchas están contaminados con secuencia diana. En este caso, sería mejor para descontaminar todas las campanas de extracción durante el proceso y después utilizar todos los nuevos reactivos en el funcionamiento de un nuevo conjunto de controles (positivo y el agua). Si el problema persiste, una reevaluación del flujo de trabajo en las áreas de procesamiento y capuchas, así como ponerse en contacto con los fabricantes de productos se debe hacer. Si los estándares de calidad (QS) incluidos en el plazo no demuestran el número de copias apropiado durante la amplificación, se recomienda ejecutar primero todo el QS (4, 3, 2, 1, y una dilución 1:10 de QS4). Si estas normas se encuentran dentro de los rangos adecuados, a continuación, repitalas muestras como anteriormente especificados con los controles apropiados. Si los QS no caen dentro de los rangos adecuados, a continuación, generar una nueva curva estándar como se describe en la sección de control de calidad del protocolo (3.4). Si el problema persiste, la generación de una nueva curva estándar con QS reciente apertura de la corriente o un número de lote nuevo se puede intentar. Si estos pasos no tienen éxito, ponerse en contacto con el fabricante estaría justificado. Aunque la sensibilidad y especificidad de qPCR para la detección de CMV en las biopsias GI basado en cálculos realizados utilizando métodos convencionales (H &amp; E e IHC) como el patrón oro no demuestran de inmediato una ventaja de diagnóstico, utilizando el método de qPCR analíticamente más sensibles como el patrón oro mejora en gran medida estos cálculos 5. Además, 14 (78%) de las 18 biopsias equívocos dio positivo por CMV por qPCR en este estudio. Se considera estos puntos apoyan la noción de que la qPCR es mucho más sensible que cualquiera de H &amp;E sola, o en combinación con IHC en la detección de CMV en material de biopsia GI. Además, en los casos con patrones de tinción IHC equívocos, es poco probable que sea de cualquier beneficio adicional la obtención de niveles adicionales en comparación con los métodos estándar actuales. Tomados en conjunto, qPCR es altamente sensible y específico para detectar la infección por CMV en tejido de biopsia de FFPE GI. Particularmente útil es la actuación de qPCR en biopsias gastrointestinales con patrones equívocos tinción IHC CMV o clínicamente muy sospechoso para el CMV. En comparación con la histología tradicional, las pruebas de qPCR de material de biopsia de GI puede facilitar un diagnóstico preciso en un corto período de tiempo, lo que conduce a una gestión más eficaz del paciente antes y.

Interpretación de la infección por citomegalovirus (CMV) en muestras clínicas es críticamente importante. CMV es un miembro de la subfamilia Betaherpesvirinae de herpesvirus. Al igual que otros virus de herpes, CMV tiene la capacidad de establecer una infección persistente o latente que se caracteriza por una falta de replicación viral activa 1. La reactivación del virus puede producirse en momentos de estrés o de otro tipo de inmunosupresión, lo que lleva a la replicación viral activa caracterizada por la liberación de viriones, que puede estar acompañado de manifestaciones de la enfermedad 2-4. Gastrointestinal (GI) los síntomas de la enfermedad por CMV con frecuencia incluyen dolor abdominal y / o heces con sangre 1. El diagnóstico de CMV gastroenteritis por histología utiliza hematoxilina y eosina (H &amp; E) para identificar inclusiones virales de CMV. En los casos en que es alto pero no se observan inclusiones obvias sospecha clínica, inmunohistoquímica (IHC) se utiliza con frecuencia como un método de prueba adjunto. Sin embargo, IHCtambién puede verse obstaculizada por los patrones raros no aparecen clásicos de tinción celular (ambiguas), lo que hace difícil la interpretación (Figura 2) 5. Se trató de utilizar ADN extraído de fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE) tejido de la biopsia GI y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para detectar CMV en biopsias GI. Esta técnica ha demostrado ser valiosa en la detección de CMV en biopsias GI, y es particularmente útil en los casos de tinción IHC equívocos 5,6. También, qPCR también se ha demostrado que se correlaciona bien con los datos de prueba de CMV clínico adicional cuando está disponible 6. El uso de qPCR para detectar CMV puede llevar a un diagnóstico precoz y el tratamiento en los casos en que la sospecha clínica para el CMV es alta, pero H &amp; E y CMV IHC son negativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

