The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia &amp; Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).

1. إغلاق الفحص مدينة الثقافة الجرح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام 0.25٪ التربسين-EDTA حل. بيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية بواسطة الطرد المركزي، ونضح طاف، واعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة. لوحة العدد المناسب من الخلايا في لوحة 6 جيدا للالتقاء 100٪ في غضون 24 ساعة. ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى اختبارات لتحديد الوقت وعدد من الخلايا لتحقيق 100٪ التقاء بسبب نوع من الخلايا وحجم البئر وتستخدم (على سبيل المثال، هي المصنفة 1 × 10 6 خلايا سرطان الجلد B16F10 في بئر ل لوحة 6 جيدا قبل 24 ساعة من الجيل الجرح). بدلا من ذلك، يمكن استخدام 12 أو 24 جيدا جيدا لوحات. ملاحظة: إذا كان متوفرا، يمكن خلايا المصنف إلى إدراج الثقافة (من ibidi LLC) على التعامل مع الأنسجة لوحة الثقافة جعل الجرح قبل مسبوكة. A الثقافة إدراج يمكن حماية السطح من لوحة زراعة الأنسجة من التلف من قبل طرف ماصة. إذا تم استخدام الثقافة إدراج خطوة تجاهل1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) استخدام غيض ماصة 200 ميكرولتر للضغط بحزم ضد الجزء العلوي من لوحة زراعة الأنسجة وجعل بسرعة جرح رأسي إلى أسفل من خلال أحادي الطبقة الخلية. A مختلفة غيض ماصة الحجم يمكن استخدامها لجعل حجم الجرح الذي هو المطلوب. لا تستخدم القوة المفرطة ضد لوحة زراعة الأنسجة مع طرف ماصة لأنه قد يتلف السطح. إذا كان الجرح محمل مسبقا، قد يتم حذف هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية وسائل الإعلام والحطام الخلية. إضافة ببطء بما فيه الكفاية سائل الإعلام والثقافة ضد الجدار جيدا لتغطية قاع البئر وتجنب فصل خلايا إضافية. بعد جيل والتفتيش على الجرح ينبغي أن تؤخذ صورة الأولي. وضع لوحة زراعة الأنسجة في حاضنة وضعت في درجة حرارة مناسبة وأول أكسيد الكربون 2 تركيز (عادة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في عدة نقاط الوقت، مثل كل 3 ساعات، وإزالة لوحة من incubatأو وضعه تحت مجهر مقلوب لالتقاط صورة لقطة وللتحقق من إغلاق الجرح. إذا كان الوقت الفاصل بين المجهري هو متاح، التقاط صورة كل عدد X من دقيقة (تبدأ عادة مع كل 5 دقائق) لأي مدة زمنية في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 غرفة التحكم. اعتمادا على نوع من الخلايا، قد تختلف الجرح وقت الإغلاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل نتائج الصور لقطة، وقياس المسافة من جانب واحد من الجرح إلى أخرى باستخدام شريط مقياس. تحليل والحاضر بوضوح إغلاق الجرح مع مرور الوقت باستخدام مؤامرة مبعثر أو شريط الرسم البياني، مثل الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الصور الوقت الفاصل بين، استيراد الصور في البرنامج يماغيج (متاحة بحرية في http://rsb.info.nih.gov/ij/) لجعل الفيديو. للقيام بذلك يماغيج مفتوحة، انقر فوق ملف، استيراد، وتسلسل الصور. العثور على الملف مع الصور؛ انقر على الصورة الأولى في الملف. حفظ الفيديو عن طريق تحديد ملف، حفظ، وافي. ويمكن ملاحظة الخلايا المهاجرة واحد لشاراcterize حركة الاتجاه. وعلاوة على ذلك، والخصائص المورفولوجية مثل تشكيل أقدام صفاحية وراء حافة التراجع قد تدرس كذلك (الشكل 2 والفيديو التكميلية). </li></ol> 2. Transwell الهجرة الخليوي والغزو الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام غير الأنزيمية العازلة تفارق الخلية أو 0.25٪ التربسين-EDTA حل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي، ونضح وسائل الإعلام القائمة وترك الخلايا مكعبات. اعادة تعليق الخلايا في مصل سائل الإعلام والثقافة الحرة الخلية تحتوي على 0.1٪ BSA (ألبومين المصل البقري). ملاحظة: اعتمادا على خط الخلية التي يجري التحقيق 0.25٪ التربسين EDTA-قد تؤثر الهجرة الخلية والغزو بسبب الانقسام من المستقبلات المختلفة على سطح الخلية 17. ملاحظة: عدد الخلايا لكل مل يعتمد على حجم الخلايا. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات للعثور على كثافة البذر التي محترفينفيديس على أفضل النتائج. عادة 1 × 10 6 خلية / مل هو نقطة انطلاق جيدة لمعظم أنواع الخلايا عند استخدام جيدا 24 transwell إدراج. هناك مجموعة واسعة من الأحجام transwell إدراج وينبغي تعديل عدد الخلايا المضافة لوفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 100 ميكرولتر من محلول الخلية على الجزء العلوي من الغشاء المرشح في إدراج transwell واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للسماح للخلايا ليستقر. ملاحظة: حجم المسام معينة من الغشاء transwell المستخدمة تعتمد على حجم الفردية من الخلايا في العينة. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا صغيرة جدا فإنها قد تمر من خلال المسام دون الحاجة إلى تسهيل الهجرة أو إذا كانت كبيرة جدا فإنها قد لا تناسب من خلال المسام. وهناك العديد من إدراج transwell مع أحجام المسام التي تتراوح من 3 ميكرون، 5 ميكرون، و 8 ميكرومتر لفحوصات الهجرة الخلية. تتوفر تجاريا على إدراج transwell من شركات مثل كورنينج. ملاحظة: transwell مigration مقايسة يمكن تعديلها بسهولة لإجراء فحص غزو الخلية. للقيام بذلك، قم بإضافة المصفوفة خارج الخلية (ECM) مواد على رأس الغشاء transwell ثم قم بإضافة خلايا على رأس ECM. على سبيل المثال، يتم إذابة Matrigel ومسالة على الجليد، ومن ثم يتم إضافة 30-50 ميكرولتر من Matrigel إلى جيدا 24 transwell إدراج وعزز في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة لتشكيل طبقة رقيقة هلام. يضاف حل الخلية على رأس طلاء Matrigel لمحاكاة الغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية. ملاحظة: هناك اختلافات واضحة بين الهجرة الخلية transwell والمقايسات غزو الخلايا transwell. يقيس الفحص الهجرة الخلية transwell القدرة الكيميائي للخلايا نحو الكيماوي جاذبة. مقايسة غزو الخلايا transwell، ومع ذلك، يقيس كلا الكيميائي خلية وغزو الخلايا من خلال المصفوفة خارج الخلية، وهي العملية التي توجد عادة في الانبثاث السرطان أو التطور الجنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، caref جدامع ully إضافة 600 ميكرولتر من المطلوب الكيماوي جاذبة في الجزء السفلي من مجلس النواب في 24 لوحة جيدا. إضافة الكيماوي جاذبة دون تحريك إدراج transwell وتجنب توليد فقاعات. تأكد من أن السائل الكيماوي جاذبة في البئر أسفل يجعل الاتصال مع الغشاء في البئر العليا لتشكيل التدرج الكيميائي. فترة حضانة تعتمد على نوع من الخلايا والكيماوي جاذبة المستخدمة. ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات لتحديد فترة الحضانة. ملاحظة: للحصول على الخلايا الملتصقة، فإن الخلايا هاجر نعلق على الجانب الآخر من الغشاء 1،8. الكمي من الخلايا هاجر لا يمكن أن يؤديها التالية الخطوات 2،4-2،8 (الخطوات 2،4-2،8 لا تحتاج إلى أن يؤديها في بيئة معقمة). لخلايا غير ملتصقة، فإن الخلايا هاجر تسقط في وسائل الاعلام في مجلس النواب. يمكن الاعتماد على عدد من الخلايا باستخدام عدادة الكريات هاجروا أو تدفق عداد الكريات 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة إدراج transwell من لوحة. استخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس عدة مرات حسب الحاجة لإزالة بعناية وسائل الإعلام والخلايا المتبقية التي لم هاجروا من الجزء العلوي من الغشاء دون الإضرار بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600-1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في بئر من 24 لوحة جيدا. وضع إدراج transwell في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة للسماح التثبيت الخلية. إزالة transwell إدراج من 24 لوحة جيدا واستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس لإزالة الإيثانول المتبقية من الجزء العلوي من الغشاء. يسمح الغشاء transwell لتجف (عادة 10-15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600-1،000 ميكرولتر من 0.2٪ الكريستال البنفسجي في بئر من 24 لوحة جيدا ووضع الغشاء في ذلك لتلطيخ. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة البنفسجي الكريستال من أعلى الغشاء مع طرف ماصة أو القطن يميل قضيب. بعناية فائقة، لتجنب غسل قبالة خلايا ثابتة، وتراجع الغشاء إلى الماء المقطر عدة مرات حسب الحاجة لإزالة الزائدة الكريستال violeر. يسمح الغشاء transwell لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض تحت مجهر مقلوب وحساب عدد الخلايا في مختلف المجالات من أجل الحصول على متوسط ​​مجموع الخلايا التي هاجروا عبر الغشاء تجاه الكيماوي جاذبة وتعلق على الجانب السفلي من الغشاء (الشكل 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor.">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+to+apoptotic+&amp;#34;find-me&amp;#34;+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A.">Migration to apoptotic &amp;#34;find-me&amp;#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li><li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor.">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li><li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration.">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li><li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis.">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li><li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A.">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li><li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2+.">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li><li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms.">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+determinants+of+metastasis.">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li><li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+cancer.">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells.">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li><li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis.">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li><li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+new+insights+into+cancer-related+inflammation.">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li><li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li><li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration.">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الهجرة الخلية هو أحد الجوانب الهامة للدراسة في أبحاث السرطان، ويمكن أيضا أن تطبق على النمو، والجرح الدراسات المناعية الشفاء. ثقافة الخلية الجرح إغلاق الفحص والكشف عن الهجرة الخلية transwell والغزو المقايسات معلومات مفصلة من السلوكيات الخلايا المهاجرة، ويمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الجزيئية للهجرة الخلية 1،2،10،14. استخدمت دراستنا هذه المقايسات حركية الخلية لتحديد سرعة الهجرة والغزو قدرات خط خلية سرطان الجلد B16F10. يدرس إغلاق فحص الجرح خلية قدرة خط خلية معينة للهجرة، وبعد ذلك يغلق الجرح المحرز في لوحة متموجة من الخلايا. هذا الاختبار هو للوصول للغاية للمجموعات مع المعدات الأساسية وبالمقارنة مع الأساليب القائمة هو طريقة بسيطة لقياس الهجرة الخلية. بعض الاختلاف في مقايسة إغلاق الجرح قد تكون موجودة في مجموعات العلاج الفردية ولكن هناك العديد من الخطوات التي أماهذ اتخاذها ليساعد في تخفيف ذلك. أسلوب واحد المحتملة للحد من الاختلاف هو لوحة لكل عينة مع نفس العدد من الخلايا لتحقيق