Es crucial para identificar la infección por citomegalovirus (CMV) en el tracto gastrointestinal (GI) de los pacientes inmunodeprimidos, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Muchos métodos de laboratorio para la detección de la infección por CMV se han desarrollado, incluyendo serología, el cultivo viral y métodos moleculares. A menudo, estos métodos reflejan afectación sistémica por CMV y no identifican específicamente la participación del tejido local. Por lo tanto, la detección de la infección por CMV en el tracto gastrointestinal se realiza con frecuencia por la histología tradicional de tejido de la biopsia. La tinción con hematoxilina y eosina (H &amp; E) en conjunción con técnicas de inmunohistoquímica (IHC) se han mantenido los pilares de examinar estas biopsias. H &amp; E e IHC veces resultan en (dudosos) patrones de tinción atípicos, lo que hace difícil la interpretación. Se demostró que la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para CMV con éxito se puede realizar en fijado en formol, tejido de biopsia incrustado en parafina (FFPE) de muyalta sensibilidad y especificidad. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo llevar a cabo las pruebas de qPCR para la detección de CMV en tejido de biopsia FFPE en un laboratorio clínico. Este método es probable que sea de gran beneficio para los pacientes en los casos de la aparición de manchas por CMV en biopsias GI.

Un total de 228 bloques de tejido fueron probados por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR), que se compone de 91 citomegalovirus (CMV) casos positivos sobre la base de la histología e inmunohistoquímica positiva (IHC), 18 con equívoca CMV IHC, y 79 controles negativos. Como se ilustra en la Figura 2, los casos de CMV positivos se han demostrado inclusiones típicas de CMV virales (A) y / o tinción IHC positivo (B). Casos dudosos se han demostrado patrones raros, no clásicas que aparecen tinción (C), mientras que los controles negativos hubieran mostrado ninguna histología sospechosa o IHC tinción 5. De 91 biopsias positivas para el CMV por histopatología, 88 fueron positivos por PCR cuantitativa (Tabla 2). Con una verdadera definición positiva basada en la histología tradicional, es decir, las inclusiones virales típicas de CMV y / o típico CMV IHC, estos datos resultaron en una sensibilidad del 96,7%. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; de 79 biopsias de control negativas (35 de colon normal, 25 colitis, duodenitis y 19), es decir, negativos para inclusiones virales y negativos por CMV IHC, 78 dieron negativo y positivo en la prueba 1 por qPCR, lo que resulta en una especificidad de 98,7%. Catorce de 18 (78%) biopsias con tinción IHC CMV equívoca dieron positivo para CMV por qPCR 5. Entre estos 18 casos dudosos, once tenían biopsias adicionales tomadas el mismo día en que fueron positivos para CMV por histopatología. Entre estas 14 muestras qPCR positivas, 10 tenían biopsias tomadas el mismo día en que fueron positivos para CMV en la histopatología. De las 18 biopsias equívocos ensayadas, 11 tenían información clínica adicional con respecto a las pruebas de CMV en otras muestras presentadas en o dentro de 7 días del momento de la biopsia fue tomada. Entre estos 11 casos, 8 (73%) dieron positivo para CMV por qPCR. De estos 11 biopsias, 5 (45%) dieron positivo por qPCR con muestras CMV positivos adicionales; 3 (27%) resultaron positive por qPCR sin muestras CMV positivos; 3 (27%) resultaron negativos por qPCR con muestras CMV negativos adicionales. Además de los estudios mencionados anteriormente, que era de interés para determinar si los niveles de obtención adicionales hematoxilina y eosina (H &amp; E) sería beneficiosa en los casos en que no hay inclusiones virales se ven en H &amp; E inicial y CMV IHC es equívoca. Por lo tanto, se realizaron H &amp; E niveles veces 5 para cada uno de los 18 bloques con equívoca CMV IHC. Dos patólogos examinaron detenidamente estos casos y no pudieron identificar inclusiones virales perceptibles en cualquiera de las diapositivas adicionales (datos no presentados). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="805"><tbody><tr><td colspan="7"> Parámetros de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real sugeridos </td></tr><tr><td colspan="7"> Lecturas de instalación: </td></tr><tr><td> Canal por defecto </td><td> Busque Temperatura </td><td> Max Seek Pos </td&gt; <td> Tipo de equipo </td><td> Capilar Tamaño </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 530 </td><td> 30 ° C </td><td> 12 </td><td> 6 canales </td><td> 20 l </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Nombre del programa: La activación de la enzima </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo de análisis: Ninguno </td></tr><tr><td> Objetivo ° C </td><td> Mantenga hh: mm: ss </td><td> Velocidad de rampa </td><td> Sec Target </td><td> Tamaño de paso </td><td> Paso de retardo </td><td> Modo de adquisición </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 0:10:00 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td colspan="7"> Nombre del programa: Aterrice paso </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 10 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo de análisis: Ninguno </td></tr><tr><td> Objetivo ° C </td><td> Mantenga hh: mm: ss </td><td> RAMp Cambio </td><td> Sec Target </td><td> Tamaño de paso </td><td> Paso de retardo </td><td> Modo de adquisición </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 0:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td> 65 </td><td> 0:00:20 </td><td> 20 </td><td> 55 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 0:00:15 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td colspan="7"> Nombre del programa: La amplificación del ADN </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 40 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo de análisis: Cuantificación </td></tr><tr><td> Objetivo ° C </td><td> Mantenga hh: mm: ss </td><td> Velocidad de rampa </td><td> Sec Target </td><td> Tamaño de paso </td><td> Paso de retardo </td><td> Modo de adquisición </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 0:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td> 55 </td><td> 0:00:20 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Solo </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 0:00:15 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td colspan="7"> Nombre del programa: Refrigeración </td></tr><tr><td colspan="7"> Número de ciclos: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> Modo de análisis: Ninguno </td></tr><tr><td> Objetivo ° C </td><td> Mantenga hh: mm: ss </td><td> Velocidad de rampa </td><td> Sec Target </td><td> Tamaño de paso </td><td> Paso de retardo </td><td> Modo de adquisición </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0:00:30 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> Ninguno </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los parámetros enumerados deben utilizarse como una guía para temperaturas objetivo, número de ciclos y la duración del ciclo en la puesta a punto de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la detección de cytomegalovi<html> rus en fijado en formol, biopsias gastrointestinales incluidos en parafina. Estos parámetros pueden requerir optimización, dependiendo del modelo y fabricante del instrumento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528"><tbody><tr><td> Histología casos positivos </td><td> Casos positivos de PCR </td><td> Sensibilidad </td><td> Histología casos negativos </td><td> PCR casos negativos </td><td> Specitivity </td></tr><tr><td> 91 </td><td> 88 </td><td> 96,7% </td><td> 79 </td><td> 78 </td><td> 98,7% </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Sensibilidad (96,7%) y especificidad (98,7%) de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) en la detección de citomegalovirus en fijado en formol, biopsias gastrointestinales incluidos en parafina. Este cuadro ha sido modificado de McCoy et al 5. es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 400 &quot;/&gt; Figura 1. Un microtomo típico con el bloque de tejido sentado correctamente en el cassette de abrazadera A) Como se corta una sección de espesor 10 micras de tejido de la biopsia se le permite rodar en un rollo B), que se transfiere a un tubo de microcentrífuga C). Todos los cinco rollos de tejido de la biopsia se colocan en un solo tubo de microcentrífuga para la extracción de ADN. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51570/51570fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. A) Hematoxilina y eosina sección teñida de una biopsia de colon que muestra abundantes, inclusiones típicas de CMV como se indica por las flechas (magnificación original 400X). B) Una biopsia de colon teñidas con un anticuerpo monoclonal contra el CMV que muestra el patrón esperado tinción IHC (original un aumento de 400x). <stRong&gt; C) Una biopsia de colon que muestra tinción IHC equívoca, con una sola de células pequeñas, débilmente manchados indicada por la flecha (magnificación original 400X). Esta cifra está siendo reimpreso con el permiso de McCoy et al 5.

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qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K vistas.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Video: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Detección por inmunofluorescencia de dos análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de Primaria

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Investigación

Biología

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

La detección de vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...