التقاء متزامن والحفاظ على حالة الخلايا السليمة في بدء كل تجربة. قد تكون هناك حاجة إلى عدة محاكمات تجارب زراعة الخلايا لتحديد عدد الطلاء بالضبط ما هو مطلوب لتحقيق التقاء الثوابت وحالة الخلايا السليمة بين عينات المستقلة. علاوة على ذلك، زيادة حجم العينة سوف يقلل أيضا من الاختلاف. لبطء خطوط الخلايا المهاجرة التي تتطلب أكثر من 24 ساعة فترة حضانة لمراقبة هجرة كبيرة، وأنها مريحة لاستخدام aphidicolin أو غيرها المانع لمنع انتشار التغييرات عدد الخلايا التي يمكن أن تؤثر على نتائج الفحص. بعد اتقان القدرة على دراسة سرعة الهجرة الخلية باستخدام مقايسة إغلاق الجرح الخليوي، وتقييم مفصل للخلية السلوكيات المهاجرة واحد ويمكن أيضا إنجاز 14. وعلاوة على ذلك، وبعد WOUالثانية الخلايا مقايسة إغلاق قد تكون ثابتة ومختلف البروتينات المشاركة مع هيكل هيكل الخلية وديناميكية يمكن الاطلاع وتقييمها باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية 2. قد يؤدي هذا التحليل إلى مزيد من التعديلات مفصلة البيوكيميائية لم تكن معروفة سابقا. إغلاق الجرح فحص الخلية هي أيضا قابلة للغاية في الوقت الحقيقي التصوير الخلية الحية لدراسة ديناميات الهجرة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري مضان. على سبيل المثال، الأكتين-GFP، تويولين-GFP، وpaxillin-GFP البروتينات الانصهار قد أعرب في الخلايا الحية لعرض توطين البروتينات في نقاط زمنية مختلفة في الهجرة الخلية أو التصاق 18،19. وتشمل بعض القيود للمقايسة إغلاق الجرح الذي، على سبيل المثال، فإنه ليست مناسبة للخلايا غير ملتصقة ولا قياس الكيميائي الخلية. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلايا لديهم ميل لفصل من لوحة على الفور بعد إجراء الجرح (مثل الخلايا HEK293T). بالنسبة لأولئك خطوط الخلايا، فمن الأفضل استخدام لوحات الجرح محمل مسبقا أو transwالذراع فحص الهجرة مناقشتها أدناه. هجرة الخلايا transwell والغزو الفحص يوفر تحليل دقيق للقدرة الخلايا على الإحساس معين الكيماوي جاذبة والهجرة من خلال حاجز مادي تجاهها. هذا الاختبار يمكن استخدام مزيد من التحقيق في غزو الخلايا عن طريق إضافة طبقة من المصفوفة خارج الخلية أو طبقة من الخلايا البطانية على رأس الغشاء transwell لتقليد عملية الغزو ECM والتسرب 1،10. بالإضافة إلى ذلك، في أعقاب الغزو من خلال Matrigel، وتلطيخ المناعية من البروتينات في تركيبة هيكل الخلية مع مضان المجهري قد تكون ذات قيمة لدراسة المورفولوجية خلال غزو 3-D. وجود قيود على استخدام مقايسة غزو الخلايا transwell هو أن البيانات في الوقت الفاصل بين غزو الخلايا من الصعب تحقيق مع المجهري التقليدية ويعيش التصوير خلية من هذه العملية معقدة. للحصول على نتائج دقيقة، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال هيئة تنظيم الاتصالاتnswell الهجرة الخلية والغزو المقايسات التي هي ذات أهمية. أولا، لأن سرعة الهجرة الخلية قد تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع مختلفة من الخلايا يجب إجراء العديد من التجارب الأولية على اعتماد إطار زمني محدد الهجرة التي سيتم استخدامها في الإجراء. الثانية، يجب أيضا أن تكون الكيماوي جاذبة تنطبق على نوع من الخلايا في المصالح. وينبغي دراسة مجموعة واسعة من الكيماوي جاذبة في التجارب السابقة قبل قياس الهجرة النهائية والقدرة غزو من نوع خلية معينة. ويشيع استخدام الخلايا الليفية المتوسطة مكيفة باعتبارها الكيماوي جاذبة قوية لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا. إذا تم استخدام واحد المنقى الكيماوي جاذبة تأكد من أن يتم التعبير عن مستقبلات للالكيماوي جاذبة في نوع من الخلايا في المصالح. أخيرا، للمقايسة غزو الخلايا تأكد من طلاء Matrigel أو غيرها من المصفوفة خارج الخلية متجانسة من أجل تقليل التباين التجريبية. في الختام، وإن كانت هناك بعض القيود، وغايةالوصول المقايسات الهجرة الخلية الموصوفة هنا هي مفيدة لمجموعة واسعة من الدراسات البيولوجية.

حركية هو سمة أساسية من سمات الخلايا الحية. وتشارك الهجرة خلية في مفهوم الحياة، والتطور الجنيني، الاستجابة المناعية، والعديد من العمليات المرضية مثل السرطان والتهاب ثانوي لورم خبيث 1-9. وبالتالي، وأساليب لدراسة الخلية السلوك المهاجرة هي أدوات البحث مفيد جدا لمجموعة واسعة من التخصصات في العلوم الطبية الحيوية، وعلم الأحياء، والهندسة الحيوية، والمجالات ذات الصلة. دراسة الهجرة الخلية في أبحاث السرطان هو من مصلحة خاصة فيما يرتبط السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان لتطور النقيلي. من أجل السرطانية تنتشر وتنشر في جميع أنحاء الجسم، يجب أن تهاجر الخلايا السرطانية وغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM)، intravasate في الدورة الدموية، ونعلق على موقع بعيد، وأخيرا يتسرب إلى تشكيل بؤر بعيدة 1،10-12. لذا يمكن استخدام الأساليب البيولوجية المختلفة لدراسة هذه الأحداث بالتفصيل. ثقافة الخلية جرح إغلاق لوتستخدم على نطاق واسع د هجرة transwell والمقايسات الغزو في الأوساط العلمية 1،10. هذه الاختبارات يمكن أن توفر البيانات اللازمة التي قد تسمح لفهم مدى نوع خلية معينة يمكن ترحيل من تلقاء أنفسهم أو الرد على الكيماوي جاذبة وتهاجر إتجاهي نحو ذلك. وقد وصفت العديد من الظواهر المهاجرة. قد تهاجر الخلايا في شكل خلية واحدة من هذا القبيل كما رأينا في الوسيطة أو حركة تشبه حركة أميبية أو متعددة الخلايا وصفت الهجرة الجماعية أو خلية تدفق 13. طريقة الحركة المستخدمة في خلايا متحركة يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام زراعة الخلايا إغلاق الجرح الفحص. من بين العديد من الطرق لدراسة الهجرة الخلية، الجرح خلية إغلاق الفحص هو واحد من أبسط. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد القدرة هجرة الجماهير خلية كاملة. عندما اتخذت خطوة أخرى يمكن استخدامها لمراقبة الخصائص المورفولوجية خلية الفرد أثناء الترحيل 14. بعد تحليل إغلاق الجرح قد كشفت العديد من الظواهر. قياس المسافة المغلقة مع مرور الوقت عند مقارنة إلى عنصر تحكم قد تكشف عن تغييرات محددة الهجرة أو النمط الظاهري المهاجرة ضعاف التي لم تكن معروفة سابقا. علاوة على ذلك، تشكيل واحد قدم صفاحية خلية، وذيل سحب، وحركة الاتجاه قد تعطي مؤشرات لما قد تنخفض قيمتها أو محسنة في خلايا الفائدة 14. هجرة transwell والمقايسات الغزو يمكن أن تستخدم لتحليل قدرة الخلايا واحد للرد إتجاهي لمختلف الكيماوي جاذبة سواء كانوا كيموكينات، عوامل النمو، والدهون، أو النيوكليوتيدات 4،5،8،15،16. كما أنه قد تقييم قدرة المهاجرة الفرق بسبب الإفراط في التعبير عن مستقبلات 1،14. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقايسات لتحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين للهجرة الخلية مثل الأسرة رو من GTPases الصغيرة 2. بعد هذه قصيرة وبسهولة القويمكن أيضا تحديد اختبارات إيصال خدمات الإيداع، ووضع الهجرة الخلية، وقدرة الخلية لغزو في مصفوفة 3-D.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>Dissolved in water at 0.2%</td></tr><tr><td>Cell disassociation buffer</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>SterilGARD biosafety hood</td><td>The Baker Company, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Model # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl inverted microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Tissue culture plate</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Catalog number varies depending on the type of culture plate</td></tr><tr><td>Corning Transwell insert</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Catalog number varies depending on the pore size of the membrane</td></tr></tbody></table>

in vitro cell migration and invasion assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

أجريت إغلاق فحص الجرح وفحص الهجرة الخلية transwell المقدمة هنا باستخدام خلايا فأر B16F10 سرطان الجلد كنظام نموذج. في مقايسة إغلاق الجرح، وكانت المصنفة B16F10 الخلايا في 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة ونمت إلى 100٪ التقاء في غضون 24 ساعة. ولدت وجرح ما يقرب من 700 ميكرون واسع باستخدام طرف ماصة وإغلاق الجرح (الهجرة الخلية) تم تسجيلها باستخدام المجهر مرور الزمن. بدلا من ذلك، يمكن أيضا إغلاق الجرح دراستها من قبل التقاط الصور لقطة في نقاط زمنية مختلفة إذا كان الوقت الفاصل بين المجهري غير متوفرة 1. يتم عرض أربع صور من المسلسل في الوقت الفاصل بين 0، 4، 8، ونقاط زمنية لمدة 12 ساعة في الشكل 1. وبناء على عرض من الجرح، حسبنا المسافة الهجرة وسرعة الهجرة الخلية في 40.42 ميكرون / ساعة (الشكل 1B). تم تجميع الصور الوقت الفاصل بين أيضا في الفيديو باستخدام برنامج يماغيج (انظر الفيديو التكميلية). اليمكن دراستها ه عملية الهجرة الخلية الحيوية. كما هو مبين في الشكل 2، ومورفولوجيا الخلايا المهاجرة مع أقدام صفاحية (الرائدة) وذيول (حافة زائدة) لوحظت بشكل واضح. في مقايسة transwell الهجرة الخلية، استخدمت إدراج 24 جيدا من كورنينج. B16F10 خلايا سرطان الجلد وإعادة علقت في تركيز 1 × 10 6 خلية / مل في المخزن المؤقت الهجرة تتألف من DMEM المتوسطة و 0.1٪ BSA دون المصل. واستخدمت وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا الليفية NIH3T3 نمت في DMEM المتوسط ​​تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني باسم الكيماوي جاذبة. تمت إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا B16F10 على رأس الغشاء transwell في مجلس الشيوخ و 600 ميكرولتر من الكيماوي جاذبة وأضيف إلى انخفاض الغرفة أو نفس حجم المخزن المؤقت الهجرة أضاف كعنصر تحكم السلبية. تم إجراء الهجرة الخلية كما هو موضح في الإجراء. يمكن أن يكون كميا عدد الخلايا هاجروا عن طريق عد تحت المجهر أو فيالصور التي التقطت (الشكل 3B). كما هو مبين في الشكل (3)، كانت هناك زيادة 15 أضعاف في الخلايا المهاجرة نحو الكيماوي جاذبة بالمقارنة مع الرقابة المخزن المؤقت الهجرة (الشكل 3C). ويدرس الفحص الكيميائي transwell الخلية، والهجرة الخلية الاتجاه نحو الكيماوي جاذبة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/51046/51046fig1highres.jpg" /> الشكل 1. B16F10 خلية سرطان الجلد إغلاق الجرح الفحص. (A) خلال 16 ساعة إغلاق الجرح فحص الصور أخذت كل 5 دقائق باستخدام المجهر مرور الزمن. وتظهر الصور ممثل في 0، 4، 8، و 12 ساعة ويتم إضافة أشرطة النطاق (400 ميكرون) لقياس عرض الجرح. (B) وقد تم قياس مسافة الجرح في ميكرون. تم استخدام مؤامرة مبعثر لعرض عرض الجرح مع مرور الوقت وحساب معدل إغلاق الجرح. لجينمعدل ص 2 القيمة، تم تشغيل الانحدار الخطي على بيانات العرض الجرح باستخدام برنامج GraphPad بريزم (الإصدار 5.0، GraphPad البرمجيات، وشركة). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51046/51046fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/51046/51046fig2highres.jpg" /> الشكل 2. اتخذت مورفولوجية المهاجرة B16F10 الخلايا من الوقت الفاصل بين المجهري للمقايسة إغلاق الجرح. خلال 16 ساعة إغلاق الجرح الصور الفحص كل 5 دقائق. تم تجميع جميع الصور في الفيديو باستخدام برنامج يماغيج (5 إطارات / ثانية). ولوحظ الهجرة الخلية التي تنطوي على الاستقطاب الخلية، والإرشاد أقدام صفاحية، وزائدة حافة التراجع. وعرضت صور من 34.6، 36.6 نقطة، والوقت 38.6 ثانية من الفيديو (الفيديو في الوقت المقابلة لمرور الزمن وقت الهجرة الفعلية (ساعة: دقيقة: ثانية) 34.6 ثانية، 14:20:00؛ 36.6 ثانية، 15:10:00؛ و38.6 ثانية، 16:00:00، على التوالي). شريط النطاق 50 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51046/51046fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/51046/51046fig3highres.jpg" /> الرقم 3. Transwell فحص هجرة B16F10 خلايا سرطان الجلد (أ) رسم تخطيطي لجهاز إدراج transwell المستخدمة لقياس الهجرة الخلية والغزو. (B) صور ممثل B16F10 transwell الخلية الهجرة. أضيفت عازلة الهجرة الخلية والخلية NIH3T3 مكيفة المتوسطة لمجلس النواب باعتباره السيطرة السلبية والكيماوي جاذبة، على التوالي. بعد الهجرة الخلية وتلطيخ مع الكريستال البنفسجي كما هو موضح في الإجراءات، اتخذت صورا للخلايا هاجر (الملون الأرجواني) باستخدام ميكرoscope مع الهدف 10X (مجموع التكبير 100X). ويمكن أيضا ملاحظتها مسام الأغشية بوصفها صغيرة، مستديرة والظلام العديد من النقاط الملونة في الصورة. (C) الكمي من الخلايا المهاجرة نحو المخزن المؤقت الهجرة أو الكيماوي جاذبة (متوسط ​​5 حقول صور في مجموعه 100X التكبير). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51046/51046fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> تكميلية فيديو. الفيديو الوقت الفاصل بين خلية سرطان الجلد B16F10 الجرح فحص الإغلاق. تم التقاط الصور كل 5 دقائق لمدة 16 ساعة لتوليد 193 الصور. تم تجميع جميع الصور في الفيديو باستخدام برنامج يماغيج (5 إطارات / ثانية). راجع &quot;Supplementary_Video_JOVE.avi&quot; ملف التكميلية تحت التحميل.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Cell Migration and Invasion Assays at JoVE.com

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

137.6K Views.  East Carolina University.  تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا. 

Video: In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

تقييم البطانية هجرة الخلايا بعد التعرض للمواد الكيميائية السامة

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Developmental Biology

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

تقييم عملية الهجرة وغزو الخلية: مقارنة من الصفر فيديو المستندة إلى مجهر الجرح المقايسة والمقايسة الدائرة Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

سير عمل بسيطة هجرة/غزو تصوير خلية يعيش الآلي باستخدام

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genetics

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

في المختبر فحوصات تقييم الهجرة، والغزو، وانتشار خطوط الخلايا مخلدة تروفوبلست البشرية في الاثلوث الأول

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Medicine

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

القياس الكمي في الوقت الحقيقي لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها بعد نقل mRNA الاصطناعي

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

رواية في المختبر الجرح المقايسة الشفاء لتقييم الهجرة الخلية

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...